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Neuroscience

पार्किंसंस रोग मॉडल में माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान की हिस्टोलॉजिकल परीक्षा

Published: June 23, 2023 doi: 10.3791/65453
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1,2,3,4
1Achucarro Basque Center for Neuroscience, 2Department of Neuroscience, University of the Basque Country (UPV/EHU), 3Ikerbasque - Basque Foundation for Science, 4Oxford Parkinson’s Disease Centre and Department of Physiology, Anatomy and Genetics, University of Oxford
* These authors contributed equally

Summary

यह अध्ययन स्वस्थानी में माउस मस्तिष्क के ऊतकों में इम्यूनोस्टेनिंग और छवि विश्लेषण के आधार पर माइटोकॉन्ड्रिया की आकृति विज्ञान का विश्लेषण करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करता है। यह यह भी वर्णन करता है कि यह पार्किंसंस रोग मॉडल में प्रोटीन एकत्रीकरण द्वारा प्रेरित माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान में परिवर्तन का पता लगाने की अनुमति कैसे देता है।

Abstract

माइटोकॉन्ड्रिया कोशिकाओं के ऊर्जा चयापचय में एक केंद्रीय भूमिका निभाते हैं, और उनकी उच्च ऊर्जा मांग के कारण न्यूरॉन्स के लिए उनका कार्य विशेष रूप से महत्वपूर्ण है। इसलिए, माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन पार्किंसंस रोग सहित विभिन्न न्यूरोलॉजिकल विकारों की एक रोग संबंधी पहचान है। माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क का आकार और संगठन अत्यधिक प्लास्टिक है, जो सेल को पर्यावरणीय संकेतों और जरूरतों का जवाब देने की अनुमति देता है, और माइटोकॉन्ड्रिया की संरचना भी उनके स्वास्थ्य से कसकर जुड़ी हुई है। यहां, हम माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन वीडीएसी 1 के इम्यूनोस्टेनिंग और बाद में छवि विश्लेषण के आधार पर सीटू में माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान का अध्ययन करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। यह उपकरण न्यूरोडीजेनेरेटिव विकारों के अध्ययन के लिए विशेष रूप से उपयोगी हो सकता है क्योंकि यह माइटोकॉन्ड्रियल काउंट्स में सूक्ष्म अंतर का पता लगा सकता है और α-सिंक्यूक्लिन के समुच्चय से प्रेरित आकार, पार्किंसंस रोग के विकृति विज्ञान में भारी रूप से शामिल एक एकत्रीकरण-प्रवण प्रोटीन। यह विधि एक को रिपोर्ट करने की अनुमति देती है कि पर्याप्त नाइग्रा पार्स कॉम्पैक्टा डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स पीएस 129 घावों को परेशान करते हैं माइटोकॉन्ड्रियल विखंडन दिखाते हैं (जैसा कि उनके कम पहलू अनुपात, एआर द्वारा सुझाया गया है) एक पूर्व-गठित फाइब्रिल इंट्राक्रैनील इंजेक्शन पार्किंसंस मॉडल में उनके स्वस्थ पड़ोसी न्यूरॉन्स की तुलना में।

Introduction

केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में एटीपी की तीव्र मांग है: न्यूरॉन्स आयनिक ढाल, न्यूरोट्रांसमीटर संश्लेषण, सिनैप्टिक पुटिका जुटाने, रिलीज और रीसाइक्लिंग का समर्थन करने और स्थानीय प्रोटीन अनुवाद और गिरावट को सक्षम करने के लिए एटीपी का उपयोग करते हैं। मस्तिष्क द्वारा उपयोग किए जाने वाले एटीपी का 95% से अधिक माइटोकॉन्ड्रिया1 द्वारा निर्मित होता है। इसलिए, यह आश्चर्य की बात नहीं है कि माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन न्यूरॉन्स के लिए विशेष रूप से हानिकारक है। वास्तव में, माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन हानि कई न्यूरोलॉजिकल रोगों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है, जिसमें पार्किंसंस रोग (पीडी) और अल्जाइमर रोग (एडी)2,3जैसे न्यूरोडीजेनेरेटिव स्थितियां शामिल हैं।

एकाधिक जीन असमान रूप से पीडी-एन्कोडिंग प्रोटीन से जुड़े होते हैं जो माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन और होमियोस्टैसिस के लिए प्रासंगिक होते हैं, जैसे पार्किन 4,5,6, पीटीईएन-प्रेरित किनेज 1 (पिंक 1) 7,8 और डीजे -19। पीडी में माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन के लिए एक भूमिका के लिए और सबूत यह है कि माइटोकॉन्ड्रियल इलेक्ट्रॉन ट्रांसपोर्ट चेन (जैसे रोटेनोन और एमपीटीपी) के कॉम्प्लेक्स I के अवरोधकों के साथ उपचार पीडी के कई पहलुओं को इन विट्रो और विवो10 में पुन: व्यवस्थित करता है। हालांकि, यह बताना महत्वपूर्ण है कि कई रोग प्रक्रियाएं पीडी में न्यूरोनल हानि को चला सकती हैं, साथ में माइटोकॉन्ड्रियल घाटे के साथ: ऑक्सीडेटिव तनाव, परिवर्तित कैल्शियम होमियोस्टेसिस, सर्वव्यापी-प्रोटेसोम की विफलता और ऑटोफैगी-लाइसोसोमल सिस्टम, और प्रोटीन एकत्रीकरण सबसे अधिक अध्ययन में से हैं (11,12,13 में समीक्षा की गई और)।

