Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

التجزئة اليدوية للضفيرة المشيمية البشرية باستخدام التصوير بالرنين المغناطيسي للدماغ

Published: December 15, 2023 doi: 10.3791/65341
Automatic Translation
*1,2, *3,4, 1,2, 5,6,7, 1,2,8
1Department of Psychiatry, Beth Israel Deaconess Medical Center, 2Division of Translational Neuroscience, Beth Israel Deaconess Medical Center, 3Huaxi MR Research Center (HMRRC), Department of Radiology, West China Hospital of Sichuan University, 4Department of Psychiatry and Psychotherapy, Jena University Hospital, 5AI in Medical Imaging, German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE), 6A. A. Martinos Center for Biomedical Imaging, Massachusetts General Hospital, 7Department of Radiology, Harvard Medical School, 8Department of Psychiatry, Harvard Medical School
* These authors contributed equally

Summary

على الرغم من الدور الحاسم للضفيرة المشيمية في الدماغ ، فإن دراسات التصوير العصبي لهذا الهيكل نادرة بسبب عدم وجود أدوات تجزئة آلية موثوقة. يهدف البروتوكول الحالي إلى ضمان التقسيم اليدوي القياسي الذهبي للضفيرة المشيمية التي يمكن أن تفيد دراسات التصوير العصبي المستقبلية.

Abstract

الضفيرة المشيمية متورطة في النمو العصبي ومجموعة من اضطرابات الدماغ. تظهر الأدلة أن الضفيرة المشيمية ضرورية لنضج الدماغ ، والتنظيم المناعي / الالتهابي ، والأداء السلوكي / المعرفي. ومع ذلك ، فإن أدوات تجزئة التصوير العصبي الآلي الحالية ضعيفة في تقسيم الضفيرة المشيمية البطينية الجانبية بدقة وموثوقية. علاوة على ذلك ، لا توجد أداة موجودة تقسم الضفيرة المشيمية الموجودة في البطينين الثالث والرابع من الدماغ. وبالتالي ، هناك حاجة إلى بروتوكول يحدد كيفية تقسيم الضفيرة المشيمية في البطين الجانبي والثالث والرابع لزيادة موثوقية وتكرار الدراسات التي تفحص الضفيرة المشيمية في اضطرابات النمو العصبي والدماغ. يوفر هذا البروتوكول خطوات مفصلة لإنشاء ملفات مصنفة بشكل منفصل في 3D Slicer للضفيرة المشيمية بناء على صور DICOM أو NIFTI. سيتم تقسيم الضفيرة المشيمية يدويا باستخدام المستويات المحورية والسهمية والإكليلية لصور T1w مع التأكد من استبعاد voxels من هياكل المادة الرمادية أو البيضاء المتاخمة للبطينين. سيتم تعديل النوافذ للمساعدة في توطين الضفيرة المشيمية وحدودها التشريحية. سيتم عرض طرق تقييم الدقة والموثوقية كجزء من هذا البروتوكول. يمكن استخدام التجزئة القياسية الذهبية للضفيرة المشيمية باستخدام الترسيمات اليدوية لتطوير أدوات تجزئة آلية أفضل وأكثر موثوقية يمكن مشاركتها علنا لتوضيح التغييرات في الضفيرة المشيمية عبر العمر وداخل اضطرابات الدماغ المختلفة.

Introduction

وظيفة الضفيرة المشيمية
الضفيرة المشيمية هي بنية عالية الأوعية الدموية في الدماغ تتكون من الشعيرات الدموية المحصورة وطبقة أحادية من الخلايا الظهارية الضفيرة المشيمية1. تبرز الضفيرة المشيمية في البطينات الدماغية الجانبية والثالثة والرابعة وتنتج السائل النخاعي (CSF) ، والذي يلعب دورا مهما في الأنماط العصبية2 وفسيولوجيا الدماغ 3,4. تفرز الضفيرة المشيمية مواد وعائية عصبية ، وتشمل مستودعا يشبه الخلايا الجذعية ، وتعمل كحاجز مادي لإعاقة دخول المستقلبات السامة ، وحاجز إنزيمي لإزالة الأجزاء التي تتحايل على الحاجز المادي ، وحاجز مناعي للحماية من الغزاة الأجانب5. تعدل الضفيرة المشيمية تكوين الخلايا العصبية6 ، واللدونة المشبكية7 ، والالتهاب8 ، وإيقاع الساعة البيولوجية 9,10 ، ومحور الدماغ المعوي11 ، والإدراك12. علاوة على ذلك ، يمكن أن تؤدي السيتوكينات المحيطية والإجهاد والعدوى (بما في ذلك SARS-CoV-2) إلى تعطيل حاجز الدم CSF13،14،15،16. وبالتالي ، فإن نظام الضفيرة المشيمية - CSF هو جزء لا يتجزأ من النمو العصبي ، ونضج الدائرة العصبية ، وتوازن الدماغ ، والإصلاح17. نظرا لأن التغيرات المناعية والالتهابية والأيضية والأنزيمية تؤثر على الدماغ ، يستخدم الباحثون أدوات التصوير العصبي لتقييم دور الضفيرة المشيمية عبر العمر وفي اضطرابات الدماغ18،19،20. ومع ذلك ، توجد قيود في الأدوات الآلية شائعة الاستخدام لتجزئة الضفيرة المشيمية ، مثل FreeSurfer ، مما يؤدي إلى تجزئة الضفيرة المشيمية بشكل سيئ. وبالتالي ، هناك حاجة ماسة للتجزئة اليدوية للحقيقة الأرضية للضفيرة المشيمية التي يمكن استخدامها لتطوير أداة آلية دقيقة لتجزئة الضفيرة المشيمية.

الضفيرة المشيمية في النمو العصبي واضطرابات الدماغ
لطالما تم إهمال دور الضفيرة المشيمية في اضطرابات الدماغ ، ويرجع ذلك أساسا إلى أنها كانت تعتبر لاعبا داعما يتمثل دوره في تخفيف الدماغ والحفاظ على توازن الملح المناسب 2,21. ومع ذلك ، فقد اكتسبت الضفيرة المشيمية الانتباه كهيكل مرتبط باضطرابات الدماغ مثل متلازمات الألم22 ، SARS-CoV-216،23،24 ، النمو العصبي2 ، واضطرابات الدماغ19 ، مما يشير إلى تأثير عبر التشخيص في تطور الاضطرابات السلوكية. في اضطرابات النمو العصبي ، ارتبطت أكياس الضفيرة المشيمية بزيادة خطر تأخر النمو أو اضطراب نقص الانتباه / فرط النشاط (ADHD) أو اضطراب طيف التوحد (ASD)25,26. بالإضافة إلى ذلك ، تم العثور على زيادة حجم الضفيرة المشيمية البطين الجانبي في المرضى الذين يعانون من ASD27. في اضطرابات الدماغ ،تم وصف تشوهات الضفيرة المشيمية منذ عام 1921 في الاضطرابات الذهانية28,29. حددت الدراسات السابقة تضخم الضفيرة المشيمية باستخدام تجزئة FreeSurfer في عينة كبيرة من المرضى الذين يعانون من اضطرابات ذهانية مقارنة بكل من أقاربهم من الدرجة الأولى والضوابط19. تم تكرار هذه النتائج باستخدام حجم الضفيرة المشيمية المجزأة يدويا في عينة كبيرة من الخطورة السريرية عالية لسكان الذهان ووجدت أن هؤلاء المرضى لديهم حجم ضفيرة مشيمية أكبر مقارنة بالضوابط الصحية30. هناك عدد متزايد من الدراسات التي توضح تضخم الضفيرة المشيمية في متلازمة الألم الإقليمية المعقدة22 ، والسكتة الدماغية31 ، والتصلب المتعدد20،32 ، ومرض الزهايمر33،34 ، والاكتئاب35 ، مع بعض إظهار وجود صلة بين النشاط المناعي / الالتهابي المحيطي والدماغي. هذه الدراسات العصبية واعدة. ومع ذلك ، فإن تجزئة الضفيرة المشيمية البطينية الجانبية الضعيفة بواسطة FreeSurfer21 تحد من مصداقية تقدير حجم الضفيرة المشيمية الآلي. نتيجة لذلك ، بدأت الدراسات في التصلب المتعدد20,32 ، والاكتئاب35 ، ومرض الزهايمر34 ، والذهان المبكر36 في تقسيم الضفيرة المشيمية البطينية الجانبية يدويا ، ولكن لا توجد إرشادات حالية لكيفية القيام بذلك ، ولا إرشاداتهم حول تقسيم الضفيرة المشيمية البطين الثالث والرابع.

