Summary
Ce protocole présente une approche trans-sclérale guidée par la vision transpupillaire pour administrer en toute sécurité et avec précision des greffons cellulaires sous-rétiniens, avec un faible taux de complications chirurgicales, chez des souris receveuses avec ou sans dégénérescence rétinienne.
Abstract
La transplantation de cellules photoréceptrices et de cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes (EPR) constitue un traitement potentiel pour les maladies de dégénérescence rétinienne. La transplantation sous-rétinienne de cellules de donneurs thérapeutiques chez des souris receveuses est difficile en raison de l’espace chirurgical limité permis par le petit volume de l’œil de la souris. Nous avons développé une plateforme de transplantation chirurgicale trans-sclérale avec guidage direct de la vision transpupillaire pour faciliter l’administration sous-rétinienne de cellules exogènes chez des souris receveuses. La plate-forme a été testée à l’aide de suspensions de cellules rétiniennes et de feuillets rétiniens tridimensionnels prélevés sur des souris Rho :: EGFP riches en bâtonnets et OPN1LW-EGFP riches en cônes ; Souris NRL-/- , respectivement. L’analyse des cellules vivantes et mortes a montré une faible mortalité cellulaire pour les deux formes de cellules donneuses. Des greffes de rétine ont été introduites avec succès dans l’espace sous-rétinien d’un modèle murin de dégénérescence rétinienne, Rd1/NS, avec un minimum de complications chirurgicales détectées par l’imagerie ophtalmoscopique confocale multimodale à balayage laser (cSLO). Deux mois après la transplantation, la coloration histologique a mis en évidence une maturation avancée des greffons rétiniens en bâtonnets et cônes « adultes » (par expression robuste de Rho ::EGFP, S-opsine et OPN1LW :EGFP, respectivement) dans l’espace sous-rétinien. Ici, nous fournissons une plate-forme chirurgicale qui peut permettre une administration sous-rétinienne très précise avec un faible taux de complications chez les souris receveuses. Cette technique offre une précision et une relative facilité d’acquisition des compétences. En outre, la technique pourrait être utilisée non seulement pour des études de transplantation de cellules sous-rétiniennes, mais aussi pour d’autres études thérapeutiques intraoculaires, y compris les thérapies géniques.
Introduction
La transplantation de photorécepteurs et de cellules épithéliales pigmentées rétiniennes (EPR) offre un traitement potentiel pour les maladies dégénératives de la rétine telles que la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA), la maladie de Stargardt et la rétinite pigmentaire (RP)1,2,3,4,5,6,7 . Pour reconstituer ou remplacer les photorécepteurs malades et les cellules RPE dans les rétines dégénérées, l’espace sous-rétinien est particulièrement bien adapté comme cible de transplantation compte tenu de l’anatomie laminaire des photorécepteurs hôtes et des cellules RPE. Bien que les procédures chirurgicales de transplantation sous-rétinienne de cellules RPE soient bien établies chez les grands animaux 8,9,10 et les essais cliniques11,12,13, les défis auxquels est confrontée la recherche sur la transplantation de photorécepteurs comprennent la rareté des modèles animaux transgéniques de grande taille et la compréhension limitée des mécanismes de synaptogenèse en profondeur impliqués dans la transplantation neuronale, entre autres préoccupations. Les modèles murins génétiquement modifiés, avec différents types de mutants de la dégénérescence rétinienne, fournissent des outils utiles pour étudier les mécanismes moléculaires dans le contexte de la transplantation et orienter le développement de thérapies de remplacement cellulaire efficaces au stade préclinique 14,15,16,17,18.
Contrairement à l’œil relativement grand et au petit cristallin chez les grands animaux (par exemple, le porc, le singe), la petite taille et le grand cristallin des yeux de souris en font des cibles chirurgicales difficiles, en particulier pour la transplantation sous-rétinienne dans laquelle les contraintes d’espace physique et la visualisation directe limitée sont les principaux défis.
