Optogenetisk hämning av rho1-medierad aktomyosinkontraktilitet i kombination med mätning av epitelspänning i Drosophila-embryon

Summary

Actomyosinkontraktilitet spelar en viktig roll i cell- och vävnadsmorfogenesen. Det är dock utmanande att manipulera aktomyosinkontraktiliteten in vivo akut. Detta protokoll beskriver ett optogenetiskt system som snabbt hämmar Rho1-medierad aktomyosinkontraktilitet i Drosophila-embryon , vilket avslöjar den omedelbara förlusten av epitelspänning efter inaktivering av aktomyosin in vivo.

Abstract

Kontraktila krafter som genereras av aktin och icke-muskelmyosin II (“aktomyosinkontraktilitet”) är avgörande för morfologiska förändringar av celler och vävnader på flera längdskalor, såsom celldelning, cellmigration, epitelveckning och förgrenad morfogenes. En djupgående förståelse av aktomyosinkontraktilitetens roll i morfogenesen kräver metoder som möjliggör snabb inaktivering av aktomyosin, vilket är svårt att uppnå med konventionella genetiska eller farmakologiska metoder. Det presenterade protokollet demonstrerar användningen av ett CRY2-CIBN-baserat optogenetiskt dimeriseringssystem, Opto-Rho1DN, för att hämma aktomyosinkontraktilitet i Drosophila-embryon med exakta tidsmässiga och rumsliga kontroller. I detta system är CRY2 sammansmält med den dominerande negativa formen av Rho1 (Rho1DN), medan CIBN är förankrat i plasmamembranet. Blåljusmedierad dimerisering av CRY2 och CIBN resulterar i snabb translokation av Rho1DN från cytoplasman till plasmamembranet, där det inaktiverar aktomyosin genom att hämma endogent Rho1. Dessutom presenterar denna artikel ett detaljerat protokoll för koppling av Opto-Rho1DN-medierad inaktivering av aktomyosin med laserablation för att undersöka aktomyosinets roll i att generera epitelspänning under bildning av Drosophila ventrala fåror. Detta protokoll kan tillämpas på många andra morfologiska processer som involverar aktomyosinkontraktilitet i Drosophila-embryon med minimala modifieringar. Sammantaget är detta optogenetiska verktyg ett kraftfullt tillvägagångssätt för att dissekera funktionen av aktomyosinkontraktilitet för att kontrollera vävnadsmekanik under dynamisk vävnadsremodellering.

Introduction

Actomyosinkontraktilitet, den sammandragande kraft som utövas av icke-muskelmyosin II (hädanefter myosin) på F-aktinnätverket, är en av de viktigaste krafterna för att ändra cellform och driva morfogenes på vävnadsnivå ^1,2. Till exempel resulterar aktiveringen av aktomyosinkontraktilitet vid epitelcellernas apikala domän i apikal sammandragning, vilket underlättar en mängd olika morfogenetiska processer, inklusive epitelveckning, cellextrudering, delaminering och sårläkning 3,4,5,6,7 . Aktiveringen av myosin kräver fosforylering av dess regulatoriska ljuskedja. Denna modifiering lindrar den hämmande konformationen av myosinmolekylerna, vilket gör att de kan bilda bipolära myosinfilamentbuntar med flera huvuddomäner i båda ändar. De bipolära myosinfilamenten driver den antiparallella rörelsen av aktinfilament och resulterar i generering av kontraktil kraft ^1,8,9.

Den evolutionärt bevarade Rho-familjens små GTPas RhoA (Rho1 hos Drosophila) spelar en central roll i aktiveringen av aktomyosinkontraktilitet i olika cellulära sammanhang^10,11. Rho1 fungerar som en bimolekylär omkopplare genom att binda antingen GTP (aktiv form) eller GDP (inaktiv form)¹². Cyklingen mellan GTP- eller GDP-bundet Rho1 regleras av dess GTPasaktiverande proteiner (GAPs) och guaninnukleotidutbytesfaktorer (GEFs)¹³. GEFs funktion är att underlätta utbytet av BNP mot GTP och på så sätt aktivera Rho1-aktiviteten. GAPs, å andra sidan, förbättrar GTPas-aktiviteten hos Rho1 och inaktiverar därmed Rho1. Aktiverad Rho1 främjar aktomyosinkontraktilitet genom att interagera med och aktivera dess nedströms effektorer, Rho-associerat kinas (Rok) och Diaphanous¹⁴. Rok inducerar myosinaktivering och aktomyosinkontraktilitet genom fosforylering av den regulatoriska lätta kedjan av myosin¹⁵. Dessutom hämmar Rok också myosinregulatoriskt lättkedjigt fosfatas och främjar därmed ytterligare myosinfilamentmontering¹⁶. Rok kan också fosforylera LIM-kinaser, som, när de aktiveras, förhindrar aktindemontering genom att fosforylera och hämma aktin-depolymerisationsfaktorn cofilin^17,18. Diaphanous är en forminfamilj aktinkärnbildare som främjar aktinpolymerisation, vilket ger en bas för myosin att interagera med 19,20,21.