أدوات التجزئة الشائعة تستبعد الضفيرة المشيمية
خطوط أنابيب تجزئة الدماغ مثل FreeSurfer37،38،39 ، مكتبة برامج FMRIB (FSL) 40 ، SLANT41 ، و FastSurfer (التي طورها المؤلف المشارك مارتن رويتر)42،43 ، تقسم بدقة وموثوقية الهياكل القشرية وتحت القشرية التي تستخدم نماذج الأطلس (FSL) والأطلس والسطح (FreeSurfer) ونماذج تجزئة التعلم العميق (SLANT و FastSurfer). تشمل نقاط الضعف في بعض هذه الأساليب سرعة المعالجة ، والتعميم المحدود على الماسحات الضوئية المختلفة ، وشدة المجال وأحجام الفوكسل37،44 ، والمحاذاة القسرية لخريطة التسمية في مساحة أطلس قياسية. ومع ذلك ، فإن القدرة على تقسيم الضفيرة المشيمية والتوافق مع التصوير بالرنين المغناطيسي عالي الدقة يتم معالجتها فقط بواسطة FreeSurfer و FastSurfer. يتم تدريب الشبكات العصبية وراء FastSurfer على ملصقات الضفيرة المشيمية FreeSurfer ، لذا فهي ترث قيود الموثوقية والتغطية التي تمت مناقشتها سابقا من FreeSurfer ، مع تجاهل البطينين الثالث والرابع21. توجد أيضا قيود حالية للتصوير بالرنين المغناطيسي عالي الدقة ، ولكن يمكن استخدام دفق FreeSurfer عالي الدقة45 و FastSurferVINN43 للتعامل مع هذه المشكلة.

أدوات تجزئة الضفيرة المشيمية الحالية
لا يوجد سوى أداة تجزئة واحدة متاحة مجانا للضفيرة المشيمية ، لكن دقة التجزئة محدودة. يمكن أن يتأثر تجزئة الضفيرة المشيمية الدقيقة بمجموعة متنوعة من العوامل ، بما في ذلك (1) التباين في موقع الضفيرة المشيمية (غير ثابت مكانيا) بسبب موقعها داخل البطينين ، (2) الاختلافات في شدة الفوكسل ، التباين ، الدقة (عدم التجانس داخل الهيكل) بسبب عدم التجانس الخلوي ، وظيفة الضفيرة المشيمية الديناميكية ، التغيرات المرضية ، أو تأثيرات الحجم الجزئي ، (3) اختلافات حجم البطين المرتبطة بالعمر أو الأمراض التي تؤثر على حجم الضفيرة المشيمية ، و (4) القرب من الهياكل تحت القشرية المجاورة (الحصين ، اللوزة ، المذنبة ، والمخيخ) ، والتي يصعب أيضا تقسيمها. بالنظر إلى هذه التحديات ، غالبا ما تكون تجزئة FreeSurfer أقل من أو تبالغ في تقدير الضفيرة المشيمية أو تخطئ في تسميتها أو تتجاهلها.

تناولت ثلاثة منشورات حديثة فجوة تجزئة الضفيرة المشيمية الموثوقة باستخدام نموذج خليط غاوسي (GMM) 46 ، و Axial-MLP47 ، ونهج التعلم العميق القائم على U-Net48. تم تدريب كل نموذج وتقييمه باستخدام مجموعات بيانات خاصة مصنفة يدويا لما لا يزيد عن 150 شخصا مع تنوع محدود من الماسحات الضوئية والمواقع والتركيبة السكانية والاضطرابات. في حين أن هذه المنشورات46،48،49 حققت تحسينات كبيرة على تجزئة الضفيرة المشيمية في FreeSurfer - في بعض الأحيان تضاعف تقاطع التنبؤ والحقيقة الأرضية ، لم يتم التحقق من صحة أي من الطريقتين (1) في التصوير بالرنين المغناطيسي عالي الدقة ، (2) خصصت تحليلات التعميم والموثوقية ، (3) تتميز بتدريب وتمثيلي كبير ومجموعات بيانات الاختبار ، (4) تتناول أو تحلل على وجه التحديد تحديات تجزئة الضفيرة المشيمية مثل تأثيرات الحجم الجزئي ، أو (5) متاحة للجمهور كأداة جاهزة للاستخدام. وبالتالي ، فإن "المعيار الذهبي" الحالي لتجزئة الضفيرة المشيمية هو التتبع اليدوي ، على سبيل المثال ، باستخدام 3D Slicer50 أو ITK-SNAP51 ، والذي لم يتم وصفه من قبل وكان تحديا كبيرا للباحثين الراغبين في فحص دور الضفيرة المشيمية في دراساتهم. تم اختيار 3D Slicer للتجزئة اليدوية نظرا لإلمام المؤلف بالبرنامج ولأنه يوفر للمستخدم أدوات متنوعة تعتمد على طرق مختلفة يمكن دمجها للحصول على النتيجة المرجوة. يمكن استخدام أدوات أخرى ، مثل ITK-SNAP ، والتي يتم توجيهها بشكل أساسي إلى تجزئة الصورة ، وبمجرد إتقان الأداة ، يمكن للمستخدم الحصول على نتائج جيدة. بالإضافة إلى ذلك ، أجرى المؤلفون دراسة حالة وشواهد توضح الدقة العالية والموثوقية لتقنية التجزئة اليدوية الخاصة بهم باستخدام 3D Slicer30 ، ويتم وصف هذه المنهجية المحددة هنا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تمت الموافقة على البروتوكول الحالي من قبل مجلس المراجعة المؤسسية في مركز بيث إسرائيل ديكونيس الطبي. تم استخدام موضوع سليم مع فحص التصوير بالرنين المغناطيسي للدماغ الذي كان خاليا من القطع الأثرية أو الحركة في عرض البروتوكول هذا ، وتم الحصول على موافقة خطية مستنيرة. تم استخدام ماسح ضوئي للتصوير بالرنين المغناطيسي 3.0 T مع ملف رأس 32 قناة (انظر جدول المواد) للحصول على صور ثلاثية الأبعاد بدقة 1 مم × 1 مم × 1.2 مم. تم استخدام تسلسل MP-RAGE ASSET مع مجال رؤية 256 × 256 ، TR / TE / TI = 7.38 / 3.06 / 400 مللي ثانية ، وزاوية قلب 11 درجة.

1. استيراد التصوير بالرنين المغناطيسي للدماغ إلى 3D القطاعة

ملاحظة: يوفر 3D Slicer الوثائق المتعلقة بواجهة المستخدم الخاصة به.

  1. إعداد الدماغ التصوير بالرنين المغناطيسي DICOM (التصوير الرقمي والاتصالات في الطب) أو NIFTI (مبادرة تكنولوجيا المعلوماتية التصوير العصبي) الملفات لاستيرادها إلى 3D القطاعة.
  2. قم باستيراد بيانات DICOM بالنقر فوق الزر DCM في الزاوية العلوية اليسرى من شريط الأدوات. ثم انقر فوق ملف استيراد ملفات DICOM زر لاستيراد بيانات تنسيق DICOM.
  3. إذا كانت بيانات التصوير بالرنين المغناطيسي بتنسيق NIFTI، فقم باستيرادها بالنقر فوق الزر DATA في الزاوية العلوية اليسرى من شريط الأدوات. في مربع الحوار المنبثق، حدد اختيار دليل لإضافته إلى الاستيراد الدفعي لبيانات NIFTI في مجلد أو حدد اختيار ملف (ملفات) لإضافته لاستيراد ملفات NIFTI محددة. ثم ، انقر فوق OK زر لمتابعة تحميل البيانات إلى 3D Slicer.
  4. بعد الاستيراد ، ستظهر بيانات التصوير بالرنين المغناطيسي في النافذة الموجودة على اليمين لعرض المستويات المحورية والسهمية والإكليلية.
  5. قم بتغيير تخطيط النوافذ بالانتقال إلى التخطيطات وتحديد تخطيط معين. يمكن العثور على هذا إما عن طريق النقر فوق صورة وحدة التخطيطات في شريط أدوات 3D Slicer نفسه أو عبر عرض تخطيطات > من قائمة التطبيق.

2. تنزيل DICOM من عينة البيانات في 3D Slicer

  1. انقر فوق الزر تنزيل عينة البيانات في الشاشة الافتتاحية لقسم مرحبا بك في مقسم طريقة العرض. ثم حدد زر MRHead ، وسيبدأ عملية التنزيل ، والتي قد تستغرق بضع دقائق.
  2. تأكد من عرض بيانات التصوير بالرنين المغناطيسي للدماغ مع المستويات المحورية والسهمية والإكليلية في النافذة اليمنى.

3. مراقبة الجودة وضبط صورة التصوير بالرنين المغناطيسي

  1. حدد نوعيا جودة الصورة ووجود القطع الأثرية بسبب حركة الرأس أو مشكلات المسح الضوئي من خلال مراجعة نقدية لكل شريحة من شرائح التصوير بالرنين المغناطيسي.
  2. قم بتكبير شريحة الصورة بالنقر بزر الماوس الأيمن وتحريك الماوس لأعلى أو لأسفل للتصغير أو التصغير ، على التوالي.
  3. لتحريك شريحة الصورة، انقر بزر الماوس الأيسر فوق الصورة، واضغط مع الاستمرار على مفتاح Shift ، واسحب الماوس حولها.
  4. يمكن أن يساعد ضبط سطوع الصورة في عرض الضفيرة المشيمية. للقيام بذلك ، انقر فوق ضبط النافذة / مستوى الصوت في شريط الأدوات أو انقر بزر الماوس الأيسر فوق الصورة وحرك الماوس لأعلى أو لأسفل لرفع أو خفض السطوع ، على التوالي.
  5. يمكن أن يساعد ضبط التباين أيضا في العثور على الضفيرة المشيمية. انقر بزر الماوس الأيسر على شريحة الصورة وحرك الماوس إلى اليسار أو اليمين لزيادة التباين أو تقليله ، على التوالي. لتحديد التباين المناسب للضفيرة المشيمية ، استخدم نوى المادة الرمادية العميقة (كتل مركزية من المادة الرمادية مصفوفة حول البطينين الجانبي والثالث) أو شدة الإشارة الموضحة في شريط مقياس التباين.
  6. بمجرد تحديد التباين المفضل ، حافظ على نفس التباين طوال التجزئة ولا تضبط الاختلافات المحتملة في المناطق فوق وتحت الوترية.