माइटोकॉन्ड्रिया आकार में विषम हैं: व्यक्तिगत इकाइयों के अलावा, वे आमतौर पर विस्तारित जालीदार और ट्यूबलर नेटवर्क के रूप में पाए जाते हैं। संरचना और माइटोकॉन्ड्रिया के सेलुलर स्थान उनके समारोह14 के लिए महत्वपूर्ण हैं; वास्तव में, माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क अत्यंत गतिशील हैं, कोशिकाओं की जरूरतों को पूरा करने औरपर्यावरणीय संकेतों 15,16 का जवाब देने के लिए विखंडन, संलयन और माइटोफैगी की लगातार प्रक्रियाओं से गुजर रहे हैं। इसके अलावा, माइटोकॉन्ड्रिया की आकृति विज्ञान उनके स्वास्थ्य की स्थिति से घनिष्ठ रूप से जुड़ा हुआ है। उदाहरण के लिए, मानव ऑप्टिक शोष में, आनुवंशिक उत्परिवर्तन है कि माइटोकॉन्ड्रियल गतिविधि को कम असामान्य, पतला और hyperfused mitochondria17 के लिए नेतृत्व. दूसरी ओर, विभिन्न प्रकार के मानव रोग माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान प्रस्तुत करते हैं, जिसमें माइटोकॉन्ड्रियल विखंडन या अत्यधिक माइटोकॉन्ड्रियल संलयन शामिल हैं, जिनका माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन (18 में समीक्षा) पर हानिकारक प्रभाव पड़ता है। पीडी के संदर्भ में, हम और दूसरों को पहले से पता चला है कि असामान्य माइटोकॉन्ड्रियल आकार α सिंक्यूक्लिन समुच्चय19 के जवाब में शिथिलता के साथ संबंधित है. जबकि माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान पीडी और अन्य बीमारियों20,21,22के संदर्भ में दोनों विट्रो में बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है, विवो वर्गों में से माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान के मूल्यांकन के लिए प्रोटोकॉल की कमी है। यह पीडी जैसे रोगों के संदर्भ में माइटोकॉन्ड्रिया के विवो अध्ययन में ट्रांसजेनिक जानवरों23 या मिडब्रेन अर्क के मूल्यांकन पर अत्यधिक निर्भर करता है जो सेलुलर संकल्प प्रदान नहीं कर सकता है।

यहां, पैराफिन-एम्बेडेड ऊतक वर्गों में छवि विश्लेषण के बाद माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन वीडीएसी1424 के इम्यूनोस्टेनिंग के आधार पर, उनकी कार्यात्मक स्थिति और स्वास्थ्य के संकेतक के रूप में सीटू में माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान का अध्ययन करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया जाता है। हम इन विट्रो और विवो पीडी मॉडल में इस प्रोटोकॉल के परिणाम भी दिखाते हैं: न्यूरोब्लास्टोमा कोशिकाएं एसएनसीए (सिंक्यूक्लिन अल्फा) को ओवरएक्सप्रेस करती हैं और चूहों से मस्तिष्क के ऊतकों को α-सिंक्यूक्लिन प्री-फॉर्म्ड फाइब्रिल (पीएफएफ) के इंट्राक्रैनील इंजेक्शन के अधीन करती हैं। α-सिंक्यूक्लिन (कोशिकाओं में) या फॉस्फोसेर129- α-सिंक्यूक्लिन पीएस129 (माउस दिमाग में) के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ सह-इम्यूनोस्टेनिंग ने हमें नमूनों में कुल प्रोटीन पैथोलॉजी (अतिरंजित α-सिंक्यूक्लिन और α-सिंक्यूक्लिन फाइब्रिल, क्रमशः) के साथ कोशिकाओं की पहचान करने की अनुमति दी, जबकि नकारात्मक कोशिकाओं ने एक ही नमूने के भीतर एक गैर-रोग नियंत्रण के रूप में कार्य किया। इस विश्लेषण और यहां वर्णित डेटा के माध्यम से, एक कम पहलू अनुपात देखा गया था, जो एसएनसीए को ओवरएक्सप्रेस करने वाली कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रिया के विखंडन को दर्शाता है या पीएस 129 घावों को प्रस्तुत करता है।

Protocol

इस खंड में वर्णित सभी प्रक्रियाओं को बास्क देश संदर्भ M20/2022/212, बास्क देश की सरकार, स्पेनिश सरकार और यूरोपीय संघ विश्वविद्यालय द्वारा प्रदान किए गए नैतिक ढांचे के अनुसार किया गया है।

1. एसएनसीए-ओवरएक्सप्रेस एसएच-एसवाई 5 वाई कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान विश्लेषण

नोट: यहां, अध्ययन के लिए इन विट्रो सामग्री की पीढ़ी का एक संक्षिप्त विवरण, जो सीटू प्राप्त परिणामों की तुलना के रूप में काम करेगा, प्रदान किया गया है। यह अनुशंसा की जाती है कि इस प्रकार का विश्लेषण माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान के लिए विवो प्रयोग शुरू करने से पहले किया जाता है, क्योंकि यह सुनिश्चित करेगा कि सभी उपयुक्त इमेजिंग और विश्लेषण सेटअप जगह में हैं।