Les approches actuelles peuvent être classées en trois grands types en fonction de la voie d’injection. Tout d’abord, dans le cas de l’approche transcornéenne, l’aiguille est passée à travers la cornée dans la cavité vitréenne, puis dans l’espace sous-rétinien19,20. Cette méthode permet d’obtenir une administration sous-rétinienne réussie, mais les dommages aux structures des segments antérieurs (c’est-à-dire la cornée, l’iris, le cristallin) constituent un risque majeur qui peut gravement entraver l’analyse in vivo en aval. Deuxièmement, dans le cas de l’approche trans-vitréenne, l’aiguille pénètre dans la cavité vitréenne par la pars plana, puis dans l’espace sous-rétinien21. Cette approche est largement utilisée chez les humains et les grands animaux. Cependant, il existe un risque potentiel d’endommagement du cristallin chez les rongeurs, car le cristallin occupe un plus grand volume relatif de la cavité vitréenne. Notamment, les protocoles transcornéens et transvitréens nécessitent la pénétration de la rétine neurale pour atteindre l’espace sous-rétinien, ce qui endommage la rétine de l’hôte et augmente le risque de reflux des cellules donneuses à travers le trou de pénétration. Troisièmement, dans le cas de l’approche trans-sclérale22,23, l’aiguille pénètre à travers le complexe scléral-choroïde-RPE et pénètre directement dans l’espace sous-rétinien. Cette approche réduit le risque de traumatisme des structures du segment antérieur et de la cavité vitréenne. Cependant, sans visualisation directe du fond d’œil de l’hôte, les échecs chirurgicaux causés par des ponctions transrétiniennes, un décollement de l’EPR et une hémorragie choroïde sont couramment détectés.
Ici, nous avons développé une plate-forme chirurgicale trans-sclérale avec guidage direct de la vision transpupillaire pour la transplantation sous-rétinienne chez des receveurs murins. Validation de la viabilité des feuillets rétiniens et des suspensions cellulaires des donneurs avant transplantation. L’administration réussie des cellules donneuses dans l’espace sous-rétinien d’un modèle murin de dégénérescence de la rétine a été confirmée. Seules de rares complications chirurgicales ont été détectées. De plus, les photorécepteurs transplantés dans les greffons rétiniens ont survécu et ont montré des signes de maturation avancée dans des bâtonnets et des cônes « adultes » deux mois après la transplantation.
Protocol
Toutes les expériences sur les animaux ont été menées conformément au Guide des National Institutes of Health pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire (NIH Publications n° 8023, révisé en 1978) et à la Déclaration de l’ARVO pour l’utilisation d’animaux dans la recherche ophtalmique et visuelle. Toutes les procédures ont été approuvées par le Comité de protection et d’utilisation des animaux de l’Université Johns Hopkins (approbation M021M459).
1. Animaux
- Utiliser des souris Rho ::EGFP (âgées de P3 à P6) comme donneurs de suspensions de cellules rétiniennes.
REMARQUE : Cette souche était un cadeau aimable du Dr T. Wensel, Baylor College of Medicine. - Utiliser les souris OPN1LW-EGFP/NRL-/- 14 (âgées de P3) comme donneuses de feuillets rétiniens.
- Utiliser des souris adultes atteintes de dégénérescence rétinienne Rd1/NS présentant un déficit immunitaire (l’un ou l’autre sexe) comme receveurs.
- Hébergez toutes les souris dans des cages selon un cycle lumière-obscurité de 12 h 12 avec accès à l’eau et à la nourriture au besoin.
2. Prélever la rétine neurale (Figure 1)
REMARQUE : Toutes les étapes suivantes ont été effectuées dans des conditions stériles. Les informations sur les fournisseurs d’outils et de produits de recherche sont fournies dans le tableau des matériaux.
- Préparation des souris donneuses : Euthanasier les souris donneuses présentant une surdose de dioxyde de carbone et confirmer l’euthanasie avec luxation cervicale.
- Isolez les globes oculaires des souris. Pour ce faire, suivez les étapes ci-dessous.
- Ouvrez soigneusement les paupières des chiots à l’aide de micro-ciseaux pour exposer le globe oculaire.