4. إنشاء الأجزاء اليدوية من الضفيرة المشيمية

  1. لبدء تجزئة الضفيرة المشيمية البطينية الجانبية والثالثة والرابعة ، قم بإنشاء ملفات التجزئة في وحدة محرر القطع . للتنقل إلى هناك ، انقر إما على محرر المقاطع في شريط الأدوات أو انتقل إلى القائمة المنسدلة الوحدات النمطية: وحدد محرر القطع.
  2. انقر فوق القائمة المنسدلة للتجزئة لتحديد تقسيمات مختلفة (إذا تم إنشاء أجزاء متعددة) وإعادة تسمية التجزئة المحددة حاليا.
  3. استخدم القائمة المنسدلة الحجم الرئيسي لاختيار مجموعات NIFTI أو DICOM التي تحتاج إلى تحرير. فقط عند تحديد ملف وحدة التخزين ، يمكن للمستخدم البدء في التقسيم / التحرير.
  4. انقر فوق الزر إضافة مرتين لإضافة مقطعين للضفيرة المشيمية البطينية الجانبية. لإعادة تسميتها ، انقر نقرا مزدوجا فوق الاسم وقم بتغييرها إلى الضفيرة المشيمية البطين الجانبي الأيمن والضفيرة المشيمية البطين الجانبي الأيسر.
  5. انقر فوق الزر "إضافة" مرة أخرى لإضافة مقاطع للضفيرة المشيمية البطينية الثالثة والرابعة ، وإعادة تسميتها إلى "الضفيرة المشيمية البطينية الثالثة" و "الضفيرة المشيمية البطينية 4".

5. عرض شرائح وتجزئة مختلفة

  1. قبل التحرير ، قم بإجراء دراسة خلفية لمعرفة كيفية التنقل بين التخطيطات في نافذة العرض وكيفية تغيير عرض أو عتامة التجزئة.
  2. في الجزء العلوي من نافذة العرض وعلى يسار شريط تمرير الشريحة ، انقر فوق رمز الدبوس. سيؤدي هذا إلى فتح قائمة منسدلة ، والتي قد تختلف اعتمادا على التخطيط المحدد للنافذة.
    ملاحظة: يمكن أن يكون استخدام تخطيطات مختلفة مفيدا عند تقسيم الضفيرة المشيمية لأن هيكلها يمكن أن يختلف بين الأفراد. على سبيل المثال ، يسمح التخطيط "التقليدي" للمستخدم بعرض جميع الشرائح الثلاث في وقت واحد وعرض 3D للمشهد. اختيار "شريحة حمراء / صفراء / خضراء فقط" يعطي المستخدم رؤية عن قرب لشريحة 2D للسماح بتجزئة أكثر دقة للضفيرة المشيمية.

6. تحديد عائد استثمار الضفيرة المشيمية البطين الجانبي

ملاحظة: تسجيل الصورة في قالب ليس ضروريا للتجزئة اليدوية.

  1. بالنسبة للضفيرة المشيمية البطينية الجانبية ، ابدأ في المستوى المحوري لضمان وضع الصور بناء على الخط الثنائي. ثم استخدم ضمانات trigonum كنقطة مرجعية لتحديد موقع الضفيرة المشيمية البطينية الجانبية.
    1. بمجرد إجراء التعديلات في المستوى المحوري ، انتقل إلى المناظر المتبقية (السهمي والإكليلي) للتأكد من أن التجزئة اليدوية للضفيرة المشيمية البطينية الجانبية لا تلتقط حمة الدماغ المحيطة أو السائل الدماغي النخاعي.
  2. لبدء التحرير ، انقر فوق المقطع للعمل عليه ، وسيتم تمييز اسم الشريحة.
  3. انقر فوق أداة الطلاء أو الرسم في قسم التأثيرات في محرر المقاطع لبدء التجزئة اليدوية.
    ملاحظة: من الأفضل البدء في التقسيم في مستوى واحد (إكليلي أو محوري أو سهمي) ، وبعد اكتمال التجزئة في جميع الشرائح ، انتقل إلى مستويات أخرى للتحقق من التجزئة اليدوية وتحسينها. يقترح أن يبدأ المستخدم بالمستويات المحورية أو الإكليلية حيث يمكن رؤية الضفيرة المشيمية البطينية الجانبية بسهولة أكبر في هذه الآراء.
  4. عند استخدام أداة الرسم ، انقر بزر الماوس الأيسر مع الاستمرار لرسم محيط عند حدود الضفيرة المشيمية البطينية الجانبية. بمجرد التتبع ، انقر بزر الماوس الأيمن لملء المنطقة المرسومة.
  5. عند استخدام أداة الطلاء ، حدد أولا قطر الفرشاة التي سيتم استخدامها للطلاء. يقترح فرشاة 3٪ أو 5٪ لتحديد أكثر دقة للضفيرة المشيمية ، في حين أن 10٪ يمكن أن تكون مفيدة للاختيارات الأكبر.
  6. لأي من الأداتين ، استخدم الطلاء أو المسح لتصحيح أي ترسيم خاطئ عن طريق إضافة أو إزالة التحديدات.
    ملاحظة: يمكن أن تساعد الإشارة إلى مستويات الرؤية الأخرى في تحديد بنية الضفيرة المشيمية للبطين الجانبي مقابل هياكل الدماغ الأخرى ، مثل المادة الرمادية المحيطة أو القبو أو الجسم الثفني أو الحصين. يتم تشجيع المستخدم على استبعاد فحوصات الدماغ التي تم تحديد أكياس الضفيرة المشيمية.
  7. استخدم مستوى النواة الحمراء كمعلم لإيقاف تجزئة الضفيرة المشيمية في البطينين الجانبيين.

7. تحديد عائد استثمار الضفيرة المشيمية للبطين الثالث والرابع

ملاحظة: ستوفر صور T1w عالية الدقة (مثل 0.7 أو 0.8 مم) وتلك التي تم الحصول عليها في التصوير بالرنين المغناطيسي 7T تقسيما يدويا أكثر دقة وموثوقية للضفيرة المشيمية للبطين الثالث والرابع. يعد تقسيم الضفيرة المشيمية للبطين الثالث والرابع أكثر صعوبة من الضفيرة المشيمية البطينية الجانبية لأن هذه المناطق يمكن أن تكون أصغر بكثير ومع عدد أقل من الفوكسل لتحديدها.

  1. بالنسبة للضفيرة المشيمية البطينية الثالثة ، ابدأ في المستوى السهمي واستخدم ثقبة مونرو ، القبو ، الجسم الثفني ، المهاد ، والوريد الدماغي الداخلي كنقاط مرجعية لتحديد الضفيرة المشيميةفي البطين 3. يمكن أن يساعد التنقل بين الشرائح داخل المستوى نفسه في تحديد إذا ما كانت المنطقة هي القبو أو المهاد أو الوريد أو الضفيرة المشيمية للبطين الثالث.
    1. بمجرد إجراء التعديلات في المستوى السهمي ، انتقل إلى طرق العرض المتبقية (المحورية والإكليلية ) للتأكد من أن التجزئة اليدوية للضفيرة المشيمية البطين الثالث لا تحدد حمة الدماغ المحيطة أو السائل الدماغي النخاعي.
  2. وبالمثل، بالنسبة للضفيرة المشيمية البطينية الرابعة، ابدأ في المستوى السهمي واستخدم السويقة المخيخية العلوية، والبونس، والنخاع كنقاط مرجعية لتحديد الضفيرة المشيمية في البطين الرابع. يمكن أن يساعد التنقل بين الشرائح داخل نفس المستوى في تحديد ما إذا كانت المنطقة هي المخيخ أو اللوزتين المخيخيتين أو القطيفة النخاعية السفلية أو الضفيرة المشيمية البطينية 4.
    1. بمجرد الانتهاء من التعديلات في المستوى السهمي ، انتقل إلى طرق العرض المتبقية (المحورية والإكليلية) للتأكد من أن التجزئة اليدوية للضفيرة المشيمية البطينية الرابعة لا تختار حمة الدماغ المحيطة أو السائل الدماغي النخاعي.

8. حساب أحجام الضفيرة المشيمية

  1. من القائمة المنسدلة الوحدات النمطية ، انتقل إلى القياس الكمي وحدد إحصائيات القطاع.
  2. ضمن المدخلات، حدد خريطة التجزئة الجديدة للقياس الكمي ضمن أداة التجزئة واختر وحدة تخزين التصوير بالرنين المغناطيسي من وحدة التخزين العددية. بالنسبة لجدول المخرجات (ضمن الإخراج)، اختر خيار الجدول . بمجرد الانتهاء ، اضغط على تطبيق ، وسيظهر جدول يحتوي على حجم الضفيرة المشيمية في وحدات مختلفة.