  1. सेलुलर लगाव बढ़ाने और फ्लैट ऑप्टिकल नीचे 96 अच्छी तरह से प्लेटों पर सेलुलर आसंजन की सुविधा के लिए, पाइपिंग द्वारा DMEM F12 में कोटिंग मैट्रिक्स 1:1000 के 25 μL/अच्छी तरह से जोड़ें ( सामग्री की तालिकादेखें). 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर 1 घंटे के लिए प्लेटों को इनक्यूबेट करें।
  2. Neubauer कक्ष का उपयोग कर SH-SY5Y गणना. पाइपिंग द्वारा कोटिंग मैट्रिक्स निकालें, और डीएमईएम एफ -12 के 50 माइक्रोन/वेल में लेपित 96-वेल प्लेट पर बीज 10.000 कोशिकाओं/अच्छी तरह से 10% एफबीएस, 2 एमएम ग्लूटामाइन, और पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक ( सामग्री की तालिकादेखें)।
  3. कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस और 24 घंटे के लिए 5% सीओ2पर इनक्यूबेट करें।
  4. मानव जंगली प्रकार एसएनसीए, अभिकर्मक अभिकर्मक के 0.250 माइक्रोन, अभिकर्मक सहायक के 0.250 एल, और प्रत्येक अच्छी तरह से (सामग्री की तालिकादेखें) के लिए 50 माइक्रोन तक अभिकर्मक माध्यम ले जाने वाले पीसीडीएनए 3.1 के 250 एनजी का मिश्रण तैयार करें ( सामग्री की तालिकादेखें)। प्रयोग में कुओं की कुल संख्या पर विचार एक मास्टर समाधान तैयार करें।
  5. मैनुअल पाइपिंग द्वारा संस्कृति माध्यम निकालें और पाइपिंग द्वारा चरण 1.4 में तैयार समाधान के 50 माइक्रोन/अच्छी तरह से जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 पर सेते हैं।
  6. एच अभिकर्मक के बाद, पाइपिंग द्वारा अभिकर्मक माध्यम को हटा दें और पीबीएस में 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड (पीएफए) के 25 माइक्रोन/अच्छी तरह से जोड़ें।
    चेतावनी: पैराफॉर्मलडिहाइड एक विषाक्त लगानेवाला है; उपयुक्त पीपीई का उपयोग करें।
  7. कमरे के तापमान (आरटी) पर 5 मिनट के लिए सेते हैं. पाइपिंग द्वारा फिक्सिंग समाधान निकालें और पीबीएस के 50 माइक्रोन/अच्छी तरह से जोड़कर एक बार धो लें। पाइपिंग द्वारा पीबीएस निकालें।
  8. पिपेट 25 माइक्रोन/टीबीएस का कुआं 0.05% ट्वीन (टीबीएस-टी) और 10% सामान्य गधा सीरम (एनडीएस, सामग्री की तालिकादेखें) के साथ। आरटी पर 1 घंटे के लिए सेते हैं किसी भी अनिर्दिष्ट संकेत ब्लॉक करने के लिए.
  9. विश्लेषण करने के लिए कुओं की संख्या के अनुसार टीबीएस-टी में माउस-एंटी-टीओएमएम 20 एंटीबॉडी 1:100 के साथ खरगोश-विरोधी α-सिंक्यूक्लिन एंटीबॉडी एमजेएफआर 1 1: 1000 का समाधान तैयार करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
  10. पाइपिंग द्वारा चरण 1.8 से अवरुद्ध समाधान निकालें और चरण 1.9 में तैयार प्राथमिक एंटीबॉडी के मिश्रण के 25 माइक्रोन/अच्छी तरह से जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर सेते हैं।
  11. प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान निकालें और पाइपिंग द्वारा टीबीएस-टी के 50 माइक्रोन/अच्छी तरह से जोड़कर और हटाकर तीन बार धो लें।
  12. विश्लेषण करने के लिए कुओं की संख्या के अनुसार टीबीएस-टी में लाल माध्यमिक एंटीबॉडी एंटी-खरगोश 1:1000 के साथ हरे माध्यमिक एंटीबॉडी एंटी-माउस 1:1000 का समाधान तैयार करें ( सामग्री की तालिकादेखें)।
  13. चरण 1.11 में वर्णित अंतिम धोने से पीबीएस को महाप्राण करने के बाद, एक विंदुक का उपयोग करके माध्यमिक एंटीबॉडी मिश्रण के 25 माइक्रोन/अच्छी तरह से जोड़ें और आरटी पर 1 घंटे के लिए प्लेट को इनक्यूबेट करें।
  14. पाइपिंग द्वारा द्वितीयक एंटीबॉडी समाधान निकालें और टीबीएस-टी में 2 ग्राम/एमएल डीएपीआई के 25 माइक्रोन/वेल जोड़ें। आरटी पर 5 मिनट के लिए प्लेट सेते हैं।
  15. एक विंदुक का उपयोग कर डीएपीआई समाधान निकालें और एक विंदुक के साथ टीबीएस-टी के 50 माइक्रोन/अच्छी तरह से जोड़कर और हटाकर तीन बार धो लें।
  16. पिपेट 80 माइक्रोन/पीबीएस के अच्छी तरह से 0.02% सोडियम एज़ाइड के साथ और 4 डिग्री सेल्सियस पर थाली की दुकान.
    चेतावनी: सोडियम एज़ाइड विषाक्त है; उपयुक्त पीपीई का उपयोग करें।
  17. एक उच्च सामग्री स्वचालित प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप या समकक्ष confocal इमेजिंग एक 60x उद्देश्य ( सामग्री की तालिका) से लैस प्रणाली का उपयोग कर छवियों पर कब्जा.
  18. चरण 3.15-3.21 के बाद फिजी का उपयोग कर एकल कोशिकाओं के TOMM20 संकेत का विश्लेषण करें। एपोप्टोसिस, नेक्रोसिस या माइटोसिस से गुजरने वाली किसी भी कोशिका से बचें।
    नोट: ऐसा करने के लिए, हम एपोप्टोसिस, नेक्रोसिस, या माइटोसिस की उन रूपात्मक विशेषताओं को दिखाने वाली कोशिकाओं को विश्लेषण से बाहर करते हैं जो माइक्रोस्कोप के नीचे दिखाई देते हैं, जैसे सेल संकोचन, झिल्ली ब्लीबिंग, सेल टुकड़ी, परमाणु संघनन, डीएनए विखंडन, और संघनित परमाणु क्रोमैटिन एक ही विमान में संरेखित मोटी किस्में में आयोजित।

2. चूहों में पीएफएफ और पीएफएफ इंट्राक्रैनील इंजेक्शन की पीढ़ी

नोट: इंजेक्शन सामग्री की पीढ़ी और इंट्राक्रैनील इंजेक्शन प्रक्रिया यहां प्रस्तुत की गई है। यह प्रोटोकॉल लुक एट अल.25से अनुकूलित है।