Även om de cellulära mekanismerna som aktiverar aktomyosinkontraktilitet har klarlagts väl, är vår förståelse av dess funktion för att reglera dynamisk vävnadsremodellering fortfarande ofullständig. För att fylla denna kunskapslucka krävs metoder som snabbt kan inaktivera aktomyosin i specifika vävnadsregioner in vivo och registrera den omedelbara effekten på vävnadens beteende och egenskaper. Detta protokoll beskriver användningen av ett optogenetiskt tillvägagångssätt för att akut hämma aktomyosinkontraktilitet under Drosophila mesoderm-invagination, följt av mätning av epitelspänning med hjälp av laserablation. Under Drosophila-gastrulation genomgår de ventralt lokaliserade mesodermprekursorcellerna apikal sammandragning och invaginaterar från embryots yta genom att bilda en främre-posteriort orienterad fåra^22,23. Bildandet av ventrala fåror har länge använts som modell för att studera mekanismen för epitelveckning. Bildandet av ventrala fåror administreras av det dorsal-ventrala mönstringssystemet hos Drosophila^24,25,26,27. Uttrycket av två transkriptionsfaktorer, Twist och Snigel, som ligger på den ventrala sidan av embryot, styr bildandet av ventrala fåror och specificerar mesodermala cellers öde²⁸. Twist and Snail aktiverar rekryteringen av Rho1 GEF RhoGEF2 till toppen av mesodermprekursorcellerna via en G-proteinkopplad receptorväg och ett RhoGEF2-adapterprotein, T48 29,30,31,32,33. Därefter aktiverar RhoGEF2 myosin i hela den apikala ytan av den potentiella mesodermen genom Rho-Rho-kinasvägen ^{34,35,36,37,38,39}. Aktiverad myosin bildar ett supracellulärt aktomyosinnätverk genom hela den apikala ytan av mesoderm primordium, vars sammandragningar driver apikal sammandragning och resulterar i en snabb ökning av apikal vävnadsspänning 14,37,40.

Det optogenetiska verktyget som beskrivs i detta protokoll, Opto-Rho1DN, hämmar aktomyosinkontraktilitet genom blåljusberoende plasmamembranrekrytering av en dominant negativ form av Rho1 (Rho1DN)⁴¹. En T19N-mutation i Rho1DN eliminerar det muterade proteinets förmåga att utbyta GDP mot GTP och gör därmed proteinet ständigt^inaktivt. En efterföljande mutation i Rho1DN, C189Y, eliminerar dess naiva membranmålsignal^42,43. När Rho1DN infunderas till plasmamembranet binder det till och uppdämmer Rho1 GEFs, vilket blockerar aktiveringen av Rho1 samt Rho1-medierad aktivering av myosin och aktin^34,44. Plasmamembranrekryteringen av Rho1DN uppnås genom en ljusberoende dimeriseringsmodul härledd från Cryptochrome 2 och dess bindningspartner CIB1. Kryptokrom 2 är en blåljusaktiverad kryptokromfotoreceptor i Arabidopsis thaliana⁴⁵. Kryptokrom 2 binder till CIB1, ett basiskt helix-loop-helix-protein, endast i sitt fotoexciterade tillstånd⁴⁵. Det visade sig senare att den bevarade N-terminalen, fotolyashimologiregionen (PHR), från kryptokrom 2 (CRY2_PHR, hädanefter kallad CRY2) och den N-terminala domänen (aa 1-170) av CIB1 (hädanefter CIBN) är viktiga för ljusinducerad dimerisering⁴⁶. Opto-Rho1DN innehåller två komponenter. Den första komponenten är CIBN-proteinet sammansmält med ett CAAX-ankare, som lokaliserar proteinet till plasmamembranet⁴⁷. Den andra komponenten är mCherry-märkt CRY2 smält med Rho1DN⁴¹. I frånvaro av blått ljus stannar CRY2-Rho1DN kvar i cytoplasman. Vid stimulering av blått ljus riktas CRY2-Rho1DN mot plasmamembranet genom interaktionen mellan membranförankrad CIBN och exciterad CRY2. Opto-Rho1DN kan aktiveras av ultraviolett A (UVA) ljus och blått ljus (400-500 nm, toppaktivering vid 450-488 nm), eller av en 830-980 nm pulsad laser vid utförande av tvåfotonstimulering^41,46,47,48. Därför stimuleras Opto-Rho1DN av våglängder som normalt används för exciterande GFP (488 nm för enfotonavbildning och 920 nm för tvåfotonavbildning). Våglängder som vanligtvis används för exciterande mCherry (561 nm för enkelfotonavbildning och 1 040 nm för tvåfotonavbildning) stimulerar däremot inte den optogenetiska modulen och kan därför användas för prestimuleringsavbildning. Protokollet beskriver de tillvägagångssätt som används för att minimera risken för oönskad stimulering under provmanipulation.