9. حفظ المقاطع ونتائج الحجم

  1. انقر على حفظ زر في الزاوية اليسرى العليا من شريط الأدوات لحفظ الملفات التي تم إنشاؤها.
  2. احفظ ملفات التجزئة بتنسيق .nrrd (ملف مقسم طريقة عرض 3D) أو .nii.gz (ملف NIFTI) أو .tsv (ملف جدول).

10. تحديد الدقة والأداء والاتفاق على التجزئة

ملاحظة: يوصى باستخدام حزمة MONAI (انظر جدول المواد) ، والتي تصف معامل النرد (DC) ومتوسط مسافة سطح DeepMind (avgSD). التفاصيل حول DC و avgSD موصوفة أدناه. من أجل حساب هذه المقاييس ، سيحتاج القراء إلى معرفة كيفية البرمجة (على سبيل المثال ، python ، وقراءة الصور من القرص ، وإعادة تنسيق البيانات إلى صفائف الإدخال المناسبة لهذه الوظائف). لا توجد حزمة سهلة الاستخدام تتضمن كل هذه المقاييس.

  1. درجة DC هي نهج قياسي لتحديد تداخل مجالين هندسيين. لحساب متوسط درجة DC بين تجزأين ، قم بتوفير موترين y_pred و y ، أي صور متعددة الإطارات بإطار واحد لكل صورة تسمية ثنائية. قد تحتوي Tensors y_pred و y على تقسيمات لاثنين من المقيمين اليدويين المختلفين ، أو تجزئة متكررة لنفس المعدل ، أو التنبؤ الآلي والحقيقة الأرضية اليدوية.
    1. استخدم الدالة monai.metrics.compute_meandice لحساب متوسط درجة DC.
    2. قم بإنشاء موترات تسمية ثنائية مناسبة باستخدام monai.transforms.post.
      ملاحظة: يمكن تعيين المعلمة include_background إلى False لاستبعاد الفئة الأولى (فهرس القناة 0) من حساب DC ، والذي يفترض ، حسب الاصطلاح ، أنه خلفية.
  2. ضع في اعتبارك أن درجة متوسط SD أقل شيوعا ، ولاحظ أن النهج يمكن أن يختلف مع وجود تعريفات متعددة لمسافة السطح. على سبيل المثال ، استخدم المسافة القصوى (المعروفة أيضا باسم مسافة Hausdorff ، شديدة الحساسية للقيم المتطرفة) ، ومتوسط المسافة (كما هو موضح هنا) ، والنسبة المئوية 95 (قوية للغاية) كمقاييس مستخدمة بشكل متكرر.
    1. استخدم الدالة compute_average_surface_distance لحساب متوسط درجة SD.
    2. تأكد من أن هذه الوظيفة تحسب متوسط مسافة السطح من y_pred إلى y ضمن الإعداد الافتراضي.
    3. بالإضافة إلى ذلك ، إذا كان متماثلا = صحيح ، فتأكد من إرجاع متوسط مسافة السطح المتماثلة بين هذين المدخلين.
  3. يمكن إجراء التحليل الإحصائي لدرجة DC و avgSD عبر حالات متعددة باستخدام اختبار Wilcoxon القوي الموقع للتحليل المزدوج.
  4. ضع في اعتبارك استخدام معامل الارتباط داخل الفئة (ICC) كطريقة أخرى شائعة الاستخدام لتحديد ما إذا كان يمكن تصنيف العديد من المشاركين بشكل موثوق من قبل مقيمين مختلفين. تذكر أن ICC يعمل على مجموعة من القياسات المزدوجة (على سبيل المثال ، حجم) التجزئة وليس على صور التجزئة مباشرة. لحساب ICC ، استخدم برنامج R و R Studio (انظر جدول المواد) ، مما يجعل العملية مباشرة.
    1. قم بتنزيل الحزمة باستخدام install.packages ("psych") وقم بتحميل المكتبة (psych).
    2. أدخل إطار البيانات، الذي يتضمن المشاركين (الصفوف) ومقيما في كل عمود، باستخدام Data <- data.frame(df). ثم تصور القياسات باستخدام المؤامرة (البيانات).
    3. لتشغيل ICC ، استخدم ICC (Data) ، الذي ينشئ جدولا للأنواع المختلفة من ICC ، على سبيل المثال ، للحصول على الدرجات بين المقيمين أو داخلهم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

خضعت الطريقة المقترحة لتحسين تكراري للضفيرة المشيمية البطينية الجانبية ، بما في ذلك اختبارات مكثفة على مجموعة من 169 ضابطا صحيا و 340 مريضا يعانون من مخاطر عالية سريريا للذهان30. باستخدام التقنية الموضحة أعلاه ، حصل المؤلفون على دقة وموثوقية عالية داخل المقيم مع DC = 0.89 ، و avgHD = 3.27 مم3 ، و ICC أحادي المقيم = 0.9730 ، مما يدل على قوة البروتوكول الموصوف هنا.

التعامل مع قضايا مراقبة الجودة وإعدادات 3D Slicer
قبل البدء في عملية التجزئة ، من الضروري التحقق من جودة فحص الدماغ للتأكد من عدم وجود حركة رأس أو قطع أثرية تتداخل مع التجزئة اليدوية (الشكل 1 أ). بعد ذلك ، يمكن ضبط السطوع والتباين للمساعدة في تصور أفضل للضفيرة المشيمية. قد يكون لبعض فحوصات الدماغ حركة رأس ، ومن المهم تحديد ما إذا كانت القطعة الأثرية ستؤثر سلبا على ترسيم الضفيرة المشيمية (الشكل 1 ب). بالإضافة إلى ذلك ، فإن الصور ذات السطوع والتباين، تجعل من الصعب التمييز بين حدود الضفيرة المشيمية (الشكل 1C، D). في هذه الحالة ، حاول ضبط السطوع والتباين حتى يصبح مناسبا للتجزئة اليدوية. تأكد من استبعاد فحوصات الدماغ التي لا يمكن تقسيمها بسهولة للضفيرة المشيمية.

تجزئة الضفيرة المشيمية البطين الجانبي
كما هو موضح في الشكل 2 ، يتم استخدام خمسة أجزاء رئيسية لتحميل وعرض الصور (الجزء 1) ، وتحديد وظائف تقطيع ثلاثية الأبعاد مختلفة (الجزء 2) ، وأدوات لتقسيم الضفيرة المشيمية الجانبية (الجزء 3) ، وتصور الصور المحورية والإكليلية والسهمية (الجزء 4) ، وحساب حجم الضفيرة المشيمية البطينية الجانبية (الجزء 5) ، وحفظ النتائج من التجزئة اليدوية. يمكن تحميل فحص الدماغ T1w باستخدام واجهة Welcome to Slicer عن طريق تنزيل عينة البيانات من مجموعة بيانات MRHead في 3D Slicer (الشكل 3) أو استيراد ملف NIFTI أو DICOM من مجموعة بيانات موجودة (الشكل 4A ، B). يوجد أيضا خيار في هذه اللوحة لتحرير سطوع الصورة وتباينها (الشكل 4C). بعد تحميل فحص الدماغ T1w ، سيتم عرضه في واجهة عرض الشريحة وإعداده لتجزئة الضفيرة المشيمية البطين الجانبي. يتم إنشاء التجزئة اليدوية باستخدام وحدة محرر المقاطع (الشكل 5A) ، ويمكن تأكيد اسم وحدة التخزين الرئيسية في الشكل 5B. في الشكل 5C ، يمكن إضافة ملصقات الضفيرة المشيمية البطينية البطينية اليمنى واليسرى وتسميتها بألوان مختلفة (الشكل 5C) ، ويمكن تحديد منطقة الاهتمام نفسها باستخدام أداة الرسم أو الطلاء (الشكل 5D). يوضح الشكل 6 الضفيرة المشيمية البطينية الجانبية وتراكيب الدماغ المحيطة بها، مثل النواة المذنبة، والحصين، والقبوة، والبطين الثالث، الذي يوفر معالم لتجزئة الضفيرة المشيمية البطينية الجانبية في بعض المناطق الأكثر تعقيدا. لإنشاء واستخراج بيانات حجم الضفيرة المشيمية من التقسيمات اليدوية ، حدد وحدة إحصائيات المقطع (الشكل 7 أ). هناك بعض الخيارات للاختيار من بينها لإخراج البيانات (الشكل 7 ب). يمكن الآن حفظ الملفات الجديدة التي تحتوي على حجم الضفيرة المشيمية البطين الجانبي المحسوب بالضغط على زر حفظ (الشكل 7C).