  1. पीएफएफ प्राप्त करने के लिए, एक ट्यूब/फ्लास्क रखें जिसमें 0.5 एमएल α-सिन (5 मिलीग्राम / पेप्टाइड, सामग्री की तालिकादेखें) 37 डिग्री सेल्सियस और 250 आरपीएम पर एक प्रकार के बरतन पर 7 दिनों के लिए α-सिंक्यूक्लिन के एकत्रीकरण को प्रेरित करने के लिए।
  2. 20% आयाम और 0.25 चक्र कर्तव्य पर एकत्रित α-सिंक्यूक्लिन को सोनिकेट करें जब तक कि इष्टतम विखंडन प्राप्त नहीं किया गया था और ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के साथ नमूनों के नकारात्मक धुंधला द्वारा मनाया गया था।
  3. स्ट्रिआटल पीएफएफ इंजेक्शन के लिए नर और मादा जंगली प्रकार C57Bl/6 चूहों (3 महीने पुराना) तैयार करने के लिए, चमड़े के नीचे खारा समाधान में Meloxicam/Metacam (5 मिलीग्राम/किग्रा) का प्रशासन करें। इसके अलावा पशु प्रति दो 0.5 एमएल चमड़े के नीचे इंजेक्शन के माध्यम से बाँझ खारा समाधान के 1 एमएल प्रशासन. ये उपचार निर्जलीकरण, सूजन और दर्द को रोकते हैं।
  4. एक प्रेरण कक्ष में 4% isoflurane और 0.7 L/min O2 के साथ संज्ञाहरण प्रेरित करें। पेडल प्रतिक्रिया की कमी से संज्ञाहरण की गहराई की जाँच करें।
  5. माउस सिर के ऊपरी हिस्से दाढ़ी और धीरे एक गर्मी चटाई पर stereotactic तंत्र के फ्रेम में जानवर डालने.
  6. पूरे इंजेक्शन प्रक्रिया के दौरान एक चेहरे मुखौटा के माध्यम से पशु साँस लेना संज्ञाहरण (0.7 एल / मिनट ओ2 में 1% -2% Isoflurane) प्रदान करके संवेदनाहारी विमान को बनाए रखें।
  7. स्टीरियोटैक्टिक फ्रेम पर जानवर रखें। बारी-बारी से क्लोरहेक्सिडिन स्क्रब और 70% इथेनॉल के तीन राउंड के साथ ऑपरेटिंग क्षेत्र कीटाणुरहित करें। 0.25% के चमड़े के नीचे की घुसपैठ के रूप में स्थानीय रूप से (लगभग 100 μL) मार्केन/बुपीवाकाइन लागू करें।
  8. खोपड़ी का पर्दाफाश करने के लिए त्वचा का 0.5 सेमी चीरा प्रदर्शन करें और मस्तिष्क की सतह को बेनकाब करने के लिए खोपड़ी में 1 मिमी व्यास छेद ड्रिल करें, ब्रेग्मा से निम्नलिखित निर्देशांक में: - 0.5 मिमी anteroposterior, +/- 2.5 मिमी मध्यस्थ।
  9. चरण 2.2 में प्राप्त पीएफएफ के 1.5 एल को ब्रेग्मा से चरण 2.8 में इंगित निर्देशांक और -2.7 मिमी डोरसोवेंट्रल (शीर्ष मस्तिष्क से) को 32-जी हैमिल्टन सिरिंज के साथ 100 एनएल/मिनट की प्रवाह दर पर इंगित निर्देशांक द्वारा प्राप्त पीएफएफ के 1.5 एल इंजेक्ट करें। सिरिंज 5 मिनट के बाद इंजेक्शन वापस ले लें.
  10. सीवन (आकार: 4-0, 45 सेमी, सामग्री की तालिकादेखें) आवश्यकतानुसार तीन से पांच टांके के साथ घाव, और उनमें से प्रत्येक को 2 डबल समुद्री मील और फिर एक एकल गाँठ के साथ बंधन करें। संवेदनाहारी साँस लेना बंद करो और फ्रेम से माउस को हटा दें।
  11. माउस को अपने घर पिंजरे में लौटने से पहले एक उपयुक्त वसूली पिंजरे में ठीक करने के लिए छोड़ दें।
  12. अगले सप्ताह के दौरान, दैनिक पोस्टऑपरेटिव जांच करें। किसी भी जानवर के दर्द, संकट, या बेचैनी Meloxicam / Metacam के साथ dosed किया जाना चाहिए के रूप में कदम 2.3 हर 24 घंटे में संकेत दिया.
  13. तीन महीने बाद, एक इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन के माध्यम से खारा समाधान में 200 मिलीग्राम / एमएल सोडियम पेंटोबार्बिटल के 300 माइक्रोन इंजेक्ट करें। एक बार जब दर्द पलटा खो जाता है, तो छाती पर एक चीरा (2-3 सेमी) बनाएं और दिल को उजागर करने के लिए पसलियों को उठाएं।
  14. पीबीएस के 10 एमएल और पीबीएस में 4% पैराफॉर्मलडिहाइड के 35 एमएल के साथ ट्रांसकार्डियल रूप से परफ्यूज एक के बाद एक 5 एमएल/मिनट पर 23 जी तितली सुई से जुड़े 50 एमएल सिरिंज का उपयोग करके।
  15. 4 डिग्री सेल्सियस पर एक अतिरिक्त 24 घंटे के लिए 4% पीएफए में मस्तिष्क और पोस्टफिक्स निकालें। पीएफए उपचार के बाद इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर 70% इथेनॉल में स्टोर करें।
  16. मस्तिष्क को उपयुक्त प्लास्टिक एम्बेडिंग बक्से ( सामग्री की तालिकादेखें) में रखें और आरटी पर 1 घंटे के लिए 95% इथेनॉल में इनक्यूबेट करें, ताजा 95% इथेनॉल में कदम दोहराएं और 1 घंटे के लिए फिर से इनक्यूबेट करें।
  17. आरटी पर 1 घंटे के लिए 100% इथेनॉल के लिए दिमाग स्थानांतरित करें ताजा 100% इथेनॉल में कदम दोहराएं और 1 घंटे के लिए फिर से इनक्यूबेट करें।
  18. आरटी पर 1 घंटे के लिए xylene या xylene विकल्प में दिमाग स्थानांतरित करें ताजा समाधान में दोहराएं और 1 घंटे के लिए फिर से इनक्यूबेट करें।
  19. xylene या xylene विकल्प निकालें और 1 घंटे के लिए गर्म पैराफिन में नमूना सेते हैं. पैराफिन बदलें और एक अतिरिक्त घंटे के लिए सेते हैं.
  20. गर्म पैराफिन के साथ एम्बेडिंग बक्से पर मस्तिष्क माउंट और यह रात भर सूखी. एक माइक्रोटोम ( सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करके 5 माइक्रोन अनुभाग तैयार करें और उन्हें ग्लास स्लाइड पर माउंट करें।

3. पीएफएफ-इंजेक्शन चूहों से पैराफिन-एम्बेडेड मस्तिष्क स्लाइस पर इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री द्वारा माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान विश्लेषण