- Utilisez une pince lisse pour saisir le nerf optique et retirez le globe oculaire avec une paire de pinces.
- Isolez la rétine neurale
REMARQUE : Cette étape est effectuée sous un microscope à dissection.- Inciser un trou au centre de la cornée à l’aide d’une aiguille stérile de 25 G.
- Coupez la cornée, à travers le trou, en deux et agrandissez l’incision jusqu’à la sclérotique et l’EPR, puis retirez la sclérotique et l’EPR.
- Utilisez une pince micro-dentée pour retirer délicatement le cristallin et le vitré afin d’isoler la rétine neurale.
- Passez à la section 3 pour préparer la suspension rétinienne du donneur ou à la section 4 pour préparer le feuillet rétinien du donneur, au besoin.
3. Préparer la suspension rétinienne du donneur (Figure 1)
- Incuber la rétine neurale dans une solution de papaïne à 37 °C pendant 20 à 30 minutes jusqu’à ce qu’aucun amas cellulaire ne soit détecté.
REMARQUE : Pipeter doucement le mélange cellulaire 15x toutes les 10 minutes. - Suivez les instructions du fabricant du kit de dissociation de la papaïne pour prélever des cellules individuelles.
4. Préparer les feuilles rétiniennes du donneur (Figure 1)
REMARQUE : Cette étape suit la section 2 et est réalisée sous un microscope à dissection.
- Placez la coupelle de rétine neurale isolée dans une boîte de Pétri de 35 mm avec du PBS stérile préréfrigéré.
- Utilisez des micro-ciseaux pour couper la cupule de la rétine neurale en plusieurs feuilles rétiniennes (environ 1 mm x 2 mm).
5. Préparez les souris receveuses
- Anesthésier les souris receveuses par injection intrapéritonéale de kétamine (100 mg/kg de poids corporel) et de chlorhydrate de xylazine (20 mg/kg de poids corporel).
- Confirmez le plan chirurgical de l’anesthésie en assurant la perte des réflexes de clignement des yeux et de la douleur, de la respiration régulière et de la respiration.
- Évaluez la profondeur de l’anesthésie par l’absence de réponse au pincement de la queue ou au retrait des réflexes de la pédale.
- Vérifiez toujours la profondeur de l’anesthésie pendant la procédure opératoire et ajustez la profondeur de l’anesthésique si l’animal réagit à la douleur. Gardez les souris sur la table d’opération préchauffée pour éviter l’hypothermie.
- Dilater les pupilles receveuses avec des gouttes ophtalmiques de tropicamide à 1 % (en poids/vol) 5 min avant la chirurgie. Une pupille bien dilatée peut faciliter la visualisation transpupillaire au microscope opératoire.
- Désinfectez l’œil de la souris opératoire et les tissus oculaires environnants avec de la povidone iodée, lavez-les avec du PBS stérilisé.
- Appliquez du chlorhydrate de proparacaïne à 0,5% sur l’œil de la souris pour l’analgésie.
6. Transplantation sous-rétinienne de greffons rétiniens (Figure 2)
REMARQUE : Toutes les étapes suivantes ont été effectuées dans des conditions aseptiques. Les outils chirurgicaux ont été autoclavés (utilisez des plateaux d’instruments pour protéger les pointes d’outils et retirez le piston des micro-seringues pour éviter qu’elles ne se coincent dans la lumière). Les informations sur les fournisseurs d’outils et de produits de recherche sont fournies dans le tableau des matériaux.
- Paracentèse de la chambre antérieure : Pénétrer la cornée périphérique dans la chambre antérieure à l’aide d’une aiguille à insuline pour permettre à l’humeur aqueuse de s’échapper passivement, afin d’éviter les pics de pression intraoculaire (PIO) pendant la transplantation.
REMARQUE : Une paracentèse réussie est indiquée par l’efflux d’humeur aqueuse à travers le trou de la cornée. - Placez une goutte d’hyaluronate de sodium et une lamelle en verre (5 mm de diamètre) sur le dessus de la cornée pour permettre la visualisation transpupillaire du fond d’œil sous l’endoscope chirurgical.