تجزئة الضفيرة المشيمية البطينية الثالثة والرابعة
كما هو موضح في الشكل 8 ، يمكن رؤية الضفيرة المشيمية البطينية الثالثة بسهولة في اللوحة اليسرى السفلية التي تصور المستوى السهمي. والجدير بالذكر أنه يمكن ملاحظة ثقبة مونرو وهي تتقوس أسفل الجسم الثفني ، مع تسليط الضوء على الضفيرة المشيمية داخل البطين الثالث باللون الأخضر. يمكن أيضا رؤية البطين الثالث والضفيرة المشيمية البطين الثالث في المستويين المحوري والإكليلي (الألواح العلوية اليسرى واليمنى السفلية من الشكل 8 ، على التوالي). أخيرا ، يظهر عرض 3D للضفيرة المشيمية البطين الثالث في اللوحة اليمنى العليا من الشكل 8. يوضح الشكل 9 الضفيرة المشيمية للبطين الثالث وتراكيب الدماغ المحيطة به، بما في ذلك الجسم الثفني، والقوب، والمهاد، والوريد الدماغي الداخلي، والبطين الثالث، الذي يوفر معالم لتجزئة الضفيرة المشيمية البطين الثالث في بعض المناطق الأكثر تعقيدا.

يصعب رؤية الضفيرة المشيمية البطينية الرابعة، ويمكن رؤيتها في الشكل 10. تسمح المستويات السهمية والإكليلية (الألواح السفلية اليسرى والسفلية اليمنى من الشكل 10) بأفضل عرض لهيكلها. يجب توخي الحذر لضمان عدم تحديد أجزاء من المخيخ أو البطين الرابع نفسه على أنها ضفيرة المشيمية. يصف الشكل 11 الضفيرة المشيمية للبطين الرابع وهياكل الدماغ المحيطة بها ، بما في ذلك النخاع ، والبونس ، والسويقة الدماغية العلوية ، والقطيفة النخاعية السفلية ، والبطين الرابع ، والتي توفر معالم لتجزئة الضفيرة المشيميةالبطينية 4 في بعض المناطق الأكثر تعقيدا.

دقة التجزئة والتشابه والاتفاق
يمكن مقارنة تجزئة الهياكل التشريحية العصبية مباشرة في عارض الصور ، ولكن يصعب أحيانا تقييم التشابه بصريا. لذلك ، يتم استخدام المقاييس الكمية مثل DC52 ، قياس نسبة التداخل ، و avgSD53 ، قياس المسافات بين الأسطح الحدودية للهياكل المحددة ، لمقارنة التنبؤات مع الحقيقة الأرضية أو التجزئة اليدوية عبر أو داخل المقيمين لتقييم الموثوقية. كما هو موضح في الشكل 12A ، فإن DC لجزأين ثلاثي الأبعاد G و P هو ببساطة حجم التداخل (التقاطع) مقسوما على متوسط الحجم53:

Equation 1

أين | . | يمثل الحجم. يقيس التداخل على مقياس بين 0 و 1 ، حيث تشير القيمة 1 إلى الاتفاق الدقيق و 0 تجزئة منفصلة وغالبا ما يتم ضربها في 100 لتمثيل نسبة التداخل. يقيس متوسط المسافة السطحية (ASD) متوسط المسافة (بالملليمتر) بين جميع النقاط x على حدود G ( bd (G)) إلى حدود P والعكس صحيح (الشكل 12B). يتم تعريفه على أنه

Equation 2

مع المسافة Equation 3 التي تمثل الحد الأدنى من القاعدة الإقليدية53. على عكس DC ، يشير ASD الأصغر إلى التقاط أفضل لحدود التجزئة ، مع كون قيمة الصفر هي الحد الأدنى (التطابق المثالي). لاحظ أنه في بعض الأحيان أيضا ، يتم استخدام الحد الأقصى للمسافةأو النسبة المئوية 95 بدلا من المتوسط ، حيث يكون الحد الأقصى شديد الحساسية للقيم المتطرفة الفردية ، في حينأن النسبة المئوية 95 قوية ولكنها قد تفوت أخطاء تجزئة صغيرة ولكنها ذات صلة.

يمكن قياس اتفاق تقديرات الحجم (وليس التجزئة مباشرة) بين مجموعة من التجزئة المزدوجة باستخدام ICC54. يمكن تحقيق ذلك من خلال تصنيف العديد من المشاركين من قبل عدة مقيمين (interclass ICC) أو من قبل نفس المقيم (داخل الفئة ICC) (الشكل 12C). تتراوح درجات ICC من 0 (موثوقية ضعيفة) إلى 1 (موثوقية ممتازة). من أجل الموثوقية بين المقيمين ، يقترح استخدام ICC1 (نموذج التأثيرات الثابتة أحادي الاتجاه) لمجموعات البيانات حيث يتم إجراء كل تجزئة بواسطة مقيم مختلف يتم اختياره عشوائيا. بالإضافة إلى ذلك ، بالنسبة لمجموعات البيانات التي تعمل فيها جهات تقييم متعددة ، يتم اختيارها عشوائيا ، على نفس التجزئة ، يوصى باستخدام ICC2 (نموذج التأثيرات العشوائية ثنائي الاتجاه) لاختبار الاتفاق المطلق في التجزئة. أخيرا ، من أجل الموثوقية داخل المقيم ، يوصى باستخدام ICC3 (نموذج التأثيرات المختلطة ثنائي الاتجاه) (الشكل 12C).

Figure 1
الشكل 1: مراقبة جودة مسح الدماغ. (أ) مسح الدماغ بتباين وسطوع جيدين ، ولا يوجد دليل على القطع الأثرية ، ولا حركة الرأس. ب: فحص الدماغ الذي يظهر حركة الرأس (السهم الأحمر). (ج) مسح الدماغ باستخدام سطوع عال وتباين منخفض، أو (د) سطوع منخفض وتباين مرتفع. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: تجزئة الضفيرة المشيمية البطينية الجانبية في 3D Slicer. (1) يستخدم لتحميل صور DICOM أو NIFTI ولحفظ النتائج. (2) يتكون من قائمة منسدلة يمكن استخدامها للدخول إلى وحدة محرر المقطع (السهم الأصفر) ، والتي تستخدم لتقسيم الضفيرة المشيمية. يمكن أيضا اختيار وحدة القياس الكمي (السهم الأزرق) هنا لحساب حجم الضفيرة المشيمية. (3) يعرض شريط أدوات المقطع ، والذي يتضمن أدوات الرسم والطلاء والمسح. (4) يوضح الضفيرة المشيمية في المناظر المحورية والسهمية والإكليلية لصورة T1w. يظهر أيضا عرض 3D للضفيرة المشيمية في الزاوية اليمنى العليا. (5) يعرض نتائج الحجم من تجزئة الضفيرة المشيمية اليدوية ، المحسوبة باستخدام وحدة إحصائيات القطاع. يمكن حفظ النتائج النهائية باستخدام زر الحفظ المذكور في (1). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: تحميل بيانات عينة مقسم العرض ثلاثي الأبعاد. يوضح هذا الشكل كيفية تنزيل عينة البيانات من واجهة 3DSlicer. أولا ، يجب تحديد "تنزيل عينة البيانات" ، ثم يجب اختيار "MRHead" ، والذي يعرض المناظر المحورية والسهمية والإكليلية لمسح الدماغ على الجانب الأيمن من الشاشة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: تحميل فحص الدماغ T1w. يوضح هذا الشكل كيفية تحميل فحص الدماغ T1w باستخدام ملفات NIFTI (اللوحة اليسرى) أو DICOM (اللوحة اليمنى). (أ) بالنسبة لملفات NIFTI ، يجب تحديد إما "اختيار دليل لإضافته" أو "اختيار ملف (ملفات) لإضافته" ، متبوعا بتحديد "موافق". (ب) بالنسبة لملفات DICOM ، يلزم تحديد "إضافة بيانات DICOM" ، متبوعا ب "استيراد ملفات DICOM" ثم الضغط على "موافق". سيعرض هذان النهجان وجهات النظر المحورية والسهمية والإكليلية لمسح الدماغ على الجانب الأيمن من الشاشة. ( C) لضبط سطوع الصور وتباينها، يجب تحديد الزر الأحمر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: تجزئة الضفيرة المشيمية البطينية الجانبية. بعد تحميل فحص الدماغ T1w في 3D القطاعة. (أ) اختيار وحدة "محرر التجزئة". ب: تأكيد الوحدة والحجم الرئيسي للتجزئة اليدوية للضفيرة المشيمية البطينية الجانبية. ج: إنشاء ملصقات للضفيرة المشيمية البطينية البطينية اليمنى واليسرى. د: استخدام أداتي «الرسم» و«الطلاء» لتحديد الضفيرة المشيمية البطينية الجانبية يدويا. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: التراكيب المجاورة للضفيرة المشيمية البطينية الجانبية. تشمل هياكل الدماغ المجاورة القبو والنواة المذنبة والحصين والبطين الثالث. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 7
الشكل 7: حساب الحجم. حساب حجم الضفيرة المشيمية وحفظ الأجزاء ونتائج الحجم. (أ) اختيار وحدة الإحصاءات القطاعية . (ب) الاختيار لإخراج البيانات. (ج) الضغط على الزر حفظ لحفظ الملفات الجديدة التي تحتوي على حجم الضفيرة المشيمية البطينية الجانبية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 8
الشكل 8: تجزئة الضفيرة المشيمية للبطين الثالث. يصور هنا وجهات النظر المحورية والإكليلية والسهمية للضفيرة المشيمية البطين الثالث التي تم تقسيمها يدويا باستخدام 3D Slicer. الزاوية اليمنى العليا يظهر تقديم 3D من الضفيرة المشيمية البطين الثالث. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 9
الشكل 9: التراكيب المجاورة للضفيرة المشيمية البطينية الثالثة. تشمل هياكل الدماغ المجاورة القبو والوريد الدماغي الداخلي والمهاد والجسم الثفنيوالبطين 3 . يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 10
الشكل 10: تجزئة الضفيرة المشيمية للبطين الرابع. يصور هنا وجهات النظر المحورية والإكليلية والسهمية للضفيرة المشيمية البطين الرابع التي تم تقسيمها يدويا باستخدام 3D Slicer. الزاوية اليمنى العليا يظهر عرض 3D من الضفيرة المشيمية البطين الرابع. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 11
الشكل 11: التراكيب المجاورة للضفيرة المشيمية البطينية الرابعة. تشمل هياكل الدماغ المجاورة النخاع المستطيل ، والبونس ، والمخيخ ، والديدان المخيخية ، واللوزتين المخيخية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 12
الشكل 12: تحديد دقة التجزئة والأداء والاتفاق. (أ) تصوير كيفية حساب النسبة المئوية للتداخل باستخدام درجة معامل النرد (DC). (ب) يقيس متوسط المسافة السطحية (avgSD) المسافات بين الأسطح الحدودية للهياكل المحددة من أجل مقارنة التنبؤات بالحقيقة الأرضية ، أو التجزئة اليدوية عبر أو داخل المقيمين لتقييم الموثوقية. (ج) يمكن استخدام معامل الارتباط داخل الفئة (ICC) لتحليل الموثوقية بين المقيمين (القياسات المتكررة لنفس الموضوع) أو داخل المقيم (قياسات متعددة من نفس المقيمين). يتم توفير مثال تمثيلي والمخرجات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الخطوات الحاسمة للبروتوكول
وهناك ثلاث خطوات حاسمة تتطلب اهتماما خاصا عند تنفيذ هذا البروتوكول. أولا ، يعد التحقق من جودة صور التصوير بالرنين المغناطيسي وتباينها أمرا أساسيا لضمان التجزئة الدقيقة. إذا كانت جودة الصورة رديئة للغاية ، أو كان التباين منخفضا جدا أو مرتفعا جدا ، فقد يؤدي ذلك إلى تحديد غير دقيق للضفيرة المشيمية. يمكن ضبط تباين الصورة عن طريق عرض قيمة التدرج الرمادي للصورة أو عن طريق معايرة القيم لتحسين التباين بين نوى المادة الرمادية والمادة الرمادية. ثانيا ، يجب أن يكون المقيمون على دراية بتشريح الضفيرة المشيمية وأن يكون لديهم تدريب متخصص. إذا لم يكن المقيمون على دراية بتشريح الضفيرة المشيمية ومناطق الدماغ المجاورة ، فقد يقومون بتقسيم الضفيرة المشيمية بشكل غير صحيح ، مما يجعل حجم الضفيرة المشيمية غير دقيق. أخيرا ، من المهم تقييم قابلية التكاثر داخل وبين المقيمين للتأكد من أن المقيمين الذين يقومون بالتجزئة اليدوية يمكنهم إعادة إنتاج التجزئة الخاصة بهم ، بالإضافة إلى تجزئة المقيمين الآخرين للضفيرة المشيمية. هذه الأرقام هي أيضا ذات صلة كبيرة عند التحقق من صحة أدوات التجزئة الآلية في مرحلة لاحقة. بالإضافة إلى ذلك ، إذا تم إصلاح مجموعة البيانات ، وإذا كان سيتم استخدام العديد من المقيمين للتجزئة اليدوية ، فمن المستحسن استخدام نفس إعداد النافذة بحيث ينظر المقيمون إلى نفس الصورة بنفس التباين والسطوع. إذا تغير إعداد النافذة بين المقيمين الذين ينظرون إلى نفس الصورة ، فقد يتم تقسيم نفس الصورة بشكل مختلف.