  1. दस बार xylene विकल्प में डुबकी द्वारा स्लाइड्स को मोम करें। xylene विकल्प में 2 मिनट के लिए स्लाइड सेते हैं. xylene विकल्प में दस बार फिर से डुबकी।
    नोट: पैराफिन को हटाने और नमूनों के पुनर्जलीकरण को सक्षम करने के लिए यह कदम आवश्यक है।
  2. पुनर्जलीकरण: निम्नलिखित समाधानों के साथ चरण 3.1 में वर्णित प्रक्रिया को दोहराएं: 100% EtOH, 95% EtOH, 70% EtOH, और क्रम में ddH2O के साथ दो बार।
  3. नीचे दिए गए चरणों का पालन करते हुए एंटीजन पुनर्प्राप्ति और इम्यूनोस्टेनिंग करें।
    1. नमूनों को डीडीएच2ओ के साथ माइक्रोवेव करने योग्य कंटेनर में स्थानांतरित करके शुरू करें।
    2. वार्म-अप 100x साइट्रेट बफर पीएच 6 ( सामग्री की तालिकादेखें) 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत (डिटर्जेंट अवक्षेपित हो सकता है) और ताजा 1x साइट्रेट बफर के 350 एमएल तैयार करें। फिर साइट्रेट बफर को ढक्कन के साथ एक सुविधाजनक प्लास्टिक कंटेनर में डालें।
    3. स्लाइड्स को साइट्रेट बफर कंटेनर में रखें (क्रिटिकल: जांचें कि स्लाइड बफर के स्तर से नीचे हैं) और ढक्कन लगाएं।
      चेतावनी: सुनिश्चित करें कि ढक्कन पूरी तरह से बंद नहीं है, अन्यथा कंटेनर माइक्रोवेव में फट सकता है।
    4. 700 डब्ल्यू पर माइक्रोवेव: 4 मिनट + 5 मिनट आराम, 1.5 मिनट + 5 मिनट आराम। टॉप-अप साइट्रेट बफर और माइक्रोवेव फिर से 1.5 मिनट + 5 मिनट आराम, 1.5 मिनट + 5 मिनट आराम, 1.5 मिनट + 5 मिनट आराम।
    5. 20 मिनट के लिए बर्फ पर साइट्रेट बफर में नमूने नीचे कूल. नमूना को डीडीएच2ओ से धो लें।
      नोट: एंटीजन पुनर्प्राप्ति विशिष्ट एंटीबॉडी आवश्यकताओं के अनुसार भिन्न हो सकती है।
  4. ऊतक को छूने के बिना कागज तौलिया के साथ नमूना स्लाइड सूखी. ऊतक के टुकड़ों के चारों ओर एक पैप पेन ( सामग्री की तालिकादेखें) के साथ आयत बनाएं।
  5. सभी स्लाइड्स को एक स्लाइड प्रतिरक्षा-धुंधला बॉक्स में स्थानांतरित करें और टीबीएस + 0.05% ट्वीन (टीबीएस-टी) के साथ धीरे से दो बार धो लें। जांचें कि टीबीएस-टी बूंदें पैप-पेन आयतों के अंदर रहती हैं।
  6. कागज तौलिया पर दोहन से नमूनों से टीबीएस-टी निकालें. प्रत्येक आयत (ऊतक को छूने के बिना) में एक अवरुद्ध समाधान (टीबीएस-टी में 10% एनडीएस) के 50 माइक्रोन जोड़ें और आरटी पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
    नोट: ऊतक के आकार के अनुसार वॉल्यूम भिन्न हो सकते हैं; यह सुनिश्चित करने का प्रयास करें कि: (1) पैप-पेन किया गया क्षेत्र नमूनों में समान है, और (2) क्षेत्र पूरी तरह से चुने हुए बफर वॉल्यूम द्वारा कवर किया गया है।
  7. एक कागज तौलिया नल से नमूनों से अवरुद्ध समाधान निकालें. टीबीएस-टी में निम्नलिखित प्राथमिक एंटीबॉडी मिश्रण के धीरे से पिपेट 50 माइक्रोन/आयत: एंटी-टायरोसिन हाइड्रॉक्सिलेज़ 1:250 एक साथ एंटी-वीडीएसी1 1:100 और एंटी-पीएसईआर129 α-सिंक्यूक्लिन EP1536Y 1:2000 ( सामग्री की तालिकादेखें)।
  8. 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर सेते हैं।
  9. स्लाइड्स पर टीबीएस-टी को पाइप करके धोएं और पेपर टॉवल पर टैप करके इसे हटा दें। तीन बार दोहराएं।
  10. माध्यमिक एंटीबॉडी मिश्रण के 50 माइक्रोन/आयत को पाइप करके जोड़ें: टीबीएस-टी में हरा माध्यमिक एंटी-चिकन, लाल माध्यमिक एंटी-माउस, और दूर लाल माध्यमिक एंटी-खरगोश 1:1000 ( सामग्री की तालिकादेखें)। अंधेरे में 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  11. चरण 3.13 में वर्णित टीबीएस-टी के साथ तीन बार धोएं।
  12. 1 मिनट के लिए टीबीएस-टी में डीएपीआई 2 माइक्रोग्राम/एमएल के साथ इनक्यूबेट करें। कागज़ के तौलिये पर टैप करके DAPI घोल निकालें। चरण 3.13 में वर्णित टीबीएस-टी के साथ तीन बार धोएं।
  13. बढ़ते अभिकर्मक की 2 बूंदों/स्लाइड का उपयोग करके नमूनों पर एक ग्लास कवरस्लिप माउंट करें ( सामग्री की तालिकादेखें)। बुलबुले को खत्म करने के लिए धीरे कवरस्लिप दबाएं और आरटी पर 1 घंटे के लिए नमूने सूखने दें बाद में, अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  14. 60x तेल उद्देश्य या कॉन्फोकल तकनीक से लैस संरचित रोशनी प्रतिदीप्ति इमेजिंग सिस्टम का उपयोग करके विभिन्न क्षेत्रों में कम से कम 50 कोशिकाओं की छवि।
  15. फिजी का उपयोग करके एकल कोशिकाओं के VDAC1 सिग्नल का विश्लेषण करें जैसा कि निम्न चरणों में दर्शाया गया है।
    1. सबसे पहले, सकारात्मक या नकारात्मक सेल (जैसा उपयुक्त हो) के चारों ओर एक समोच्च खींचकर और "फसल" फ़ंक्शन का उपयोग करके ब्याज के क्षेत्र (आरओआई) को चुनें और अलग करें। आरओआई चयन में पूर्वाग्रह से बचने के लिए, विश्लेषण से असंबंधित मार्कर के प्रतिदीप्ति संकेत पर विचार करके इसे चुनें (यानी, माइटोकॉन्ड्रियल मार्कर नहीं)।
  16. वैकल्पिक: यदि छवि अत्यधिक पिक्सेलयुक्त है, तो उच्च किनारे की परिभाषा प्राप्त करने के लिए "चिकनी" फ़ंक्शन का उपयोग करें।
    नोट: क्या चिकनी फ़ंक्शन को एक छवि पर लागू किया जाना चाहिए, कृपया इसे बाद की सभी छवियों पर लागू करें।
  17. वैकल्पिक: पृष्ठभूमि को कम करने के लिए "कॉन्वोल्व" फ़ंक्शन (कर्नेल मोड, प्रोसेस > फिल्टर में) का उपयोग करें।
    नोट: यह वैकल्पिक है और आमतौर पर वर्गों की पतली प्रकृति के कारण 5 मीटर वर्गों का उपयोग करते समय आवश्यक नहीं है।
  18. आकार वर्णनकर्ताओं को सक्रिय करें और "माप सेट करें" फ़ंक्शन पर थ्रेशोल्ड विकल्पों को सीमित करें (सुनिश्चित करें कि ये विश्लेषण के माध्यम से सक्रिय हैं)।
  19. "समायोजित करें" मेनू में, थ्रेशोल्ड फ़ंक्शन का चयन करें और थ्रेशोल्ड स्तर समायोजित करें। थ्रेशोल्ड सेटिंग्स एक ही नमूने के सभी कोशिकाओं के लिए बनाए रखा जाना चाहिए.
    1. माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क के पर्याप्त दृश्य को सुनिश्चित करने का प्रयास करें, जैसा कि इस आलेख की प्रतिनिधि छवियों में दिखाया गया है, जबकि पृष्ठभूमि पिक्सेल को त्यागते हुए।
  20. विश्लेषण टैब पर कणों का विश्लेषण करें उपकरण का उपयोग करें। माइटोकॉन्ड्रिया को पकड़ने के लिए एक उपयुक्त आकार निर्धारित करें। इस उदाहरण में, आकार: 25-इन्फिनिटी, सक्रिय करें: पिक्सेल इकाइयाँ, और चुनें: दिखाएँ: मास्क कमांड का उपयोग परिणाम को विज़ुअलाइज़ करने के लिए किया गया था। फिजी एक नए पैनल में गणना, पहलू अनुपात (एआर), और अन्य आकार मापदंडों की गणना और प्रदर्शन करेगा।
  21. उपयुक्त के रूप में डेटा का सांख्यिकीय विश्लेषण करें। इस प्रयोग में, टी-टेस्ट का उपयोग औसत पहलू अनुपात (एआर) में अंतर का विश्लेषण करने के लिए किया गया था और डी'ऑगस्टिनो और पियर्सन सामान्यता परीक्षणों के साथ सामान्यता परीक्षण के बाद प्रयोगात्मक समूहों के बीच फिजी द्वारा गणना की गई गणना की गई थी।

Representative Results

यह सुनिश्चित करने के लिए कि ऊतक में माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान के स्वस्थानी मूल्यांकन के लिए उपयुक्त इमेजिंग और विश्लेषण की स्थिति मौजूद है, माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान के ज्ञात न्यूनाधिक के जवाब में माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान के इन विट्रो अन्वेषण की सिफारिश की जाती है (धारा 1)। एक उदाहरण के रूप में, एसएनसीए आनुवंशिक रूप से एसएच-एसवाई 5 वाई कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान में परिवर्तन को प्रेरित करने के लिए अतिरंजित था जैसा कि पहले26 वर्णित था। अन्य अपमान जिन्हें माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान को खराब करने के लिए नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, भुखमरी या एमपीपी + जैसे माइटोकॉन्ड्रियल गतिविधि अवरोधकों का उपयोग होगा। कोशिकाओं को ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था और एसएनसीए + (एएस +) और एसएनसीए- (एएस-) कोशिकाओं को अलग करने के लिए α-सिंक्यूक्लिन (एएस) के लिए दाग दिया गया था। कोशिकाओं के माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क की कल्पना करने के लिए उन्हें TOMM2027 के साथ भी दाग दिया गया था। इस विश्लेषण को 5 माइक्रोन ऊतक अनुभाग के समान संभव बनाने के लिए, एक कॉन्फोकल विमान का विश्लेषण कई विमानों के अधिकतम प्रक्षेपण के विपरीत किया गया था। टीओएमएम 20 के एक कॉन्फोकल विमान के रूपात्मक विश्लेषण से पता चला है कि माइटोकॉन्ड्रिया की कुल संख्या और उनके पहलू अनुपात या एआर (जो ऑर्गेनेल के बढ़ाव के साथ संबंधित है) एसएनसीए ओवरएक्सप्रेशन(चित्रा 1)के जवाब में कम हो गए थे।

इम्यूनोस्टेनिंग माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन वीडीएसी 1 के लिए 5 माइक्रोन पैराफिन-एम्बेडेड माउस मस्तिष्क वर्गों में पीएफएफ के साथ इंजेक्शन वाले जानवरों से किया गया था जैसा कि ऊपर प्रोटोकॉल अनुभाग में वर्णित है। पर्याप्त नाइग्रा पार्स कॉम्पैक्टा (एसएनसी) डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स, जो पीडी में अध: पतन से गुजरते हैं, एंटी-टायरोसिन हाइड्रॉक्सिलस (टीएच) के साथ सह-इम्यूनोस्टेनिंग के माध्यम से प्रकट हुए थे और क्षेत्रीय रूप से वेंट्रल टेगमेंटल क्षेत्र और पर्याप्त नाइग्रा पार्स लेटरलिस से अलग हो गए थे। दूसरी ओर, एंटी-फॉस्फोसर129-α-सिंक्यूक्लिन (pS129) धुंधला हो जाना हमें उन कोशिकाओं को भेदभाव करने की अनुमति देता है जो स्वस्थ कोशिकाओं (pS129+ बनाम pS129-) से pS129 घावों को परेशान करती हैं। तीन अलग-अलग जानवरों की एसएनसी छवियां ली गईं, और टीएच-पॉजिटिव न्यूरॉन्स के वीडीएसी 1 धुंधला होने के बाद के छवि विश्लेषण से पीएस129 घावों वाले न्यूरॉन्स और न्यूरॉन्स के बीच माइटोकॉन्ड्रियल संख्या गणना और पहलू अनुपात दोनों में कमी का पता चला (चित्रा 2)। इन परिणामों से संकेत मिलता है कि pS129 घावों को शरण देने वाले न्यूरॉन्स की माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान pS129 घावों की कमी वाली कोशिकाओं की तुलना में बिगड़ा हुआ है।

हालांकि यह विशेष प्रयोग एआर में कमी दिखाता है, जिससे वैश्विक गणना में कमी के साथ माइटोकॉन्ड्रिया के बढ़ाव में कमी को उजागर किया जाता है, जो माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान के बिगड़ने का संकेत देता है, डेटा की व्याख्या प्रयोग पर निर्भर होनी चाहिए। उदाहरण के लिए, एआर और काउंट में कमी माइटोकॉन्ड्रियल सामग्री के साथ-साथ विखंडन में वैश्विक कमी को इंगित कर सकती है, जबकि एआर में कमी लेकिन वैश्विक गणना में वृद्धि एक माइटोकॉन्ड्रियल विखंडन फेनोटाइप को इंगित करेगी। इसलिए, दोनों उपायों के संदर्भ में डेटा की व्याख्या करना महत्वपूर्ण है।

