פרוטוקול זה מתאר את הקציר וההדמיה של קשקשים אלסמואידים של דגי זברה במהלך התחדשות in vivo . בנוסף, תרבות ex vivo של קשקשים אלה עד 7 ימים לאחר הקציר מוצג.
מחלות שלד הן לעתים קרובות מורכבות באטיולוגיה שלהן ומשפיעות על מיליוני אנשים ברחבי העולם. בשל הזדקנות האוכלוסייה, יש צורך בטיפולים חדשים שיוכלו להקל על העומס על מערכות הבריאות. מכיוון שמחלות אלה מורכבות, קשה ויקר למדל במדויק את הפתופיזיולוגיה של העצם בתנאי מעבדה. האתגר של התחום הוא להקים פלטפורמה חסכונית ורלוונטית ביולוגית למידול מחלות עצם שניתן להשתמש בה כדי לבחון תרכובות טיפוליות פוטנציאליות. פלטפורמה כזו צריכה לאפשר באופן אידיאלי הדמיה דינמית של התנהגויות תאים של אוסטאובלסטים בוני עצם ואוסטאוקלסטים משפילי עצם הפועלים בסביבת המטריצה המינרלית שלהם. דגי זברה משמשים יותר ויותר כמודלים בשל זמינותם של כלים גנטיים, כולל קווי כתב טרנסגניים, והעובדה שחלק מרקמות השלד (כולל הקשקשים) נשארות שקופות לבגרות, מה שמאפשר אפשרויות הדמיה דינמיות. מכיוון שלקשקשים של דגי זברה יש גם אוסטאובלסטים וגם אוסטאוקלסטים והם נפוצים מאוד, הם מספקים משאב נגיש וזמין בשפע של יחידות עצם עצמאיות. יתר על כן, לאחר הסרתם, קשקשי דגי הזברה הבוגרים מתחדשים במלואם, ולכן מציעים דרך לחקור את הצמיחה המרחבית-זמנית של רקמה מינרלית in vivo. כאן, אנו מפרטים פרוטוקולים לקציר ומעקב אחר התחדשות הקשקשים. לבסוף, מוצג גם פרוטוקול לתרבית יציבה של קשקשים ex vivo למשך שבוע ולאחר תגובת הריפוי לאחר נזק מבוקר למטריצה המינרלית של הסולם לאורך זמן.
עצם היא רקמת חיבור קשה המהווה חלק עיקרי מהשלד, מאפשרת תנועה ומשמשת כמאגר מינרלים בגוף. על מנת לשמור על עצם בריאה, איזון מעולה בין היווצרות עצם והתפרקות חיוני באמצעות פעילות מצומדת של אוסטאובלסטים (שהם אנבוליים) ואוסטאוקלסטים (אשר סופחים את העצם). איזון זה מופר על ידי הזדקנות או חוסר איזון הורמונלי, המוביל לעתים קרובות למחלות שבריריות עצם כגון אוסטאופורוזיס1. למרות שהתרופות הקיימות אושרו לטיפול במחלות שבריריות עצם, לרבות מהן יש תופעות לוואי; לכן, יש צורך בטיפולים חדשים1. לפיכך, נותר צורך בשפע מקורות של רקמת עצם רלוונטית ביולוגית שניתן להשתמש בהם כדי לבחון תרכובות טיפוליות פוטנציאליות.
באופן מסורתי, מודלים של מכרסמים ומערכות תרביות תאים שימשו לחקר ביולוגיה של העצם. עם זאת, דגי זברה הופכים יותר ויותר למודל בחירה נוסף. למרות שאינם מערכת יונקים, דגי זברה מציעים יתרונות מסוימים לחקר העצם על פני מכרסמים; אלה כוללים את פריותם ואת שקיפותם של הזחלים; אפילו בבגרות, חלק מרקמות השלד, כולל הקשקשים והסנפירים, נשארות שקופות, מה שמאפשר דימות in vivo ברזולוציה גבוהה וזמינות מוגברת של מוטציות שלד 2,3. הן הסנפירים והן הקשקשים של דגי הזברה מסוגלים להתחדשות מלאה לאחר הסרתם. התחדשות השלד ותיקון פציעות של סנפירי דגי זברה נחקרו בהרחבה 4,5, בעוד שקשקשי דגי זברה הם מודל עצם חדש יותר בתחום, אך מציעים יתרונות לתרבית ex vivo 6.