- Utilisez une pince dentée pour exposer le locus d’injection (limbe post-cornéen de 1 mm) en pressant la paroi oculaire supérieure ou inférieure, comme l’exige l’expérience, vers le centre de la vision transpupillaire.
- Utilisez une aiguille de micro-injection pour pénétrer perpendiculairement dans la sclérotique.
- Tournez soigneusement la direction de l’aiguille tangentiellement pour permettre une pénétration complète du complexe sclérotique-choroïde-EPR dans l’espace sous-rétinien.
- Insérez l’aiguille tangentiellement pour accéder au locus d’injection terminal.
REMARQUE : Vérifier le positionnement complet du biseau de l’aiguille par guidage de la vision transpupillaire. Utilisez les vaisseaux rétiniens superficiels comme référence anatomique pour un positionnement précis de l’aiguille dans l’espace sous-rétinien. - Injecter des greffes de rétine
REMARQUE : La présence de petites bulles préchargées dans la seringue peut faciliter la validation du positionnement sous-rétinien précis des cellules du donneur. Une PIO élevée résultant de l’injection sous-rétinienne augmente le risque de reflux cellulaire du donneur.- Si la cornée devient trouble24,25, un indicateur d’une PIO élevée, maintenez l’aiguille dans l’espace sous-rétinien pendant au moins 3 minutes jusqu’à ce que la cornée se dégage, un indicateur que la PIO a suffisamment diminué.
REMARQUE : Dans de rares cas, la PIO peut prendre plus de temps à se normaliser, et il est recommandé de garder l’aiguille en place jusqu’à ce que la clarté de la cornée soit restaurée, même si cela prendrait 8 à 10 minutes. Observer au microscope chirurgical pour éviter d’endommager les structures rétiniennes.
- Si la cornée devient trouble24,25, un indicateur d’une PIO élevée, maintenez l’aiguille dans l’espace sous-rétinien pendant au moins 3 minutes jusqu’à ce que la cornée se dégage, un indicateur que la PIO a suffisamment diminué.
- Saisissez le bord du trou d’injection à l’aide d’une pince à micro-dents et retirez rapidement l’aiguille.
REMARQUE : Les critères pour une administration sous-rétinienne réussie d’une suspension et d’un feuillet de cellules rétiniennes sont une tache constante et une feuille blanche visible dans l’espace sous-rétinien, respectivement. - Nettoyez la zone chirurgicale de l’œil avec des larmes artificielles et appliquez une pommade si nécessaire.
- Administration post-opératoire
- Placez les souris transplantées dans une cage de récupération propre et préchauffée (37 °C) et surveillez attentivement l’absence de détresse.
- Appliquez une goutte de chlorhydrate de proparacaïne topique à 0,5 % sur l’œil chirurgical 2 à 3 fois en cas de détresse.
- Remettez les souris dans la cage de la maison une fois qu’elles sont complètement alertes et mobiles. Placez un petit nombre de granulés alimentaires et un gobelet de gel dans la cage si les souris ont du mal à atteindre la trémie alimentaire.
REMARQUE : Gardez la surface de l’œil humide jusqu’à ce que l’anesthésie se dissipe pour éviter la formation de cataracte.
7. Imagerie ophtalmoscopie confocale multimodale par laser à balayage (cSLO)
- Deux mois après la transplantation, anesthésier les souris Rd1/NS receveuses (n = 5) par injection intrapéritonéale de kétamine (100 mg/kg de poids corporel) et de chlorhydrate de xylazine (20 mg/kg de poids corporel) pour l’imagerie.
- Dilater les pupilles avec des gouttes ophtalmiques de tropicamide à 1 % (en poids/vol).
- Réalisez une imagerie multimodale standard à 55° à l’aide du système d’ophtalmoscope laser à balayage confocal cSLO22.
- Obtenez des images IRM et SD-OCT à l’aide de 30 images de moyenne ART.
8. Coloration histologique
- Préparer des lames congelées d’yeux de souris Rd1/NS transplantés comme indiqué précédemment 14.