Figure 1
चित्रा 1: इन विट्रो मॉडल में एक एसएनसीए-ओवरएक्सप्रेस में माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान। एसएनसीए-ओवरएक्सप्रेस पर टीओएमएम 20 (हरा), α-सिंक्यूक्लिन (एएस, लाल), और डीएपीआई (नीला) के लिए सह-इम्यूनोस्टेनिंग और ओवरएक्सप्रेस नहीं (एएस + और एएस-, क्रमशः) कोशिकाओं (ए)। एक एएस-सेल (बी) और एक एएस + सेल (सी) का विस्तार। पैनल (बी) और (सी) में काले और सफेद छवियां प्रोटोकॉल अनुभाग में वर्णित फिजी फ़ंक्शन को लागू करने के बाद TOMM20 सिग्नल के मास्क का प्रतिनिधित्व करती हैं। यह मुखौटा परिणामी संरचनाओं के आकार की मात्रा का ठहराव सक्षम बनाता है। माइटोकॉन्ड्रियल काउंट और एएस- और एएस + कोशिकाओं (एन = 25 कोशिकाओं प्रति शर्त) के पहलू अनुपात (एआर) मूल्यों को निर्धारित किया गया था और व्यक्तिगत मूल्यों के साथ-साथ एसईएम ± औसत के रूप में दर्शाया गया था; ** पी-मान 0.05 टी-टेस्ट (डी) <। D'Agostino और Pearson सामान्यता परीक्षणों के माध्यम से सामान्यता का आकलन किया गया था। स्केल बार: ए, 30 माइक्रोन; बी, सी, 5 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान pS129 घावों को परेशान करने वाले न्यूरॉन्स में प्रभावित होता है। PFF-इंजेक्शन चूहों (ए) के SNc के TH (हरा), VDAC1 (लाल), phosphoS129-α-synuclein (मैजेंटा), और DAPI (नीला) के लिए सह-immunostaining। एक phosphoS129-α-synuclein-नकारात्मक (pS129-) डोपामिनर्जिक न्यूरॉन (बी) और एक phosphoS129-α-synuclein-पॉजिटिव (pS129+) डोपामिनर्जिक न्यूरॉन (सी) का विस्तार। पैनल (बी) और (सी) में काले और सफेद छवियां प्रोटोकॉल अनुभाग में वर्णित फिजी फ़ंक्शन को लागू करने के बाद TOMM20 सिग्नल के मास्क का प्रतिनिधित्व करती हैं। यह मुखौटा परिणामी संरचनाओं के आकार की मात्रा का ठहराव सक्षम बनाता है। नकारात्मक और सकारात्मक कोशिकाओं को तीन अलग-अलग जानवरों के नमूनों में गिना गया था जैसा कि व्यक्तिगत रेखांकन मूल्यों (नीला, हरा और नारंगी) के विभिन्न रंगों द्वारा चित्रित किया गया था। माइटोकॉन्ड्रियल काउंट और पीएस129 की एआर मात्राएं- (एन = 29) बनाम पीएस129+ (एन = 22) डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स में एसईएम के साथ-साथ व्यक्तिगत सेल मूल्यों ± औसत के रूप में दर्शाया गया था; ** पी-मान 0.05 टी-टेस्ट (डी) <। D'Agostino और Pearson सामान्यता परीक्षणों के माध्यम से सामान्यता का आकलन किया गया था। स्केल बार: ए, 30 माइक्रोन; बी, सी, 5 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

कुल मिलाकर, इस अध्ययन से पता चलता है कि छवि विश्लेषण के साथ संयुक्त इम्यूनोस्टेनिंग माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान का विश्लेषण करने के लिए एक विश्वसनीय तरीका है। वास्तव में, यह माइटोकॉन्ड्रिया की संख्या के साथ-साथ सेल संस्कृति और ऊतक दोनों में पहलू अनुपात जैसे कुछ रूपात्मक मापदंडों की मात्रा निर्धारित करने की अनुमति देता है। माइटोकॉन्ड्रिया की संख्या सीधे नमूनों के विखंडन और संलयन तंत्र की कार्यात्मक स्थिति से जुड़ी होती है, जबकि एआर मूल्य ऑर्गेनेल के बढ़ाव पर निर्भर करता है। यह विधि पीडी के मॉडल में माइटोकॉन्ड्रियल असामान्यताओं के त्वरित मूल्यांकन के लिए विशेष रूप से मूल्यवान हो सकती है जिसमें परिवर्तित माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान, गतिशीलता और कार्य प्रसिद्ध रोगतंत्र28,29हैं। α-सिंक्यूक्लिन पीडी में भी एक प्रासंगिक भूमिका निभाता है: वास्तव में, α-सिंक्यूक्लिन लेवी बॉडीज के घटकों में से एक है, साइटोप्लास्मैटिक फाइब्रिलरी समुच्चय जो पीडी रोगियों के पोस्टमार्टम निदान के लिए उपयोग किए जाते हैं30. इसके अलावा, एसएनसीए जीन में उत्परिवर्तन परिचित और छिटपुट पीडी (31 में समीक्षा) दोनों के रोगियों में पाए गए। Ser129 पर α-सिंक्यूक्लिन के फॉस्फोराइलेशन को बड़े पैमाने पर लेवी-बॉडी जैसी विकृति को लेबल करने के लिए दिखाया गया है, जो पीएफएफ अपमान के बाद उभरता है औरविभिन्न विषाक्त प्रभाव32,26को प्राप्त करता है।