التعديلات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها
يمكن للمستخدمين إجراء بعض التعديلات على هذا البروتوكول. أولا ، يمكن لنسيج الضفيرة المشيمية الموجود في منطقة الحاجز والجزء الجحيمي الأمامي الجانبي من القرن الصدغي ، المجاور للحاجز الحائر ، والقبو ، والحصين ، أن يجعل تجزئة الضفيرة المشيمية صعبة. لمعالجة هذه الصعوبة ، يقترح إجراء تجزئة الضفيرة المشيمية في جميع الأبعاد الثلاثة ، ويتم توفير مرجع (الشكل 6) لتجزئة الضفيرة المشيمية في هذه المناطق المعقدة. ثانيا ، من المهم أيضا معرفة متى يجب إيقاف التجزئة. بالنسبة للضفيرة المشيمية في البطينين الجانبي والثالث ، يمكن استخدام النواة الحمراء كمعلم توقف ، بينما بالنسبة للضفيرة المشيمية البطينية الرابعة ، يمكن استخدام ثقبة Magendie كنقطة توقف. ثالثا ، قد توجد تحديات عند التمييز بين الضفيرة المشيمية و CSF في الجزء الخلفي القاعدي من البطينين الجانبيين. لمعالجة هذا القلق ، يمكن استخدام شدة الإشارة والاعتبارات التشريحية لمساعدة المقيم في اتخاذ قرارات التجزئة المناسبة. رابعا ، إذا تم استخدام صورة منخفضة الدقة ، فمن المستحسن أن تكون أكثر تحفظا في إجراء التجزئة وإعطاء الأولوية لاستخدام التصوير المعزز بالتباين للتحقق من صحة تجزئة الضفيرة المشيمية في هذه المنطقة الزمنية. إذا لم يكن التصوير المحسن بالتباين متاحا ، اقتراح استبعاد هذه المنطقة من عملية التجزئة. ومع ذلك ، إذا تم استخدام صورة عالية الدقة ، فمن المستحسن أن تكون أكثر ليبرالية في إجراء التجزئة. أيضا ، إذا كان من الممكن إجراء ترسيم الحدود بين الضفيرة المشيمية وحمة الدماغ على صورة عالية الدقة للقرن الصدغي ، فلن تكون هناك حاجة إلى صورة معززة بالتباين. خامسا ، يمكن تشغيل 3D Slicer على جهاز كمبيوتر بشاشة تعمل باللمس حيث يمكن استخدام قلم قلم بدلا من الماوس لتحسين تتبع الضفيرة المشيمية. ومع ذلك ، فإن هذا البرنامج غير متوفر حاليا على iPad. أخيرا ، قد تواجه مشكلات تعطل البرامج على بعض أجهزة الكمبيوتر عندما يتم تحديد الضفيرة المشيمية لأكثر من عشرة مواضيع على التوالي. في هذه الحالة ، يمكن أن يؤدي النقر فوق الزر حفظ بشكل متكرر إلى منع فقدان البيانات الناتج عن تعطل البرنامج.

القيود
في حين أن التجزئة اليدوية للضفيرة المشيمية هي المعيار الذهبي للحصول على بيانات حجم دقيقة ، إلا أن هناك العديد من القيود المتعلقة بنوع وجودة الفحص ، بالإضافة إلى تجربة المقيم21. على سبيل المثال، يمكن أن يختلف حجم الضفيرة المشيمية حسب العمر أو حالة المرض، مما قد يؤثر على حجم البطين والضفيرة المشيمية. وبالتالي ، قد تظهر الضفيرة المشيمية صغيرة في الأفراد الشباب الأصحاء ، مما يجعل من الصعب تقسيمها يدويا. قد تتفاقم هذه المشكلة إذا كانت الصورة ذات دقة أضعف (1.2 أو 1.5 مم isovoxel) و / أو تم التقاطها باستخدام ماسح ضوئي للتصوير بالرنين المغناطيسي 1.5 T. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يتأثر التجزئة اليدوية للضفيرة المشيمية بسطوع الصورة وتباينها ، مما يجعل من الصعب تحديد الحدود ، مما يؤدي إلى زيادة الحجم أو التقليل من شأنه. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الضفيرة المشيمية البطينية الثالثة والرابعة عبارة عن هياكل صغيرة ، والتي قد يكون من الصعب تقسيمها بشكل صحيح إذا لم تتوفر صورة عالية الدقة (0.7 أو 0.8 مم إيزوفوكسل). يتمثل أحد القيود المفروضة على استخدام 3D Slicer بدلا من برامج التجزئة اليدوية الأخرى مفتوحة المصدر في عدم القدرة على إجراء تجزئة الصورة في وقت واحد في ثلاثة أبعاد ، وهي ميزة مقدمة من خلال ITK-SNAP51 يمكنها تحسين سرعة تجزئة الصورة للضفيرة المشيمية. بالإضافة إلى ذلك ، يعد التقسيم اليدوي مهمة تستغرق وقتا طويلا ومملة ، مما يجعل دراسة الضفيرة المشيمية في مجموعات كبيرة تضم آلاف أو عشرات الآلاف من الأفراد غير عملية ، مما يسلط الضوء على الحاجة إلى أدوات تجزئة الضفيرة المشيمية التلقائية الدقيقة. أخيرا ، قد يؤدي مجرد حساب voxels الضفيرة المشيمية دون حساب تأثيرات الحجم الجزئي ل CSF أو المادة البيضاء إلى حدوث أخطاء في قياس الحجم.