- Bloquez et pénétrez les lames congelées de rétines transplantées à l’aide d’un mélange de sérum de chèvre à 5 % et de Triton X100 à 1 % dans du PBS.
- Incuber les échantillons avec des anticorps primaires pendant la nuit à 4 °C et rincer dans du PBS (5 min, 3x). Les principaux anticorps sont les anticorps anti-GFP-FITC de chèvre (1 :200), les anti-récupérine de lapin (1 :1000) et les anticorps anti-S-opsine de lapin (1 :500).
- Incuber les échantillons avec un anticorps secondaire (anti-lapin de chèvre Cy3, 1 :500) et contre-coloré avec du DAPI.
REMARQUE : Les fournisseurs d’anticorps primaires et secondaires sont énumérés dans le tableau des matériaux.
Representative Results
Les greffons rétiniens sont livrés avec succès dans l’espace sous-rétinien et ont survécu in vivo.
La performance de notre plateforme de transplantation sous-rétinienne a été évaluée chez des souris receveuses de Rd1/NS âgées de 6 à 8 semaines lorsque leurs rétines résiduelles étaient sévèrement amincies en raison de la dégénérescence presque complète de la couche nucléaire externe (ONL). Compte tenu de la fragilité de la rétine, de la rareté des photorécepteurs coniques et de la viabilité relativement faible des cellules en suspension par rapport aux donneurs de feuilles, les souris riches en cônes (OPN1LW-EGFP ; NRL-/-)14 ont été utilisés comme sources de feuilles rétiniennes de donneurs et des souris riches en bâtonnets (Rho ::EGFP) comme donneurs pour les suspensions cellulaires. Des suspensions de cellules rétiniennes riches en cônes et en bâtonnets ont été introduites avec succès dans l’espace sous-rétinien de toutes les souris receveuses à l’aide de notre plateforme chirurgicale, comme le confirment les taches sous-rétiniennes et le drap blanc observés à l’aide de la visualisation transpupillaire immédiatement après l’injection. Deux mois après la transplantation, une imagerie multimodale de cSLO a été réalisée pour suivre les états des greffons rétiniens in vivo. L’OCT en coupe transversale a montré que les greffons rétiniens survivaient dans l’espace sous-rétinien et reconstituaient l’ONL chez toutes les souris receveuses (Figure 3A). L’imagerie infrarouge n’a détecté aucune cataracte évidente dans tous les yeux transplantés (Figure 3B). D’autres complications chirurgicales, y compris une hémorragie, ont été rarement détectées dans les rétines transplantées (n = 1/10 des yeux) par imagerie par réflectance multicolore deux mois après la transplantation (Figure 3C). Nous avons effectué une coloration histologique afin d’évaluer plus en détail la survie et l’étendue de la maturation des photorécepteurs dans les greffons rétiniens. Des photorécepteurs coniques abondants exprimant OPN1LW :EGFP et S-opsine dans les feuillets rétiniens transplantés ont été observés. De même, les suspensions de cellules rétiniennes transplantées ont montré une forte proportion de photorécepteurs Rec+ in vivo, y compris de nombreux bâtonnets Rho ::EGFP+ (Figure 3D). Les souris témoins non transplantées ont montré une dégénérescence sévère de l’ONL avec des photorécepteurs à cône résiduel clairsemé (Rec+). Aucun signal EGFP n’a été détecté dans la rétine Rd1/NS non transplantée (Figure 3D).
Figure 1 : Schéma de la collecte de la feuille rétinienne du donneur et des suspensions cellulaires. Schémas montrant les étapes clés de la collecte de suspensions et de feuillets de cellules rétiniennes sur des souris Rho ::EGFP donneuses. L’imagerie en fond clair et en fluorescence a montré des images représentatives de cellules dissociées et d’une feuille disséquée isolée de souris Rho ::EGFP. Ligne pointillée jaune : marge incisionnelle. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Procédures de transplantation sous-rétinienne de feuillets rétiniens et de suspension cellulaire chez les souris Rd1/NS. (A) Images schématiques de la préparation des souris receveuses. (B) Principales procédures chirurgicales et diagrammes correspondants montrant la transplantation sous-rétinienne de suspensions et de feuilles de cellules rétiniennes. Les étapes chirurgicales comprennent : 1. pénétrer dans la chambre antérieure ; 2. Déposez l’hyaluronate de sodium sur la cornée, puis montez la lamelle sur le dessus de l’hyaluronate de sodium pour faciliter la visualisation transpupillaire ; 3. pénétrer dans les couches externes de la paroi de l’œil (complexe sclérotique-choroïde-EPR). Les angles de pénétration de l’aiguille se trouvent dans le panneau supérieur droit de l’illustration ; 4. Insérez l’aiguille d’injection ; 5. Injecter des greffons. Des images représentatives montrent l’administration réussie de suspensions de cellules rétiniennes et d’un feuillet chez deux receveurs individuels, respectivement. Astérisque : tête du nerf optique ; Pointes de flèches rouges : vaisseau sanguin rétinien ; Pointe de flèche blanche : pointe d’aiguille pénétrée ; Flèches blanches : suspensions ou feuilles rétiniennes greffées. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Réalisation réussie de greffons rétiniens dans l’espace sous-rétinien et survie in vivo. (A) Des images SD-OCT représentatives ont montré la distribution sous-rétinienne des feuillets rétiniens transplantés et des suspensions cellulaires chez deux souris Rd1/NS individuelles, respectivement. Des souris Rd1/NS non transplantées ont été prélevées comme témoins. La région d’intérêt (ROI) est indiquée par des cases en pointillés jaunes sur les images infrarouges (IR) du fond d’œil. La rétine interne est désignée comme des lames de la couche de cellules ganglionnaires de la rétine (RGC), de la couche plexiforme interne (IPL) et de la couche nucléaire interne (INL). (B) L’image infrarouge (IR) représentative d’une souris Rd1/NS transplantée n’a montré aucune cataracte à travers la pupille dilatée. (C) Images représentatives de réflectance multicolore (IRM) d’yeux Rd1/NS transplantés et non transplantés. Les yeux transplantés n’ont présenté aucune complication chirurgicale évidente, y compris une hémorragie. (D) Coloration immunohistochimique (IHC) de souris Rd1/NS transplantées (feuille et suspension) et non transplantées (témoin). Les données ont montré de nombreux photorécepteurs greffés exprimant des marqueurs spécifiques de photorécepteurs (Rec), de bâtonnets (Rho ::EGFP), de cônes L/M (OPN1LW :EGFP) et de cônes S (S-opsine) deux mois après la transplantation. Les lamelles rétiniennes réceptrices ont été identifiées par coloration DAPI (bleu). Les greffes de rétine ont été identifiées par le rapporteur de l’EGFP (en vert). La rétine des souris non transplantées a montré une dégénérescence sévère de l’ONL avec des photorécepteurs à cône résiduel clairsemé (Rec+). Aucun signal EGFP n’a été détecté dans les rétines Rd1/NS non transplantées. Des images agrandies ont été présentées sur les deux panneaux de droite. Abréviations : RGC : couche de cellules ganglionnaires rétiniennes ; INL : couche nucléaire interne. ONL : couche nucléaire externe. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Discussion
La transplantation sous-rétinienne chez la souris est techniquement difficile en raison de la petite taille des yeux de la souris. Dans cette étude, nous avons développé une plateforme simple et reproductible pour la transplantation sous-rétinienne chez des souris receveuses. La plate-forme permet une cohérence dans la protection de la viabilité du donneur, une administration sous-rétinienne réussie et assure un faible taux de complications.
La technique de transplantation sous-rétinienne décrite ici a été développée sur la base de la voie trans-sclérale, où l’aiguille d’injection pénètre dans les couches externes (complexe sclérotique-choroïde-EPR) du mur de l’œil. Par rapport à l’approche trans-cornéenne19,20 et trans-vitréenne21,26,27, l’approche trans-sclérale pénètre directement dans l’espace sous-rétinien sans pénétrer les structures du segment antérieur et la rétine neurale, permettant ainsi une transplantation inoffensive et réduisant le risque de reflux des cellules du donneur par le trou pénétrant. L’un des défis de l’approche transsclérale est de s’assurer que la pointe de l’aiguille se propage le long de l’espace sous-rétinien avant d’arriver au site d’administration terminal, tout en évitant la perturbation potentielle de l’EPR et des couches choroïdes adjacentes. Il est difficile d’atteindre ces objectifs par une approche trans-sclérale traditionnelle28,29 sans guidage visuel direct. Dans cette étude, nous avons développé une plate-forme transpupillaire guidée par la vision à l’aide d’un microscope chirurgical et d’un éclairage externe de la rétine pour faciliter la transplantation sous-rétinienne dans des modèles murins. La plateforme permet à l’opérateur de suivre le processus chirurgical et l’état de la rétine des receveurs en fournissant une visualisation en temps réel du fond d’œil du receveur au microscope chirurgical. Par exemple, la pénétration réussie du complexe sclérotique-choroïde-EPR peut être simplement validée par une réflectance relativement brillante de la pointe de l’aiguille via une visualisation transpupillaire. Il est important de noter que, lorsqu’il est guidé par la visualisation transpupillaire, l’opérateur peut moduler avec précision l’angle et la profondeur d’injection en fonction de la position relative entre l’aiguille et les structures anatomiques de la rétine receveuse (par exemple, les vaisseaux rétiniens et la tête du nerf optique). De plus, l’administration précise de matériaux à l’aide de cette technique peut minimiser l’EPR, les traumatismes choroïdes et d’autres complications chirurgicales. En effet, nous avons constaté que les hémorragies peuvent être minimisées en évitant les manœuvres à proximité des vaisseaux sanguins rétiniens à l’aide de la visualisation transpupillaire.
Le reflux des cellules du donneur est une cause majeure d’échec chirurgical après l’injection29,30. De multiples facteurs sont impliqués dans la promotion du reflux cellulaire du donneur. La pression intraoculaire élevée (PIO) des yeux receveurs causée par les mélanges de cellules de donneurs injectés est un facteur important qui favorise le reflux des cellules hors de l’œil. Notre protocole réduit la PIO des receveurs par pénétration dans la chambre antérieure au début de la chirurgie et permet à la PIO de s’abaisser spontanément par sortie de liquide aqueux avant de retirer l’aiguille vitrée de la cavité vitréenne. Un deuxième facteur est le tunnel d’injection non scellé dans les yeux des receveurs. Pour éviter le reflux du greffon à travers le tunnel d’injection, nous utilisons une aiguille de micro-injection de petite taille (34G) pour créer un tunnel auto-obturant lors de la pénétration du mur de l’œil et des micro-pinces dentées pour maintenir les bords de l’ouverture du tunnel externe lors du retrait de l’aiguille. Dans la transplantation conventionnelle, les greffons refoulés sont à peine détectés car ils peuvent se produire rapidement ou se dissiper rapidement. L’hyaluronate de sodium, lors de l’application de la lamelle, glisse presque invariablement de la cornée pour recouvrir la majeure partie du limbe et de la sclère, y compris le site de sclérotomie. Après l’injection de cellules, l’hyaluronate de sodium au site de la sclérotomie peut aider à ralentir l’écoulement en vrac du contenu refluxé, le cas échéant, et aider à le rendre visuellement détectable au microscope chirurgical. De plus, l’absence de reflux peut également être vérifiée en traçant la constance de la bulle sous-rétinienne pour les suspensions cellulaires et la localisation intraoculaire du feuillet rétinien à l’aide de notre protocole, ce qui pourrait être utile pour les laboratoires où la tomographie par cohérence optique (OCT) n’est pas disponible.
Bien qu’un nombre important de cellules photoréceptrices aient survécu dans les feuillets rétiniens transplantés, aucune orientation cellulaire discernable, ou orientation de feuille, n’a pu être détectée. Bien que l’administration de feuillets rétiniens 3D à de grands animaux ait été établie 26,31,32, l’espace sous-rétinien chez la souris, associé à l’absence de capacité d’imagerie rétinienne peropératoire, rend très difficile le maintien de l’orientation du feuillet en peropératoire ainsi que dans la période postopératoire immédiate au cours de laquelle les cellules ou les feuilles transplantées peuvent devenir instables à mesure que la souris retrouve la déambulation.
Nous décrivons une plate-forme chirurgicale trans-sclérale avec guidage direct de la vision transpupillaire pour la transplantation sous-rétinienne chez des souris receveuses. Cette plateforme permet une grande précision d’injection et un faible taux de complications chirurgicales. Cette plateforme permet d’administrer avec précision des doses connues de cellules, est relativement facile à apprendre et facilite l’administration sous-rétinienne en plus des injections intra-rétiniennes ou intravitréennes pour différents types d’agents thérapeutiques, y compris la thérapie génique.
Disclosures
MSS est/a été un conseiller rémunéré de Revision Therapeutics, Johnson & Johnson, Third Rock Ventures, Bayer Healthcare, Novartis Pharmaceuticals, W. L. Gore & Associates, Deerfield, Trinity Partners, Kala Pharmaceuticals et Acucela. MSS reçoit le soutien de Bayer pour la recherche. Ces arrangements ont été examinés et approuvés par l’Université Johns Hopkins conformément à ses politiques en matière de conflits d’intérêts. KVL est nommé en tant qu’inventeur sur les demandes de brevet à l’Université du Colorado. MSS et YVL sont nommés en tant qu’inventeurs sur les demandes de brevet à l’Université Johns Hopkins.
Acknowledgments
Ces travaux ont été financés par les fonds suivants : NEI R01EY033103 (MSS), Foundation Fighting Blindness (MSS), la Fondation Shulsky (MSS), le Joseph Albert Hekimian Fund (MSS), la Juliette RP Vision Foundation (YVL), Research to Prevent Blindness (subvention sans restriction au Wilmer Eye Institute de l’Université Johns Hopkins et au Cullen Eye Institute du Baylor College of Medicine). Nous remercions la Dre Malia Edwards (Faculté de médecine de l’Université Johns Hopkins) d’avoir aimablement dispensé une formation sur le microscope.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Artificial tears | CareAll | P31447-04 | |
| Coverslips (5mm in diameter) | Deckglaser | N/A | |
| Goat anti-GFP (FITC) | Abcam | Ab6662 | |
| Goat-anti-rabbit Cy3 | Invitrogen | A10520 | |
| Insulin syringe (30G) | Easy Touch | 08496-3015-11 | |
| Ketamine | VETone Zetamine | AH2017J | |
| Live Dead Viability Kit | Thermo Fisher Scientific | L3224 | |
| Micro scissor | Harvard Apparatus | 72-8503 | |
| Micro smooth forceps | ASICO | AE-4360 | |
| Micro toothed forceps | World Precision Instruments | 555041FT | |
| Microinjection needle (26G) | Hamilton | 7804-03 | |
| Microinjection needle (34G) | Hamilton | 207434 | |
| Microinjection syringe | Hamilton | 7633-01 | |
| Papain dissociation kit | Worthington Biochemical | LK003150 | |
| Petri-dish (35 mm) | Thermo Fisher Scientific | FB012920 | |
| Povidone-iodine (10%) | Betadine Solution | N/A | |
| Proparacaine Hydrochloride (0.5%) | Keeler | AX0500 | |
| Rabbit anti-recoverin | Millipore | Ab5585 | |
| Rabbit anti-S-opsin | Millipore | Ab5407 | |
| Sodium hyaluronate | Johnson & Johnson Vision | 10-2400-11 | |
| Sterile cotton swabs | Puritan | 25-806 2PC | |
| Sterile needle (25G) | BD PrecisionGlide Needle | 305122 | |
| Sterile towel drapes | Dynarex | 4410 | |
| Surgical materials/reagents | |||
| Tropicamide ophthalmic solution | Henry Schein | 112-7192 | |
| Xylazine | AnaSed Injection | N/A |
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