הקשקשים נפוצים מאוד, עם לפחות 300 קשקשים על כל דג המשמשים ככיסוי מגן לדגים. כל סולם הוא צלחת מינרלית קטנה המורכבת מאוסטאובלסטים יוצרי עצם ואוסטאוקלסטים סופחי עצם של מטריצת שלד עשירה בקולגן7. תהליך האוסיפיקציה של קשקשי דגי הזברה ועצמות האדם דורש התמיינות של תאי גזע מזנכימליים לאוסטאובלסטים כדי ליצור את המטריצה המינרלית. קשקשי דגי זברה מציעים יתרון גדול לחקר השלד עם יכולת ההתחדשות החזקה שלהם שניתן להשתמש בה כדי לחקור התחדשות ותיקון עצם. עם זאת, למרות נוכחותם של אוסטאובלסטים ואוסטאוקלסטים, קשקשי דגי זברה חסרים אוסטיאוציטים החשובים לעיצוב מחדש של העצם האנושית ולמכנוסנסציה; המיקום השטחי של הקשקשים אומר שניתן להסיר אותם בקלות עם זוג מלקחיים. עם הסרת הסולם, מתרחשת שרשרת של אירועים, והתחדשות קנה המידה מתחילה 8,9. קיימות אפשרויות צביעה והדמיה שונות כדי להמחיש את הפעילות של אוסטאובלסטים ואוסטאוקלסטים ואת המינרליזציה של הקשקשים, כפי שמוצג באיור 1. בנוסף, הזמינות של שורות כתבים טרנסגניות פלואורסצנטיות רלוונטיות רבות של דגי זברה פירושה שניתן לדמיין דינמיקה של תאים במהלך התחדשות 7,10,11. תהליך זה מאפשר להבין טוב יותר את היווצרות העצם דה נובו על ידי התבוננות בדפוסים המוקדמים של התחדשות אבנית על צלע הדג כדי לחקור מורפולוגיה, פעילות תאית ופרופילים גנטיים של קשקשים מתחדשים אלה. הביולוגיה של היווצרות אבנית והתחדשות אופיינה היטב. חשוב לציין, קשקשים יכולים להראות יכולת ניבוי טובה עבור תרכובות רלוונטיות מבחינה טיפולית12 וטיפול בדגים עם גלוקוקורטיקואידים מוביל לסולם שמתחדש כדי להראות פנוטיפים אוסטיאופורוטיים13. התעתיק של סולמות ההתחדשות מראה כי גנים המופעלים בהתחדשות אבנית מועשרים עבור אלה הקשורים למחלות שלד אנושיות, מה שמדגים עוד יותר את הרלוונטיות שלהם כמערכת מודל 6,14.
לבסוף, קשקשים אלה יכולים להיות בתרבית ex vivo עד 7 ימים. בהשוואה לתרביות קו תאים המורכבות בדרך כלל מסוג תא יחיד, תרבית בקנה מידה Ex vivo מספקת הזדמנויות מחקר עצם במבחנה בסביבתה הטבעית המכילה הן אוסטאובלסטים והן אוסטאוקלסטים עם המטריצה החוץ תאית הטבעית שלה 8,12,15,16.
תרבית קנה המידה גם מאפשרת לנו לבצע בדיקות סמים עבור מטרות אוסטאואנאבוליות חדשות. שפע הקשקשים על הדג פירושו שניתן למלא לפחות שתי צלחות של צלחת 96 בארות מדג אחד בלבד, מה שמאפשר סינון מורכב בפורמט רב בארות שבו כל באר מכילה קנה מידה אחד יחד עם נישה טבעית של תאים. בנוסף, מכיוון שהמאזניים דקים, ספיגת התרופות צפויה12. לסיכום, לקשקשים האלסמואידים של דגי הזברה יש פוטנציאל גדול במחקר השלד והם יכולים לעזור לנו לקבל תובנה נוספת לגבי האירועים התאיים במהלך היווצרות ותיקון העצם. כאן, אנו מתארים פרוטוקולים לקציר קשקשים כדי לעקוב אחר התחדשות in vivo ותרבות את המאזניים ex vivo.