الأهمية فيما يتعلق بالأساليب الحالية
إن الاعتماد على FreeSurfer لتجزئة الضفيرة المشيمية ، والتي تتميز بدقة ضعيفة ولا تقسم الضفيرة المشيمية البطينية الثالثة والرابعة ، يحد من العمل التأسيسي الذي يمكن إكماله لفهم دور الضفيرة المشيمية بشكل أفضل في الصحة والمرض. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أيضا الاستفادة من تحديد أكثر دقة للضفيرة المشيمية من قبل مجتمع التصوير العصبي لمرض الزهايمر لتقليل تلوث إشارة تاو PET الصدغية الإنسية عن طريق الربط خارج الهدف في الضفيرةالمشيمية 55. في حين أن التعديلات الأولية للتعلم الآلي (GMM) وتقنيات التعلم العميق (3D U-Net و nnU-Net و Axial-MLP 8) على ملصقات الضفيرة المشيمية قد حسنت دقة التجزئة على ملصقات الضفيرة المشيمية المشتقة من FreeSurfer46،48،49 ، للأسف يتم تدريب الطرق وتقييمها فقط في مجموعات بيانات صغيرة ومتجانسة ، ليست متاحة للجمهور ولا أدوات سهلة الاستخدام وغير مكتملة فقط بما في ذلك الضفيرة المشيمية داخل البطينين الجانبيين. أحد التحذيرات هو أنه في وقت إعادة تقديم هذا البروتوكول ، كان هناك مقال نشره Yazdan-Panah et al. حيث أجروا تقسيما يدويا للضفيرة المشيمية البطينية الجانبية باستخدام ITK-SNAP56. استخدموا هذه الصور المجزأة يدويا لتدريب 2-step 3D U-Net وأظهروا متوسط DC يبلغ 0.72 مع الحقيقة الأرضية ، وتفوقت على التقسيمات المستندة إلى FreeSurfer و FastSurfer56. لم يتم إثبات قابلية التعميم على القرارات الأخرى ، والماسحات الضوئية ، والأعمار ، والأمراض المتعددة ، وهي في الواقع غير مرجحة نظرا للتحدي المتمثل في نقل المجال.

التطبيقات المستقبلية
بسبب القيود المذكورة أعلاه ، هناك حاجة إلى بروتوكول لتقسيم الضفيرة المشيمية بدقة. علاوة على ذلك ، من أجل إنشاء أداة تجزئة آلية للضفيرة المشيمية ، والتي قد يكون من الصعب تطويرها بسبب طبيعة هذا الهيكل ، هناك حاجة إلى مجموعة بيانات شاملة مشروحة للضفيرة المشيمية تغطي معلمات مختلفة وتدمجها مع مجموعة من الابتكارات المنهجية لأحدث البرامج مفتوحة المصدر ، FastSurfer42,43، وهو خط أنابيب تصوير عصبي متقدم وقابل للتطوير قائم على التعلم العميق للتجزئة القشرية وتحت القشرية الآلية. وقد تبين أن FastSurferCNN يتفوق على نماذج 3D U-Net و SDNet و QuickNAT للتجزئة القشرية وتحت القشرية لما يقرب من 100 بنية بمتوسط DCs > 8542. وبالتالي ، يمكن استخدام تعليق توضيحي كبير وشامل للضفيرة المشيمية مع FastSurfer ليمتد بشكل كبير إلى (1) بنية ثلاثية الأبعاد مع تقنيات تعزيز داخلية محسنة ، (2) القدرة على التنبؤ أيضا - لأول مرة - بتقديرات الحجم الجزئي مباشرة ، بالإضافة إلى (3) تجزئة المخرجات بدقة أعلى (دقة فائقة) لتنسيق البيانات. يخطط المؤلفون لمزيد من العمل على تكييف وتطوير FastSurfer لإنشاء أداة تجزئة الضفيرة المشيمية عالية الدقة للبطينين الجانبي والثالث والرابع ومشاركتها بشكل مفتوح مع مجتمع البحث.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس للمؤلفين مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgments

تم دعم هذا العمل من قبل جائزة المعهد الوطني للصحة العقلية R01 MH131586 (إلى P.L و M.R) ، R01 MH078113 (إلى M.K) ، ومنحة مؤسسة Sydney R Baer Jr (إلى P.L).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3D Slicer 3D Slicer https://www.slicer.org/ A free, open source software for visualization, processing, segmentation, registration, and analysis of medical, biomedical, and other 3D images and meshes; and planning and navigating image-guided procedures.
FreeSurfer FreeSurfer https://surfer.nmr.mgh.harvard.edu/ An open source neuroimaging toolkit for processing, analyzing, and visualizing human brain MR images
ITK-SNAP ITK-SNAP http://www.itksnap.org/pmwiki/pmwiki.php A free, open-source, multi-platform software application used to segment structures in 3D and 4D biomedical images. 
Monai Package Monai Consortium https://docs.monai.io/en/stable/metrics.html Use for Dice Coefficient and DeepMind average Surface Distance. 
MRI scanner GE Discovery MR750 
Psych Package R-Project https://cran.r-project.org/web/packages/psych/index.html A general purpose toolbox developed originally for personality, psychometric theory and experimental psychology.
R Software R-Project https://www.r-project.org/ R is a free software environment for statistical computing and graphics. 
RStudio Posit https://posit.co/ An RStudio integrated development environment (IDE) is a set of tools built to help you be more productive with R and Python. 
Windows or Apple OS Desktop or Laptop Any company n/a Needed for running the software used in this protocol. 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lun, M. P., Monuki, E. S., Lehtinen, M. K. Development and functions of the choroid plexus-cerebrospinal fluid system. Nature Reviews Neuroscience. 16 (8), 445-457 (2015).
  2. Dani, N., Herbst, R. H., McCabe, C. A cellular and spatial map of the choroid plexus across brain ventricles and ages. Cell. 184 (11), 3056-3074 (2021).
  3. Kaiser, K., Bryj, aV. Choroid plexus: the orchestrator of long-range signalling within the CNS. IJMS. 21 (13), 4760 (2020).
  4. Damkier, H. H., Brown, P. D., Praetorius, J. Cerebrospinal fluid secretion by the choroid plexus. Physiological Reviews. 93, 46 (2013).
  5. Liddelow, S. A. Development of the choroid plexus and blood-CSF barrier. Frontiers in Neuroscience. 9, 00032 (2015).
  6. Gato, A., Alonso, M. I., Lamus, F., Miyan, J. Neurogenesis: A process ontogenically linked to brain cavities and their content, CSF. Seminars in Cell & Developmental Biology. 102, 21-27 (2020).
  7. Spatazza, J., Lee, H. H. C., Di Nardo, A. A. Choroid-plexus-derived Otx2 homeoprotein constrains adult cortical plasticity. Cell Reports. 3 (6), 1815-1823 (2013).
  8. Kim, S., Hwang, Y., Lee, D., Webster, M. J. Transcriptome sequencing of the choroid plexus in schizophrenia. Translational Psychiatry. 6 (11), e964-964 (2016).
  9. Myung, J., Schmal, C., Hong, S. The choroid plexus is an important circadian clock component. Nature Communications. 9 (1), 1062 (2018).
  10. Quintela, T., Furtado, A., Duarte, A. C., Gonçalves, I., Myung, J., Santos, C. R. A. The role of circadian rhythm in choroid plexus functions. Progress in Neurobiology. 205, 102129 (2021).
  11. Gorlé, N., Blaecher, C., Bauwens, E., et al. The choroid plexus epithelium as a novel player in the stomach-brain axis during Helicobacter infection. Brain, Behavior, and Immunity. 69, 35-47 (2018).
  12. Zappaterra, M. W., Lehtinen, M. K. The cerebrospinal fluid: regulator of neurogenesis, behavior, and beyond. Cellular and Molecular Life Sciences. 69 (17), 2863-2878 (2012).
  13. Cardia, E., Molina, D., Abbate, F. Morphological modifications of the choroid plexus in a rodent model of acute ventriculitis induced by gram-negative liquoral sepsis: Possible implications in the pathophysiology of hypersecretory hydrocephalus. Child's Nervous System. 11 (9), 511-516 (1995).
  14. Coisne, C., Engelhardt, B. Tight junctions in brain barriers during central nervous system inflammation. Antioxidants & Redox Signaling. 15 (5), 1285-1303 (2011).
  15. Szmydynger-Chodobska, J., Strazielle, N., Gandy, J. R. Posttraumatic Invasion of monocytes across the blood-cerebrospinal fluid barrier. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 32 (1), 93-104 (2012).
  16. Pellegrini, L., Albecka, A., Mallery, D. L. SARS-CoV-2 infects the brain choroid plexus and disrupts the blood-csf barrier in human brain organoids. Cell Stem Cell. 27 (6), 951-961 (2020).
  17. Bitanihirwe, B., Lizano, P., Woo, T. Deconstructing the functional neuroanatomy of the choroid plexus: an ontogenetic perspective for studying neurodevelopmental and neuropsychiatric disorders. Review at Molecular Psychiatry. , (2022).
  18. Ramaekers, V., Sequeira, J. M., Quadros, E. V. Clinical recognition and aspects of the cerebral folate deficiency syndromes. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 51 (3), 0543 (2012).
  19. Lizano, P., Lutz, O., Ling, G. Association of choroid plexus enlargement with cognitive, inflammatory, and structural phenotypes across the psychosis spectrum. AJP. 176 (7), 564-572 (2019).
  20. Kim, H., Lim, Y. M., Kim, G. Choroid plexus changes on magnetic resonance imaging in multiple sclerosis and neuromyelitis optica spectrum disorder. Journal of the Neurological Sciences. 415, 116904 (2020).
  21. Bannai, D., Lutz, O., Lizano, P. Neuroimaging considerations when investigating choroid plexus morphology in idiopathic psychosis. Schizophrenia Research. 224, 19-21 (2020).
  22. Zhou, G., Hotta, J., Lehtinen, M. K., Forss, N., Hari, R. Enlargement of choroid plexus in complex regional pain syndrome. Scientific Reports. 5 (1), 14329 (2015).
  23. Jacob, F., Pather, S. R., Huang, W. K. Human pluripotent stem cell-derived neural cells and brain organoids reveal SARS-CoV-2 neurotropism predominates in choroid plexus epithelium. Cell Stem Cell. 27 (6), 937-950 (2020).
  24. Yang, A. C., Kern, F., Losada, P. M. Dysregulation of brain and choroid plexus cell types in severe COVID-19. Nature. 595 (7868), 565-571 (2021).
  25. Lin, Y. J., Chiu, N. C., Chen, H. J., Huang, J. Y., Ho, C. S. Cranial ultrasonographic screening findings among healthy neonates and their association with neurodevelopmental outcomes. Pediatrics & Neonatology. 62 (2), 158-164 (2021).
  26. Chang, H., Tsai, C. M., Hou, C. Y., Tseng, S. H., Lee, J. C., Tsai, M. L. Multiple subependymal pseudocysts in neonates play a role in later attention deficit hyperactivity and autistic spectrum disorder. Journal of the Formosan Medical Association. 118 (3), 692-699 (2019).
  27. Levman, J., Vasung, L., MacDonald, P. Regional volumetric abnormalities in pediatric autism revealed by structural magnetic resonance imaging. International Journal of Developmental Neuroscience. 71 (1), 34-45 (2018).
  28. Taft, A. E. A note on the pathology of the choroid plexus in general paralysis. Archives of Neurology & Psychiatry. 7 (2), 177 (1922).
  29. D, S. R. The choroid plexus in organic diseases of the brain and of schizophreina. The Journal of Nervous and Mental Disease. 56, 21-26 (1921).
  30. Bannai, D., Reuter, M., Hegde, R. Linking choroid plexus enlargement with plasma analyte and structural phenotypes in clinical high risk for psychosis: a multisite neuroimaging study. BioRxiv. , (2022).
  31. Egorova, N., Gottlieb, E., Khlif, M. S., Spratt, N. J., Brodtmann, A. Choroid plexus volume after stroke. International Journal of Stroke. 14 (9), 923-930 (2019).
  32. Ricigliano, V. A., Morena, E., Colombi, A. Choroid plexus enlargement in inflammatory multiple sclerosis: 3.0-T MRI and translocator protein PET evaluation. Radiology. 301 (1), 166-177 (2021).
  33. Tadayon, E., Pascual-Leone, A., Press, D., Santarnecchi, E. Choroid plexus volume is associated with levels of CSF proteins: relevance for Alzheimer's and Parkinson's disease. Neurobiology of Aging. 89, 108-117 (2020).
  34. Choi, J. D., Moon, Y., Kim, H. J., Yim, Y., Lee, S., Moon, W. J. Choroid plexus volume and permeability at brain MRI within the Alzheimer Disease clinical spectrum. Radiology. 304 (3), 635-645 (2022).
  35. Althubaity, N., Schubert, J., Martins, D. Choroid plexus enlargement is associated with neuroinflammation and reduction of blood-brain barrier permeability in depression. NeuroImage: Clinical. 33, 102926 (2022).
  36. Senay, O., et al. Choroid plexus volume in individuals with early course and chronic psychosis - a magnetic resonance imaging study. Schizophrenia Bulletin. , (2022).
  37. Fischi, B. FreeSurfer. NeuroImage. 62 (2), 774-781 (2012).
  38. Fischl, B., et al. Cortical folding patterns and predicting cytoarchitecture. Cerebral Cortex. 18 (8), 1973-1980 (2008).
  39. Fischl, B., vander Kouwe, A., Destrieux, C. Automatically parcellating the human cerebral cortex. Cerebral Cortex. 14 (1), 11-22 (2004).
  40. Patenaude, B., Smith, S. M., Kennedy, D. N., Jenkinson, M. A Bayesian model of shape and appearance for subcortical brain segmentation. NeuroImage. 56 (3), 907-922 (2011).
  41. Huo, Y., Xu, Z., Xiong, Y. 3D whole brain segmentation using spatially localized atlas network tiles. NeuroImage. 194, 105-119 (2019).
  42. Henschel, L., Conjeti, S., Estrada, S., Diers, K., Fischl, B., Reuter, M. FastSurfer - A fast and accurate deep learning based neuroimaging pipeline. NeuroImage. 219, 117012 (2020).
  43. Henschel, L., Kügler, D., Reuter, M. FastSurferVINN: Building resolution-independence into deep learning segmentation methods-A solution for HighRes brain MRI. NeuroImage. 251, 118933 (2022).
  44. Jovicich, J., Czanner, S., Han, X. MRI-derived measurements of human subcortical, ventricular and intracranial brain volumes: Reliability effects of scan sessions, acquisition sequences, data analyses, scanner upgrade, scanner vendors and field strengths. NeuroImage. 46 (1), 177-192 (2009).
  45. Zaretskaya, N., Fischl, B., Reuter, M., Renvall, V., Polimeni, J. R. Advantages of cortical surface reconstruction using submillimeter 7 T MEMPRAGE. NeuroImage. 165, 11-26 (2018).
  46. Tadayon, E., Moret, B., Sprugnoli, G., Monti, L., Pascual-Leone, A., Santarnecchi, E. Improving choroid plexus segmentation in the healthy and diseased brain: Relevance for Tau-PET imaging in dementia. Journal of Alzheimer's Disease. 74 (4), 1057-1068 (2020).
  47. Schmidt-Mengin, M., Ricigliano, V. A. G., Bodini, B. Axial multi-layer perceptron architecture for automatic segmentation of choroid plexus in multiple sclerosis. Medical Imaging 2022: Image Processing. SPIE. Išgum, I., Colliot, O. , (2022).
  48. Zhao, L., Feng, X., Meyer, C. H., Alsop, D. C. Choroid plexus segmentation using optimized 3D U-Net. 2020 IEEE 17th International Symposium on Biomedical Imaging (ISBI). IEEE. , 381-384 (2020).
  49. Schmidt-Mengin, M., et al. Axial multi-layer perceptron architecture for automatic segmentation of choroid plexus in multiple sclerosis. arXiv. , (2021).
  50. Egger, J., Kapur, T., Nimsky, C., Kikinis, R. Pituitary adenoma volumetry with 3D Slicer. PLoS ONE. Muñoz-Barrutia, A. 7 (12), 51788 (2012).
  51. Yushkevich, P. A., Piven, J., Hazlett, H. C., et al. User-guided 3D active contour segmentation of anatomical structures: Significantly improved efficiency and reliability. NeuroImage. 31 (3), 1116-1128 (2006).
  52. Dice, L. R. Measures of the amount of ecologic association between species. Ecology. 26 (3), 297-302 (1945).
  53. Aydin, O. U., Taha, A. A., Hilbert, A. On the usage of average Hausdorff distance for segmentation performance assessment: hidden error when used for ranking. European Radiology Experimental. 5 (1), (2021).
  54. Shrout, P. E., Fleiss, J. L. Intraclass correlations: Uses in assessing rater reliability. Psychological Bulletin. 86 (2), 420-428 (1979).
  55. Pawlik, D., Leuzy, A., Strandberg, O., Smith, R. Compensating for choroid plexus based off-target signal in the hippocampus using 18F-flortaucipir PET. NeuroImage. 221, 117193 (2020).
  56. Yazdan-Panah, A., Schmidt-Mengin, M., Ricigliano, V. A. G., Soulier, T., Stankoff, B., Colliot, O. Automatic segmentation of the choroid plexuses: Method and validation in controls and patients with multiple sclerosis. NeuroImage: Clinical. 38, 103368 (2023).

Tags

هذا الشهر في JoVE ، العدد 202 ، الضفيرة المشيمية ، التصوير بالرنين المغناطيسي ، التجزئة اليدوية ، الإنسان ، الحجم ، التصوير العصبي
التجزئة اليدوية للضفيرة المشيمية البشرية باستخدام التصوير بالرنين المغناطيسي للدماغ
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bannai, D., Cao, Y., Keshavan, M.,… More

Bannai, D., Cao, Y., Keshavan, M., Reuter, M., Lizano, P. Manual Segmentation of the Human Choroid Plexus Using Brain MRI. J. Vis. Exp. (202), e65341, doi:10.3791/65341 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter