Summary
Diese Studie stellt eine Methode zur Analyse der Morphologie von Mitochondrien vor, die auf Immunfärbung und Bildanalyse in Maushirngewebe in situ basiert. Es wird auch beschrieben, wie man damit Veränderungen in der mitochondrialen Morphologie erkennen kann, die durch Proteinaggregation in Parkinson-Modellen induziert werden.
Abstract
Mitochondrien spielen eine zentrale Rolle im Energiestoffwechsel von Zellen, und ihre Funktion ist aufgrund ihres hohen Energiebedarfs besonders wichtig für Neuronen. Daher ist die mitochondriale Dysfunktion ein pathologisches Kennzeichen verschiedener neurologischer Erkrankungen, einschließlich der Parkinson-Krankheit. Die Form und Organisation des mitochondrialen Netzwerks ist hochplastisch, was es der Zelle ermöglicht, auf Umweltreize und -bedürfnisse zu reagieren, und die Struktur der Mitochondrien ist auch eng mit ihrer Gesundheit verbunden. Hier stellen wir ein Protokoll zur Untersuchung der mitochondrialen Morphologie in situ vor, das auf der Immunfärbung des mitochondrialen Proteins VDAC1 und der anschließenden Bildanalyse basiert. Dieses Werkzeug könnte besonders nützlich für die Untersuchung neurodegenerativer Erkrankungen sein, da es subtile Unterschiede in der Anzahl und Form der Mitochondrien erkennen kann, die durch Aggregate von α-Synuclein induziert werden, einem aggregationsanfälligen Protein, das stark an der Pathologie der Parkinson-Krankheit beteiligt ist. Diese Methode ermöglicht es zu berichten, dass substantia nigra pars compacta dopaminerge Neuronen mit pS129-Läsionen eine mitochondriale Fragmentierung aufweisen (wie durch ihr reduziertes Aspect Ratio, AR nahegelegt) im Vergleich zu ihren gesunden Nachbarneuronen in einem vorgeformten intrakraniellen Injektions-Parkinson-Modell mit fibriller Injektion zeigen.
Introduction
Das zentrale Nervensystem hat einen intensiven Bedarf an ATP: Neuronen verwenden ATP, um Ionengradienten, Neurotransmittersynthese, synaptische Vesikelmobilisierung, -freisetzung und -recycling zu unterstützen und die lokale Proteintranslation und -abbau zu ermöglichen. Mehr als 95 % des vom Gehirn verwendeten ATP werden von den Mitochondrien produziert1. Daher ist es nicht verwunderlich, dass eine mitochondriale Dysfunktion besonders schädlich für Neuronen ist. Tatsächlich spielen mitochondriale Funktionsstörungen eine wichtige Rolle bei mehreren neurologischen Erkrankungen, einschließlich neurodegenerativer Erkrankungen wie Parkinson (PD) und Alzheimer (AD)2,3.
Mehrere Gene sind eindeutig mit PD-kodierenden Proteinen verknüpft, die für die mitochondriale Funktion und Homöostase relevant sind, wie Parkin 4,5,6, PTEN-induzierte Kinase 1 (PINK1)7,8 und DJ-19. Ein weiterer Beweis für eine Rolle der mitochondrialen Dysfunktion bei Parkinson ist, dass Behandlungen mit Inhibitoren des Komplexes I der mitochondrialen Elektronentransportkette (wie Rotenon und MPTP) mehrere Aspekte der Parkinson-Krankheit in vitro und in vivo rekapitulieren 10. Es ist jedoch wichtig zu sagen, dass viele pathologische Prozesse zusammen mit mitochondrialen Defiziten den neuronalen Verlust bei Parkinson vorantreiben können: oxidativer Stress, veränderte Kalziumhomöostase, Versagen des Ubiquitin-Proteasoms und der Autophagie-lysosomalen Systeme sowie Proteinaggregation gehören zu den am besten untersuchten (überprüft in 11,12,13 und).
Mitochondrien sind heterogen geformt: Neben einzelnen Einheiten finden sie sich häufig als ausgedehnte retikuläre und tubuläre Netzwerke. Die Struktur und die zelluläre Lage der Mitochondrien sind entscheidend für ihre Funktion14; Tatsächlich sind mitochondriale Netzwerke extrem dynamisch und durchlaufen häufige Prozesse der Spaltung, Fusion und Mitophagie, um die Bedürfnisse der Zellen zu erfüllen und auf Umweltreize zu reagieren15,16. Darüber hinaus ist die Morphologie der Mitochondrien eng mit ihrem Gesundheitszustand verbunden. Bei der menschlichen Optikusatrophie führen beispielsweise genetische Mutationen, die die mitochondriale Aktivität reduzieren, zu abnormalen, schlanken und hyperfusionierten Mitochondrien17. Auf der anderen Seite weist eine Vielzahl menschlicher Krankheiten eine abweichende mitochondriale Morphologie auf, einschließlich mitochondrialer Fragmentierung oder übermäßiger mitochondrialer Fusion, die schädliche Auswirkungen auf die mitochondriale Funktion haben (überprüft in18). Im Zusammenhang mit Parkinson haben wir und andere bereits gezeigt, dass eine abnormale mitochondriale Form mit einer Dysfunktion als Reaktion auf α-Synuclein-Aggregate korreliert19. Während die mitochondriale Morphologie sowohl im Zusammenhang mit Parkinson als auch bei anderen Krankheiten in vitro ausführlich untersucht wurde 20,21,22, fehlen Protokolle für die Bewertung der mitochondrialen Morphologie aus In-vivo-Schnitten. Dies macht die In-vivo-Untersuchung von Mitochondrien im Zusammenhang mit Krankheiten wie Parkinson stark abhängig von transgenen Tieren23 oder der Bewertung von Mittelhirnextrakten, die keine zelluläre Auflösung liefern können.
Hier wird ein Protokoll zur Untersuchung der mitochondrialen Morphologie in situ als Indikator für ihren funktionellen Status und ihre Gesundheit vorgestellt, basierend auf der Immunfärbung des mitochondrialen Proteins VDAC124 mit anschließender Bildanalyse in paraffineingebetteten Gewebeschnitten. Wir zeigen die Ergebnisse dieses Protokolls auch in In-vitro - und In-vivo-PD-Modellen : Neuroblastomzellen, die SNCA (Synuclein Alpha) überexprimieren, und Hirngewebe von Mäusen, die einer intrakraniellen Injektion von vorgeformten α-Synuclein-Fibrillen (PFFs) unterzogen wurden. Die Co-Immunfärbung mit einem Antikörper gegen α-Synuclein (in Zellen) oder PhosphoSer129-α-Synuclein pS129 (in Mäusegehirnen) ermöglichte es uns, Zellen mit aggregierter Proteinpathologie (überexprimierte α-Synuclein- bzw. α-Synuclein-Fibrillen) in den Proben zu identifizieren, während negative Zellen als nicht-pathologische Kontrolle innerhalb derselben Proben dienten. Durch diese Analyse und die hier beschriebenen Daten wurde ein reduziertes Aspektverhältnis beobachtet, das auf die Fragmentierung der Mitochondrien in Zellen hinweist, die SNCA überexprimieren oder pS129-Läsionen aufweisen.
Protocol
Alle in diesem Abschnitt beschriebenen Verfahren wurden gemäß dem ethischen Rahmen der Universität des Baskenlandes Referenz M20/2022/212, der Regierung des Baskenlandes, der spanischen Regierung und der Europäischen Union durchgeführt.
1. Analyse der mitochondrialen Morphologie in SNCA-überexprimierenden SH-SY5Y-Zellen
HINWEIS: Hier wird eine kurze Beschreibung der Generierung des In-vitro-Materials für die Studie gegeben, die als Vergleich für die in situ erhaltenen Ergebnisse dienen wird. Es wird empfohlen, diese Art der Analyse vor dem Start eines In-vivo-Experiments für die mitochondriale Morphologie durchzuführen, da sie sicherstellt, dass alle geeigneten Bildgebungs- und Analyseaufbauten vorhanden sind.
- Um die zelluläre Adhäsion zu erhöhen und die Zelladhäsion auf 96-Well-Platten mit flachem optischem Boden zu erleichtern, fügen Sie 25 μl/Well der Beschichtungsmatrix 1:1000 in DMEM F12 durch Pipettieren hinzu (siehe Materialtabelle). Die Platten werden 1 h bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert.
- Zählen Sie SH-SY5Y mit der Neubauer-Kammer. Entfernen Sie die Beschichtungsmatrix durch Pipettieren und säen Sie 10.000 Zellen/Well auf der beschichteten 96-Well-Platte in 50 μl/Well DMEM F-12, ergänzt mit 10 % FBS, 2 mM Glutamin und Penicillin/Streptomycin (siehe Materialtabelle).
- Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C und 5 % CO2für 24 h.
- Bereiten Sie eine Mischung aus 250 ng pcDNA3.1 mit humanem Wildtyp-SNCA, 0,250 μl des Transfektionsreagenzes, 0,250 l Transfektionsadjuvans und Transfektionsmedium bis zu 50 μl für jede Vertiefung vor (siehe Materialtabelle). Bereiten Sie eine Masterlösung unter Berücksichtigung der Gesamtzahl der Wells im Experiment vor.
- Entfernen Sie das Nährmedium durch manuelles Pipettieren und fügen Sie 50 μl/Vertiefung der in Schritt 1.4 hergestellten Lösung durch Pipettieren hinzu. Inkubieren bei 37 °C, 5 % CO2.
- h Entfernen Sie nach der Transfektion das Transfektionsmedium durch Pipettieren und fügen Sie 25 μl/Vertiefung 4% Paraformaldehyd (PFA) in PBS hinzu.
ACHTUNG: Paraformaldehyd ist ein giftiges Fixiermittel; geeignete PSA zu verwenden. - 5 min bei Raumtemperatur (RT) inkubieren. Entfernen Sie die Fixierlösung durch Pipettieren und waschen Sie sie einmal, indem Sie 50 μl/Vertiefung PBS hinzufügen. Entfernen Sie PBS durch Pipettieren.
- Pipettieren Sie 25 μl/Well TBS mit 0,05 % Tween (TBS-T) und 10 % normalem Eselserum (NDS, siehe Materialtabelle). 1 Stunde bei RT inkubieren, um unspezifische Signale zu blockieren.
- Bereiten Sie eine Lösung des Kaninchen-Anti-α-Synuclein-Antikörpers MJFR1 1:1000 zusammen mit dem Maus-Anti-TOMM20-Antikörper 1:100 in TBS-T (siehe Materialtabelle) entsprechend der Anzahl der zu analysierenden Wells vor.
- Die Blockierungslösung aus Schritt 1.8 durch Pipettieren entfernen und 25 μl/Vertiefung der in Schritt 1.9 hergestellten Mischung von Primärantikörpern hinzufügen. Über Nacht bei 4 °C inkubieren.
- Entfernen Sie die primäre Antikörperlösung und waschen Sie sie dreimal, indem Sie 50 μl/Vertiefung TBS-T durch Pipettieren hinzufügen und entfernen.
- Bereiten Sie eine Lösung aus grünem Sekundärantikörper Anti-Maus 1:1000 zusammen mit rotem Sekundärantikörper Anti-Kaninchen 1:1000 in TBS-T (siehe Materialtabelle) entsprechend der Anzahl der zu analysierenden Wells vor.
- Nach dem Absaugen des PBS aus dem letzten Waschgang gemäß Schritt 1.11 werden mit einer Pipette 25 μl/Vertiefung des sekundären Antikörpergemisches zugegeben und die Platte 1 h lang bei RT inkubiert.
- Entfernen Sie die sekundäre Antikörperlösung durch Pipettieren und fügen Sie 25 μl/Well 2 g/ml DAPI in TBS-T hinzu. Inkubieren Sie die Platte 5 Minuten lang bei R.T.
- Entfernen Sie die DAPI-Lösung mit einer Pipette und waschen Sie sie dreimal, indem Sie 50 μl/Vertiefung TBS-T mit einer Pipette hinzufügen und entfernen.
- 80 μl/Vertiefung PBS mit 0,02 % Natriumazid pipettieren und die Platte bei 4 °C lagern.
VORSICHT: Natriumazid ist giftig; geeignete PSA zu verwenden. - Nehmen Sie Bilder mit einem automatisierten High-Content-Fluoreszenzmikroskop oder einem gleichwertigen konfokalen Bildgebungssystem auf, das mit einem 60-fachen Objektiv ausgestattet ist (siehe Materialtabelle).
- Führen Sie eine Analyse des TOMM20-Signals einzelner Zellen mit Fiji durch, indem Sie die Schritte 3.15-3.21 befolgen. Vermeiden Sie Zellen, die Apoptose, Nekrose oder Mitose durchlaufen.
HINWEIS: Dazu schließen wir die Zellen von der Analyse aus, die die morphologischen Merkmale von Apoptose, Nekrose oder Mitose aufweisen, die unter dem Mikroskop sichtbar sind, wie z. B. Zellschrumpfung, Membranblättchen, Zellablösung, Kernkondensation, DNA-Fragmentierung und kondensiertes Kernchromatin, das in dicken Strängen organisiert ist, die in einer einzigen Ebene ausgerichtet sind.
2. Die Erzeugung von PFFs und intrakraniellen PFF-Injektionen bei Mäusen
HINWEIS: Die Erzeugung von Injektionsmaterial und der intrakranielle Injektionsprozess werden hier vorgestellt. Dieses Protokoll wurde von Luk et al.25 übernommen.
- Um PFFs zu erhalten, geben Sie ein Röhrchen/einen Kolben mit 0,5 ml α-Syn (5 mg/ml; Peptid, siehe Materialtabelle) auf einem Schüttler bei 37 °C und 250 U/min für 7 Tage zur Induktion der Aggregation von α-Synuclein.
- Das aggregierte α-Synuclein wird bei 20 % Amplitude und 0,25 Zyklen beschallt, bis eine optimale Fragmentierung erreicht und durch negative Färbung der Proben mit Transmissionselektronenmikroskopie beobachtet wurde.
- Um männliche und weibliche C57Bl/6-Wildtyp-Mäuse (3 Monate alt) für striatale PFF-Injektionen vorzubereiten, wird Meloxicam/Metacam (5 mg/kg) in Kochsalzlösung subkutan verabreicht. Verabreichen Sie außerdem 1 ml der sterilen Kochsalzlösung über zwei subkutane 0,5-ml-Injektionen pro Tier. Diese Behandlungen verhindern Dehydrierung, Entzündungen und Schmerzen.
- Induzieren Sie eine Anästhesie mit 4% Isofluran und 0,7 l/min O2 in einer Induktionskammer. Überprüfen Sie die Tiefe der Anästhesie anhand der fehlenden Pedalreaktion.
- Rasieren Sie den oberen Teil des Mauskopfes und führen Sie das Tier vorsichtig auf einer Heizmatte in den Rahmen des stereotaktischen Geräts ein.
- Halten Sie die Anästhesieebene aufrecht, indem Sie während des gesamten Injektionsvorgangs eine Tierinhalationsanästhesie (1%-2% Isofluran in 0,7 l/min O2) durch eine Gesichtsmaske durchführen.
- Platzieren Sie das Tier auf dem stereotaktischen Rahmen. Desinfizieren Sie den Operationsbereich mit drei Runden abwechselndem Chlorhexidin-Peeling und 70% Ethanol. Tragen Sie Marcain/Bupivacain lokal (ca. 100 μl) als subkutane Infiltration von 0,25% auf.
- Führen Sie einen 0,5 cm langen Hautschnitt durch, um den Schädel freizulegen, und bohren Sie ein Loch mit einem Durchmesser von 1 mm in den Schädel, um die Gehirnoberfläche freizulegen, in den folgenden Koordinaten von Bregma: - 0,5 mm anteroposterior, +/− 2,5 mm mediolateral.
- Injizieren Sie 1,5 l PFFs, die in Schritt 2.2 durch stereotaktische Verabreichung an die in Schritt 2.8 angegebenen Koordinaten aus Bregma und -2,7 mm dorsoventral (aus dem oberen Gehirn) bei einer Flussrate von 100 nl/min mit einer 32-G-Hamilton-Spritze erhalten wurden. Ziehen Sie die Spritze 5 Minuten nach der Injektion zurück.
- Nähen Sie die Wunde (Größe: 4-0, 45 cm, siehe Materialtabelle) mit drei bis fünf Stichen nach Bedarf und verbinden Sie sie jeweils mit 2 Doppelknoten und dann einem einfachen Knoten. Stoppen Sie die Betäubungsinhalation und entfernen Sie die Maus aus dem Rahmen.
- Lassen Sie die Maus in einem geeigneten Bergekäfig erholen, bevor Sie sie in ihren Heimatkäfig zurückbringen.
- Führen Sie in der folgenden Woche tägliche postoperative Kontrollen durch. Die Schmerzen, Ängste oder Beschwerden eines Tieres sollten alle 24 Stunden mit Meloxicam/Metacam wie in Schritt 2.3 angegeben dosiert werden.
- Drei Monate später injizieren Sie 300 μl 200 mg/ml Natrium-Pentobarbital über eine intraperitoneale Injektion in Kochsalzlösung. Sobald der Schmerzreflex verloren ist, machen Sie einen Schnitt (2-3 cm) auf der Brust und heben Sie die Rippen an, um das Herz freizulegen.
- Transkardiale Perfusion mit 10 ml PBS und 35 ml 4% Paraformaldehyd in PBS nacheinander bei 5 ml/min unter Verwendung einer 50-ml-Spritze, die an eine 23-g-Schmetterlingsnadel angeschlossen ist.
- Entfernen Sie das Gehirn und fixieren Sie es für weitere 24 Stunden bei 4 °C in 4 % PFA. Nach der PFA-Behandlung in 70%igem Ethanol bei 4 °C lagern.
- Legen Sie das Gehirn in geeignete Plastikeinbettboxen (siehe Materialtabelle) und inkubieren Sie es 1 h lang in 95% Ethanol bei RT. Wiederholen Sie den Schritt in frischem 95% Ethanol und inkubieren Sie erneut für 1 h.
- Übertragen Sie das Gehirn für 1 h bei RT auf 100% Ethanol. Wiederholen Sie den Schritt in frischem 100% Ethanol und inkubieren Sie erneut für 1 h.
- Übertragen Sie das Gehirn für 1 h bei RT in Xylol oder Xylolersatz. Wiederholen Sie dies in frischer Lösung und inkubieren Sie erneut für 1 h.
- Entfernen Sie das Xylol oder den Xylolersatz und inkubieren Sie die Probe 1 h lang in warmem Paraffin. Ersetzen Sie das Paraffin und inkubieren Sie es für eine weitere Stunde.
- Montieren Sie das Gehirn mit warmem Paraffin auf die Einbettboxen und lassen Sie es über Nacht trocknen. Bereiten Sie 5-μm-Schnitte mit einem Mikrotom vor (siehe Materialtabelle) und montieren Sie sie auf Objektträger.
3. Mitochondriale Morphologieanalyse durch Immunhistochemie an paraffineingebetteten Hirnschnitten von PFF-injizierten Mäusen
- Entwachse die Objektträger, indem du zehnmal in Xylolersatz tauchst. Inkubieren Sie die Objektträger 2 Minuten lang in Xylolersatz. Erneut zehnmal in Xylolersatz tauchen.
HINWEIS: Dieser Schritt ist notwendig, um das Paraffin zu entfernen und die Rehydrierung der Proben zu ermöglichen. - Rehydratation: Wiederholen Sie das in Schritt 3.1 beschriebene Verfahren mit den folgenden Lösungen: 100 % EtOH, 95 % EtOH, 70 % EtOH und zweimal mit ddH2O in der Reihenfolge.
- Führen Sie die Antigengewinnung und Immunfärbung mit den folgenden Schritten durch.
- Beginnen Sie mit dem Umfüllen der Proben in einen mikrowellengeeigneten Behälter mit ddH2O.
- 100x Citratpuffer pH 6 (siehe Materialtabelle) bei 4 °C aufwärmen (Detergenzien können ausgefällt worden sein) und 350 ml frischen 1x Citratpuffer vorbereiten. Gießen Sie dann den Citratpuffer in einen praktischen Plastikbehälter mit Deckel.
- Legen Sie die Objektträger in den Citratpufferbehälter (KRITISCH: Überprüfen Sie, ob sich die Objektträger unter dem Niveau des Puffers befinden) und setzen Sie den Deckel auf.
ACHTUNG: Stellen Sie sicher, dass der Deckel NICHT vollständig geschlossen ist, da sonst der Behälter in der Mikrowelle platzen kann. - Mikrowelle bei 700 W: 4 min + 5 min Ruhe, 1,5 min + 5 min Ruhe. Citratpuffer und Mikrowelle erneut 1,5 min + 5 min Ruhe, 1,5 min + 5 min Ruhe, 1,5 min + 5 min Ruhe.
- Die Proben in Citratpuffer auf Eis 20 min abkühlen lassen. Waschen Sie die Probe mit ddH2O.
HINWEIS: Die Antigen-Entnahme kann je nach spezifischen Antikörperanforderungen variieren.
- Trocknen Sie die Objektträger mit Papiertüchern, ohne das Taschentuch zu berühren. Zeichnen Sie mit einem Pap-Stift (siehe Materialtabelle) Rechtecke um die Gewebestücke.
- Alle Objektträger in eine Objektträger-Immunfärbebox geben und ein paar Mal vorsichtig mit TBS + 0,05 % TWEEN (TBS-T) waschen. Überprüfen Sie, ob TBS-T-Tropfen in den Pap-Pen-Rechtecken bleiben.
- Entfernen Sie TBS-T aus den Proben, indem Sie auf ein Papiertuch klopfen. 50 μl einer Blockierungslösung (10 % NDS in TBS-T) in jedes Rechteck geben (ohne das Gewebe zu berühren) und 1 h bei RT inkubieren.
HINWEIS: Das Volumen kann je nach Größe des Gewebes variieren. Versuchen Sie sicherzustellen, dass: (1) der PAP-Bereich in allen Proben ähnlich ist und (2) der Bereich vollständig vom gewählten Puffervolumen bedeckt ist. - Entfernen Sie die Blockierungslösung von den Proben, indem Sie mit einem Papiertuch klopfen. Pipettieren Sie vorsichtig 50 μl/Rechteck der folgenden primären Antikörpermischung in TBS-T: Anti-Tyrosin-Hydroxylase 1:250 zusammen mit Anti-VDAC1 1:100 und Anti-pSer129 α-Synuclein EP1536Y 1:2000 (siehe Materialtabelle).
- Über Nacht bei 4 °C inkubieren.
- Waschen, indem Sie TBS-T auf die Objektträger pipettieren und durch Klopfen auf Papiertuch entfernen. Dreimal wiederholen.
- Durch Pipettieren von 50 μl/Rechteck einer sekundären Antikörpermischung hinzufügen: grünes sekundäres Anti-Huhn, rotes sekundäres Anti-Maus und fernrotes sekundäres Anti-Kaninchen 1:1000 in TBS-T (siehe Materialtabelle). Bei 37 °C 1 h im Dunkeln inkubieren.
- Dreimal mit TBS-T waschen, wie in Schritt 3.13 beschrieben.
- Inkubieren Sie mit DAPI 2 μg/ml in TBS-T für 1 min. Entfernen Sie die DAPI-Lösung, indem Sie auf ein Papiertuch klopfen. Dreimal mit TBS-T waschen, wie in Schritt 3.13 beschrieben.
- Montieren Sie ein Glasdeckglas mit 2 Tropfen/Objektträger des Einbettreagenzes auf die Proben (siehe Materialtabelle). Drücken Sie vorsichtig auf das Deckglas, um Blasen zu entfernen, und lassen Sie die Proben 1 h bei R.T. trocknen. Anschließend bei 4 °C im Dunkeln lagern.
- Bilden Sie mindestens 50 Zellen in verschiedenen Bereichen mit einem Fluoreszenz-Bildgebungssystem mit strukturierter Beleuchtung ab, das mit einem 60-fachen Ölobjektiv oder konfokaler Technologie ausgestattet ist.
- Führen Sie eine Analyse des VDAC1-Signals einzelner Zellen mit Fidschi durch, wie in den folgenden Schritten angegeben.
- Wählen Sie zunächst den interessierenden Bereich (ROI) aus und isolieren Sie ihn, indem Sie eine Kontur um die positive oder negative Zelle (je nach Bedarf) zeichnen und die Funktion "Zuschneiden" verwenden. Um Verzerrungen bei der ROI-Auswahl zu vermeiden, wählen Sie sie unter Berücksichtigung des Fluoreszenzsignals eines Markers, der nicht mit der Analyse zusammenhängt (d. h. kein mitochondrialer Marker).
- Optional: Wenn das Bild zu stark verpixelt ist, verwenden Sie die Funktion "Glätten", um eine höhere Kantenschärfe zu erhalten.
HINWEIS: Sollte die Glättfunktion auf ein Bild angewendet werden, wenden Sie sie bitte auf alle nachfolgenden Bilder an. - Optional: Verwenden Sie die Funktion "Falten" (Kernel-Modus, in Prozess > Filter), um den Hintergrund zu reduzieren.
HINWEIS: Dies ist optional und bei Verwendung von 5-m-Abschnitten aufgrund der dünneren Beschaffenheit der Abschnitte normalerweise nicht erforderlich. - Aktivieren Sie die Formdeskriptoren und beschränken Sie die Optionen auf Schwellenwerte in der Funktion "Messung einstellen" (stellen Sie sicher, dass diese durch die Analyse aktiviert werden).
- Wählen Sie im Menü "Anpassen" die Schwellenwertfunktion und passen Sie den Schwellenwert an. Die Schwellenwerteinstellungen müssen für alle Zellen derselben Stichprobe beibehalten werden.
- Versuchen Sie, eine angemessene Visualisierung des mitochondrialen Netzwerks sicherzustellen, wie in den repräsentativen Bildern dieses Artikels gezeigt, während Sie Hintergrundpixel verwerfen.
- Verwenden Sie das Werkzeug Partikel analysieren auf der Registerkarte Analysieren. Stellen Sie eine geeignete Größe ein, um die Mitochondrien zu erfassen. In diesem Beispiel Größe: 25-Unendlich, aktivieren: Pixeleinheiten und auswählen: Anzeigen: Maskenbefehle wurden verwendet, um das Ergebnis zu visualisieren. Fiji berechnet und zeigt die Anzahl, das Seitenverhältnis (AR) und andere Formparameter in einem neuen Bedienfeld an.
- Führen Sie gegebenenfalls eine statistische Analyse der Daten durch. In diesem Experiment wurde der t-Test verwendet, um die Differenz zwischen dem durchschnittlichen Seitenverhältnis (AR) und den von Fidschi berechneten Zählungen zwischen den Versuchsgruppen nach Normalitätstests mit den D'Agostino- und Pearson-Normalitätstests zu analysieren.
Representative Results
Um sicherzustellen, dass die geeigneten Bildgebungs- und Analysebedingungen für die In-situ-Bewertung der mitochondrialen Morphologie im Gewebe vorhanden sind, wird eine In-vitro-Untersuchung der mitochondrialen Morphologie als Reaktion auf einen bekannten Modulator der mitochondrialen Morphologie empfohlen (Abschnitt 1). Beispielsweise wurde SNCA in SH-SY5Y-Zellen genetisch überexprimiert, um Veränderungen in der mitochondrialen Morphologie zu induzieren, wie zuvor beschrieben26. Andere Beleidigungen, die als Kontrolle zur Verschlechterung der mitochondrialen Morphologie verwendet werden könnten, wären Hunger oder die Verwendung von mitochondrialen Aktivitätshemmern wie MPP+. Die Zellen wurden transfiziert und für α-Synuclein (AS) gefärbt, um SNCA+ (AS+) und SNCA- (AS-) Zellen zu trennen. Sie wurden auch mit TOMM2027 gefärbt, um das mitochondriale Netzwerk von Zellen sichtbar zu machen. Um diese Analyse so ähnlich wie möglich an einen 5 μm großen Gewebeschnitt zu bringen, wurde eine konfokale Ebene analysiert, im Gegensatz zu einer maximalen Projektion mehrerer Ebenen. Die morphologische Analyse einer konfokalen Ebene von TOMM20 ergab, dass sowohl die Gesamtzahl der Mitochondrien als auch ihr Aspektverhältnis oder AR (das mit der Verlängerung der Organelle korreliert) als Reaktion auf eine SNCA-Überexpression reduziert waren (Abbildung 1).
Die Immunfärbung wurde für das mitochondriale Protein VDAC1 in 5 μm paraffineingebetteten Maushirnschnitten von Tieren durchgeführt, denen PFFs injiziert wurden, wie im obigen Protokollabschnitt beschrieben. Dopaminerge Neuronen der Substantia nigra pars compacta (SNc), die bei Parkinson degeneriert werden, wurden durch Co-Immunfärbung mit Anti-Tyrosin-Hydroxylase (TH) aufgedeckt und regional vom ventralen tegmentalen Bereich und der Substantia nigra pars lateralis getrennt. Andererseits ermöglichte uns die Anti-PhosphoSer129-α-Synuclein (pS129)-Färbung, Zellen mit pS129-Läsionen von gesunden Zellen zu unterscheiden (pS129+ versus pS129-). Es wurden SNc-Bilder von drei verschiedenen Tieren aufgenommen, und die anschließende Bildanalyse der VDAC1-Färbung von TH-positiven Neuronen ergab eine Verringerung sowohl der mitochondrialen Anzahl als auch des Seitenverhältnisses zwischen Neuronen mit pS129-Läsionen und Neuronen, denen diese fehlen (Abbildung 2). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die mitochondriale Morphologie von Neuronen mit pS129-Läsionen im Vergleich zu Zellen ohne pS129-Läsionen beeinträchtigt ist.
Während dieses spezielle Experiment eine Verringerung der AR zeigt, wodurch eine Verringerung der Elongation der Mitochondrien zusammen mit einer Verringerung der globalen Anzahl hervorgehoben wird, was auf eine Verschlechterung der mitochondrialen Morphologie hinweist, sollte die Interpretation der Daten experimentabhängig sein. Zum Beispiel kann eine Verringerung der AR und der Anzahl auf eine globale Verringerung des mitochondrialen Gehalts sowie der Fragmentierung hinweisen, während eine Verringerung der AR, aber eine Zunahme der globalen Anzahl auf einen mitochondrialen Fragmentierungsphänotyp hinweisen würde. Daher ist es wichtig, die Daten im Kontext beider Maßnahmen zu interpretieren.
Abbildung 1: Mitochondriale Morphologie in einem SNCA-überexprimierenden In-vitro-Modell. Co-Immunfärbung für TOMM20 (grün), α-Synuclein (AS, rot) und DAPI (blau) auf SNCA-überexprimierenden und nicht überexprimierenden (AS+ bzw. AS-) Zellen (A). Detail einer AS-Zelle (B) und einer AS+-Zelle (C). Schwarzweißbilder in den Feldern (B) und (C) stellen die Masken des TOMM20-Signals nach Anwendung der im Abschnitt Protokoll beschriebenen Fiji-Funktion dar. Diese Maske ermöglicht die Quantifizierung der Form der resultierenden Strukturen. Mitochondrienzahlen und Aspect Ratio (AR)-Werte von AS- und AS+-Zellen (N = 25 Zellen pro Zustand) wurden quantifiziert und als Einzelwerte sowie als durchschnittliche ± REM dargestellt; **p-Wert < 0,05 t-Test (D). Die Normalität wurde durch die D'Agostino- und Pearson-Normalitätstests bewertet. Maßstabsleisten: A, 30 μm; B,C, 5 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Die mitochondriale Morphologie ist in Neuronen mit pS129-Läsionen betroffen. Co-Immunfärbung für TH (grün), VDAC1 (rot), PhosphoS129-α-Synuclein (magenta) und DAPI (blau) des SNc von PFF-injizierten Mäusen (A). Der Ausschnitt eines phosphoS129-α-synuclein-negativen (pS129-) dopaminergen Neurons (B) und eines phosphoS129-α-synuclein-positiven (pS129+) dopaminergen Neurons (C). Schwarzweißbilder in den Feldern (B) und (C) stellen die Masken des TOMM20-Signals nach Anwendung der im Abschnitt Protokoll beschriebenen Fiji-Funktion dar. Diese Maske ermöglicht die Quantifizierung der Form der resultierenden Strukturen. Negative und positive Zellen wurden in Proben von drei verschiedenen Tieren gezählt, was durch die unterschiedlichen Farben der einzelnen grafischen Werte (blau, grün und orange) dargestellt wird. Mitochondriale Zahlen und AR-Quantifizierung von pS129- (N = 29) im Vergleich zu pS129+ (N = 22) in dopaminergen Neuronen wurden als durchschnittliche ± SEM sowie als individuelle Zellwerte dargestellt; **p-Wert < 0,05 t-Test (D). Die Normalität wurde durch die D'Agostino- und Pearson-Normalitätstests bewertet. Maßstabsleisten: A, 30 μm; B,C, 5 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Discussion
Insgesamt zeigt diese Studie, dass die Immunfärbung in Kombination mit der Bildanalyse eine zuverlässige Methode zur Analyse der mitochondrialen Morphologie ist. Tatsächlich ermöglicht es die Quantifizierung der Anzahl der Mitochondrien sowie einiger morphologischer Parameter wie des Aspektverhältnisses sowohl in der Zellkultur als auch im Gewebe. Die Anzahl der Mitochondrien hängt direkt mit dem funktionellen Status der Spalt- und Fusionsmechanismen der Proben zusammen, während der AR-Wert von der Verlängerung der Organelle abhängt. Diese Methode kann besonders wertvoll für die schnelle Bewertung der mitochondrialen Anomalien in Modellen der Parkinson sein, in denen veränderte mitochondriale Morphologie, Dynamik und Funktionen bekannte pathologische Mechanismen sind28,29. α-Synuclein spielt auch bei Parkinson eine relevante Rolle: Tatsächlich ist α-Synuclein einer der Bestandteile von Lewy-Körpern, den zytoplasmatischen Fibrillenaggregaten, die für die postmortale Diagnose von Parkinson-Patienten verwendet werden30. Darüber hinaus wurden Mutationen im SNCA-Gen sowohl bei Patienten mit vertrauter als auch mit sporadischer Parkinson gefunden (überprüft in31). Es wurde umfassend gezeigt, dass die Phosphorylierung von α-Synuclein an Ser129 eine Lewy-Body-ähnliche Pathologie kennzeichnet, die nach PFF-Beleidigung auftritt und verschiedene toxische Wirkungen hervorruft32,26.
Mit dem hier vorgestellten Tool konnten wir eine Verringerung der Mitochondrienzahl und der AR-Werte in Gegenwart von sowohl überexprimiertem als auch aggregiertem α-Synuclein (Zellen mit α-Synuclein-Färbung bzw. Neuronen mit PhosphoSer129α-Synuclein-positiven Läsionen) im Vergleich zu Zellen ohne solche Läsionen (α-Synuclein- und PhosphoS129α-Synuclein-negative Zellen) feststellen. Diese Ergebnisse stimmen mit früheren Berichten überein, die zeigen, wie direkte α-Synuclein-Mitochondrien-Wechselwirkungen toxische Auswirkungen auf die mitochondriale Funktion und Homöostase bei PD haben26,33 34. Tatsächlich wurde berichtet, dass Mäuse mit α-Synuclein-Mutationen erhöhte mitochondriale DNA-Schäden35 und Mitophagie 36,37 aufweisen. Darüber hinaus wurde beschrieben, dass erhöhte α-Synuclein-Spiegel die mitochondriale Spaltung/Fragmentierung fördern, reaktive Sauerstoffspezies in Mitochondrien induzieren und die mitochondriale Proteinexpression in Zelllinien und Mausmodellen, die α-Synuclein überexprimieren, dysregulieren 26,38,39.
Es ist wichtig hervorzuheben, dass dieses Instrument stark von den für die Studie verwendeten Antikörpern abhängt. Eine sorgfältige morphologische Bewertung der verwendeten Antikörperfärbung ist unerlässlich, um das geeignete subzelluläre Kompartiment zu erkennen. Da diese Technik auf 5-μm-Schnitten basiert und daher einzelne Fokusebenen für die Analyse der mitochondrialen Strukturen erfordert, schließt das Fehlen eines Phänotyps die Existenz eines Phänotyps nicht aus, da es möglich ist, dass subtile Unterschiede in der mitochondrialen Morphologie mit dieser Methode nicht erkannt werden.
Während diese und andere Arbeiten zuvor ähnliche Ansätze zur Bewertung der mitochondrialen Morphologie in vivo verwendet haben 40, besteht die Notwendigkeit, der Forschungsgemeinschaft für diese Bewertung ein detailliertes Protokoll zugänglich zu machen. Die Bedeutung dieser Studie besteht darin, dass es möglich ist, diese Methode auf verschiedene In-vivo-Krankheitsmodelle anzuwenden, um mitochondriale morphologische Anomalien zu bewerten und potenzielle Pathologien zu identifizieren, was schließlich das Screening von Leitverbindungen für die Behandlung solcher Erkrankungen erleichtern kann. Während diese Analyse derzeit auf paraffineingebettetes Gewebe beschränkt ist, besteht der Vorteil der Methode darin, dass sie nach der terminalen Gewebeentnahme auf jedes Krankheitsmodell angewendet werden kann, was sie zu einem sehr vielseitigen Werkzeug macht.
Disclosures
Wir möchten keine Interessenkonflikte melden.
Acknowledgments
Wir möchten den Geldgebern dieser Studie danken, insbesondere Ikerbasque, dem spanischen Ministerium für Wissenschaft und Innovation, der Michael J. Fox Foundation, IBRO und dem Achucarro Basque Center for Neuroscience.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 32 G Hamilton syringe | Hamilton | 7632-01 | |
| 4',6-diamidino-2-fenilindol, dihidrocloruro (DAPI) | Invitrogen | D1306 | |
| 4/0 USP 45 cm suture | SSa90 pga | 32345n-36u | |
| Alexa fluor 488/594-Donkey anti-Mouse | Invitrogen | A21202; A21203 | green/red dye-Donkey anti-Mouse |
| Alexa fluor 594/647-Donkey anti-Rabbit | Invitrogen | A21207 A31573 | red/far red dye-Donkey anti-Rabbit |
| AlexaFluor 488-Donkey anti-Chicken | Jackson ImmunoResearch | 703-545-155 | green dye-Donkey anti-Chicken |
| Anti-PSer129 α-synuclein EP1536Y (Rabbit) antibody | Abcam | ab51253 | |
| Anti-TOM 20 (Mouse) antibody | Santa Cruz | sc-17764 | |
| Anti-Tyrosine Hydroxylase (Chicken) antibody | Abcam | ab76442 | |
| Anti-VDAC1 (Mouse) antibody | Santa Cruz | sc-390996 | |
| Anti-α-synuclein antibody MJFR1 (Rabbit) | Abcam | ab138501 | |
| Citrate buffer 100X stock: 120mM citrate buffer, 5% Tween in water (pH 6) | Home-made | ||
| Disposable base mold for tissue embedding | Fisher | 22-363-553 | Plastic embedding boxes |
| D-MEM F12 | Gibco | A321331020 | |
| EVOS M7000 Imaging System | ThermoFisher Scientific | High-content automated fluorescence microscope | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270106 | |
| Flat optical bottom 96 well plates | Greiner | 675090 | |
| FluorSave Reagent | Millipore | 345789-20ML | Mounting reagent |
| Glutamine 200 mM | Gibco | 25030-024 | |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratories | H-4000 | PAP-pen |
| Lipofectamine and Plus Reagent | Invitrogen | 11668-019; 11514-015 | Transfection reagent and transfection adjuvant |
| Matrigel | Corning | 354230 | Coating matrix |
| Microtome | ThermoFisher Scientific | ||
| Normal Donkey Serum | Gibco | PCN5000 | |
| Opti-MEM | Gibco | 31985070 | Transfection medium |
| PCDNA4 plasmid (backbone) | Addgene | 41036 | |
| Penicillin/Streptomycin solution | Gibco | 15140-122 | |
| SH-SY5Y cells/well | ATCC | HTB-11 | |
| Xylene substitute | Labbox | 22L36504 | |
| Zeiss Axio Imager Apotome 2 | Carl Zeiss | Structured illumination fluorescence imaging system | |
| α-synuclein peptide | rpeptide | S-1010-2 |
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