הקשקשים האלסמואידים של דגי הזברה, כמודל חדשני לחקר השלד, טומנים בחובם פוטנציאל רב לסייע להבנתנו את תחזוקת העצם, התחדשות ותיקון פציעות. שפע הקשקשים על דגים מאפשר סינון תרכובות בתפוקה בינונית עד גבוהה תוך הפחתת מספר בעלי החיים בשימוש והגבלת השונות התוך-אישית. כאן, פרוטוקולים להתחדשות בקנה מידה ותרבות בקנה מידה ex vivo מוצגים כדי ללמוד התחדשות ותיקון.
יש לקחת בחשבון כמה שלבים קריטיים בעת ביצוע פרוטוקול זה. הסרה זהירה של הקשקשים היא חיונית, במיוחד כאשר משתמשים בקו כתב מהונדס כדי להגביל את ההפרעה לאוכלוסיית התאים הנגרמת על ידי הקציר. אם רוצים לערוך השוואות לקשקשים אונטוגנטיים, יש לוודא שהאזור אינו מכיל קשקשים המתחדשים באופן ספונטני (דבר שיכול להתרחש באופן טבעי לאורך חיי הדגים). ודא שהסביבה והציוד סטריליים לתרבית ex vivo כדי להשיג הישרדות תאים אופטימלית וזיהום מינימלי בתרבית.
בהתאם לשאלת המחקר הספציפית, ניתן לבצע התאמות לפרוטוקול, כגון שילוב קווי כתב טרנסגניים שונים כדי לדמיין סוגי תאים אחרים של פרופילי ביטוי גנים במהלך התחדשות ותיקון11,14.
הטווח הרחב של הכתמים שניתן לבצע על המאזניים פירושו שעבור כל תרכובת או מצב נבדק ניתן להסתכל על השפעותיו על העצם מזוויות שונות; בעוד שכתבי SP7/OSX יכולים להראות מספרי אוסטאובלסטים, צביעת ALP יכולה לדמיין פעילות אוסטאובלסט, צביעת TRAP יכולה לדמיין פעילות אוסטאוקלסט, צביעה חיה בצבע ירוק קלצין יכולה לתייג עצם חדשה שנוצרה וצביעת אליזרין אדומה או פון קוסה יכולה להראות מינרליזציה בקנה מידה. פעילות לוציפראז לכימות אוסטאובלסטים יכולה לשמש גם12. בשילוב עם טכניקות צביעה אלה, ניתן ללמוד את התרומה היחסית של אוסטאובלסטים ואוסטאוקלסטים לאפקט עצם נתון. קשקשים חסרים אוסטיאוציטים, הנפוצים בעצמות יונקים והם הגורמים העיקריים לתגובה מכנו-חושית בעצמות; תיקון קנה מידה והתחדשות במודל זה מונעים בעיקר על ידי אוסטאובלסטים עם עיצוב מחדש לאחר מכן על ידי אוסטאוקלסטים 8,9. חשוב לציין כי השונות מתרחשת בין אנשים וקבוצות גיל20. כדי למזער זאת, שטח הקציר בקנה מידה חייב להיות קבוע, מכיוון שמיקומים שונים יכולים ליצור מורפולוגיות קנה מידה שונות, ודגים מאותן קבוצות אחים משמשים כך שהגיל והגודל יהיו עקביים. עם זאת, מכיוון שניתן לקצור קשקשים מרובים לכל דג, ניתן לבצע יותר ניסויים באמצעות פחות דגים, מה שמפחית את השונות התוך-אישית.
לסיכום, פרוטוקולים אלה מראים טכניקות ניסיוניות שניתן ליישםעל סולמות אונטוגנטיים ומתחדשים. לסיכום, קשקשים אלסמואידים מראים פוטנציאל גדול כמודל שלד לסייע בהבנת היווצרות העצם ותיקונה; ויסייע להפחית את השימוש בבעלי חיים לבדיקת תרכובת אוסטאואנאבולית בתפוקה גבוהה.
The authors have nothing to disclose.
ברצוננו להודות למתיו גרין מיחידת השירות לבעלי חיים על גידול דגים ולקייטי ג’פסון ממרכז וולפסון לדימות ביולוגי. CLH, DB ו-QT מומנו על ידי Versus Arthritis (CLH Senior Fellowship 21937, DB and QT Intermediate Fellowship 22044), RR מומן על ידי (NHMRC APP1158758). עבודה זו נתמכה גם על ידי מענק BBSRC (BB/T001984/1).
10x Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 70013-016 | PBS |
12-Multichanel Pipette | Sartorius | 728230 | Multichanel pipette, Proline Plus Mechanical Pipette, 12 Channel, , 10-100 µL. |
15 mL Centrifuge tubes | Corning | 430791 | Centrifuge tube, CentriStar Cap, Polypropylene, RNAse/DNAse free, Non-pyrogenic |
4% Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | PFA |
Alizarin red | Sigma | A5533 | |
Amphotericin B | ThermoFisher Scientific | 15290026 | |
Bemis Parafilm M Laboratory Wrapping Film | Fisher Scientific | 11772644 | Sealing film |
Calcein powder | Sigma | C0875 | |
Calcium Chloride | Thermo Scientific | L13191.30 | |
Corning 96 well plate | Corning | 3596 | 96-well-plate, Clear, Flat Bottom Polystyrene TC-treated Microplates, Individually Wrapped, with Lid, Sterile |
Cover slips | VWR | 631-0146 | |
Cytiva HyClone Iron-Supplemented Calf Serum | Fisher Scientific | SH30072.03 | |
Danieau | Sigma | ||
DMEM | Life Technologies | 31053 | |
Falcon tubes | Corning | 430828 | |
Fast Red Violet LB stock solution | Sigma | F3381 | |
GlutaMAX Supplement | Life Technologies | 35050 | |
Glycerol | Sigma | 81381 | |
Hepes | Sigma | H3375 | |
Incubator | X | Incubator, Set up to 28 °C and 5% CO2 | |
IncuCyte Zoom | Sartorious | X | Live Imaging System, Set up to 28 °C and 5% CO2 |
Leica stereomicroscope | X | Sterioscope | |
L-tartrate dibasic dihydrate | Sigma | 228729 | |
Mgcl2 | BDH Laboratory Sup. | 261237T | |
Microscope slides | Epredia | J2800AMNZ | |
Mowiol 4-88 | Sigma | 9002-89-5 | |
MQ water | X | ||
N, N’-dimethylformamide (Merck: D4451) | Merck | D4451 | |
NaCL | Fisher Chemical | S/3120/53 | |
Naphthol AS-MX phosphate | Merck | N4875 | |
NBT/BCIP solution | Sigma | #000000011681451001 | |
Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140 | |
Petri Dishes | Corning | 430589 | 35 mm sterile Petri dish, Non-treated, Nonpyrogenic, Polystyrene. |
Reagent Reservoir | Startub | E2310-1025 | 25mL Reagent Reservoir |
Silver nitrate | Sigma | 209139 | |
Sodium acetate | Sigma | 52889 | |
Sodium beta-glycerophosphate pentahydrate | Thermo Scientific | L03425.14 | |
Sodium pyruvate solution | Sigma | S8636 | |
Sodium tartrate | Sigma | S4797 | |
Sodium thioculphate | Sigma | 563188 | |
Tricaine methane sulfonate (MS222) | Sigma | E10521 | |
Tris | Sigma | 252859 | |
Triton-X100 | Sigma | T8787 | |
Tween-20 | SLS | CHE3852 | |
Tweezers Number 5 | Dumont | 500341 | Tweezer, INOX, biology grade |
Zebrafish tanks | Tecniplast | ZB30BCP | 3.5 L – 28 cm x 11 cm x 17 cm |
Zebrafish tanks | Tecniplast | ZB30BCP | 1 L – 28 cm x 7 cm x 11 cm |