Laserablation har använts i stor utsträckning för att upptäcka och mäta spänningar i celler och vävnader⁴⁹. Tidigare studier har visat att, när laserintensiteten kontrolleras på lämpligt sätt, kan tvåfotonlaserablation med användning av en femtosekunds nära-infraröd laser fysiskt försämra vissa subcellulära strukturer (t.ex. kortikala aktomyosinnätverk) utan att orsaka plasmamembranrapture^50,51. Om vävnaden är under spänning resulterar laserablation av ett intresseområde i vävnaden i en omedelbar utåtriktad rekyl av cellerna intill det ablerade området. Rekylhastigheten är en funktion av storleken på spänningen och viskositeten hos mediet (cytoplasman) som omger strukturerna som genomgår rekyl⁴⁹. På grund av det överlägsna penetrationsdjupet hos de nära-infraröda lasrarna och förmågan att uppnå väl begränsad fokal ablation, är tvåfotonlaserablation särskilt användbar för att detektera vävnadsspänning in vivo. Som demonstrerats i detta protokoll kan denna metod enkelt kombineras med Opto-Rho1DN-medierad inaktivering av aktomyosinkontraktilitet för att undersöka den direkta effekten av Rho1-beroende cellulär kontraktilitet på vävnadsmekanik under dynamisk vävnadsremodellering.

Protocol

1. Ställa in det genetiska korset och förbereda ägguppsamlingskoppen Välj honflugor (jungfruliga) från den optogenetiska linjen UASp-CIBNpm (I); UASp-CRY2-Rho1DN-mCherry (III) på en CO2 pad under ett stereomikroskop och sätt upp en korsning med hanflugor från moderns GAL4 driver line 67 Sqh-mCherry; 15 E-cadherin-GFP.OBS: 67 och 15 står för maternal-Tubulin-GAL4 insatt i den andra (II) respektive tredje (III) kromosomen,52. GAL4-linjen som använ…

Representative Results

Hos de ostimulerade embryon som genomgick apikal sammandragning anrikades Sqh-mCherry vid den medioapikala regionen av de ventrala mesodermala cellerna, medan CRY2-Rho1DN-mCherry var cytosolisk (Figur 1A). Laserablation inom sammandragningsdomänen ledde till en snabb vävnadsrekyl längs AP-axeln (Figur 1B,C). I de stimulerade embryona blev CRY2-Rho1DN-mCherry-signalen plasmamembranlokaliserad, medan den medioapikala signalen från Sqh-mCherry …

Discussion

Detta protokoll beskrev den kombinerade användningen av optogenetik och laserablation för att undersöka förändringar i vävnadsspänning omedelbart efter inaktivering av aktomyosinkontraktilitet. Det optogenetiska verktyget som beskrivs här drar fördel av den dominanta negativa formen av Rho1 (Rho1DN) för att akut hämma endogent Rho1 och Rho1-beroende aktomyosinkontraktilitet. Tidigare karakterisering av Opto-Rho1DN i samband med bildning av Drosophila ventrala fåror visade att verktyget är mycket eff…

Materials

35 mm glass-bottom dish	MatTek	P35G-1.5-10-C	Used for sample preparation
60 mm × 15 mm Petri dish with lid	Falcon	351007	Used for sample preparation
Black cloth for covering the microscope	Online	NA	Used to avoid unwanted light stimulation
Clorox Ultra Germicadal Bleach (8.25% sodium hypochlorite)	VWR	10028-048	Used for embryo dechorination
CO2 pad	Genesee Scientific	59-114	Used for cross set-up
ddH2O	NA	NA	Used for sample preparation
Dumont Style 5 tweezers	VWR	102091-654	Used for sample preparation
Eyelash tool (made from pure red sable round brush #2)	VWR	22940-834	Used for sample preparation
FluoView (Software)	Olympus	NA	Used for image acquisition and optogenetic stimulation
Halocarbon oil 27	Sigma Aldrich	H8773-100ML	Used for embryo stage visualization
ImageJ/FIJI	NIH	NA	Used for image analysis
MATLAB	MathWorks	NA	Used for image analysis
Nikon SMZ-745 stereoscope	Nikon	NA	Used for sample preparation
Olympus FVMPE-RS multiphoton microscope with InSight DS Dual-line Ultrafast Lasers for simultaneous dual-wavelength multiphoton imaging, , a 25x/NA1.05 water immersion objective (XLPLN25XWMP2), and an IR/VIS stimulation unit for photo-activation/stimulation. This system is also equipped with a TRITC filter (39005-BX3; AT-TRICT-REDSHFT 540/25x, 565BS, 620/60M), and a fluorescence illumination unit that emits white light.	Olympus	NA	Used for image acquisition and optogenetic stimulation
SP Bel-Art 100-place polypropylene freezer storage box (Black, light-proof box for sample transfer)	VWR	30621-392	Used to avoid unwanted light stimulation
UV Filter Shield for FM1403 Fluores (Orange-red plastic shield)	Bolioptics	FM14036151	Used to avoid unwanted light stimulation
VITCHELO V800 Headlamp with White and Red LED Lights	Amazon	NA	Used to avoid unwanted light stimulation