यहाँ प्रस्तुत उपकरण का उपयोग करना, हम दोनों overexpressed और एकत्रित α-synuclein (α-synuclein-धुंधला और phosphoSer129α-synuclein-पॉजिटिव घावों असर न्यूरॉन्स के साथ कोशिकाओं, क्रमशः) की उपस्थिति में माइटोकॉन्ड्रियल संख्या और एआर मूल्यों में कमी का पता लगाने में सक्षम थे, इस तरह के घावों की कमी कोशिकाओं की तुलना में (α-synuclein- और phosphoS129α-synuclein-नकारात्मक कोशिकाओं). ये परिणाम पिछली रिपोर्टों से सहमत हैं कि कैसे प्रत्यक्ष α-सिंक्यूक्लिन-माइटोकॉन्ड्रिया इंटरैक्शन पीडी26,33 34 में माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन और होमियोस्टेसिस पर विषाक्त प्रभाव पैदा करते हैं। दरअसल, यह बताया गया था कि α-सिंक्यूक्लिन म्यूटेशन वाले चूहों ने माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए क्षति 35 औरमाइटोफैगी 36,37 में वृद्धि की है। इसके अलावा, यह वर्णित किया गया था कि α-सिंक्यूक्लिन के स्तर में वृद्धि माइटोकॉन्ड्रियल विखंडन/विखंडन को बढ़ावा देती है, माइटोकॉन्ड्रिया के भीतर प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों को प्रेरित करती है, और सेल लाइनों और माउस मॉडल में माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन अभिव्यक्ति को α-सिंक्यूक्लिन 26,38,39को ओवरएक्सप्रेस करती है।

यह उजागर करना महत्वपूर्ण है कि यह उपकरण अध्ययन के लिए उपयोग किए जाने वाले एंटीबॉडी पर अत्यधिक निर्भर करता है; उपयोग किए गए एंटीबॉडी दाग का सावधानीपूर्वक रूपात्मक मूल्यांकन उपयुक्त उपकोशिकीय डिब्बे का पता लगाने के लिए अनिवार्य है। चूंकि यह तकनीक 5 माइक्रोन वर्गों पर आधारित है और इसलिए माइटोकॉन्ड्रियल संरचनाओं के विश्लेषण के लिए एकल फोकल विमानों की आवश्यकता होती है, फेनोटाइप की अनुपस्थिति एक फेनोटाइप के अस्तित्व से इंकार नहीं करेगी, क्योंकि यह संभव है कि माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान में सूक्ष्म अंतर इस विधि से पता नहीं लगाया जा सकता है।

हालांकि इस काम और अन्य लोगों ने पहले विवो40 में माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान का मूल्यांकन करने के लिए समान दृष्टिकोणों का उपयोग किया है, इस मूल्यांकन के लिए अनुसंधान समुदाय के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल सुलभ बनाने की आवश्यकता है। इस अध्ययन का महत्व यह है कि माइटोकॉन्ड्रियल रूपात्मक असामान्यताओं का आकलन करने और संभावित विकृति की पहचान करने के लिए विवो रोग मॉडल में विभिन्न के लिए इस पद्धति को लागू करना संभव है, जो अंततः इस तरह के विकारों के उपचार के लिए लीड यौगिकों की स्क्रीनिंग की सुविधा प्रदान कर सकता है। हालांकि यह विश्लेषण वर्तमान में पैराफिन-एम्बेडेड ऊतक तक सीमित है, विधि का लाभ यह है कि इसे टर्मिनल ऊतक संग्रह के बाद किसी भी रोग मॉडल पर लागू किया जा सकता है, जिससे यह एक बहुत ही बहुमुखी उपकरण बन जाता है।

Disclosures

हम हितों के टकराव की रिपोर्ट नहीं करना चाहते हैं।

Acknowledgments

हम इस अध्ययन के फंडर्स, विशेष रूप से इकरबास्क, स्पेनिश विज्ञान और नवाचार मंत्रालय, माइकल जे फॉक्स फाउंडेशन, आईबीआरओ और अचुकारो बास्क सेंटर फॉर न्यूरोसाइंस को स्वीकार करना चाहते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
32 G Hamilton syringe Hamilton 7632-01
4',6-diamidino-2-fenilindol, dihidrocloruro (DAPI) Invitrogen D1306
4/0 USP 45 cm suture SSa90 pga  32345n-36u
Alexa fluor 488/594-Donkey anti-Mouse  Invitrogen A21202; A21203 green/red dye-Donkey anti-Mouse
Alexa fluor 594/647-Donkey anti-Rabbit  Invitrogen A21207 A31573 red/far red dye-Donkey anti-Rabbit
AlexaFluor 488-Donkey anti-Chicken  Jackson ImmunoResearch 703-545-155 green dye-Donkey anti-Chicken
Anti-PSer129 α-synuclein EP1536Y (Rabbit) antibody Abcam ab51253
Anti-TOM 20 (Mouse) antibody Santa Cruz sc-17764
Anti-Tyrosine Hydroxylase (Chicken) antibody Abcam ab76442
Anti-VDAC1 (Mouse) antibody Santa Cruz sc-390996
Anti-α-synuclein antibody MJFR1 (Rabbit) Abcam ab138501
Citrate buffer 100X stock: 120mM citrate buffer, 5% Tween in water (pH 6) Home-made
Disposable base mold for tissue embedding Fisher 22-363-553 Plastic embedding boxes
D-MEM F12 Gibco A321331020
EVOS M7000 Imaging System ThermoFisher Scientific High-content automated fluorescence microscope
Fetal Bovine Serum Gibco 10270106
Flat optical bottom 96 well plates  Greiner 675090
FluorSave Reagent Millipore 345789-20ML Mounting reagent
Glutamine 200 mM Gibco 25030-024
ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen Vector Laboratories H-4000 PAP-pen
Lipofectamine and Plus Reagent  Invitrogen 11668-019; 11514-015 Transfection reagent and transfection adjuvant
Matrigel Corning 354230 Coating matrix
Microtome ThermoFisher Scientific
Normal Donkey Serum  Gibco PCN5000
Opti-MEM Gibco 31985070 Transfection medium
PCDNA4 plasmid (backbone) Addgene 41036
Penicillin/Streptomycin solution Gibco 15140-122
SH-SY5Y cells/well ATCC HTB-11
Xylene substitute Labbox 22L36504
Zeiss Axio Imager Apotome 2 Carl Zeiss Structured illumination fluorescence imaging system 
α-synuclein peptide rpeptide  S-1010-2

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हिस्टोलॉजिकल परीक्षा माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान पार्किंसंस रोग मॉडल माइटोकॉन्ड्रिया ऊर्जा चयापचय न्यूरॉन्स माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन न्यूरोलॉजिकल विकार आकार और माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क का संगठन इम्यूनोस्टेनिंग वीडीएसी 1 प्रोटीन छवि विश्लेषण न्यूरोडीजेनेरेटिव विकार ±-सिंक्यूक्लिन एग्रीगेट्स पार्किंसंस रोग पैथोलॉजी सब्सटेंशिया नाइग्रा पार्स कॉम्पैक्टा डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स पीएस 129 घाव माइटोकॉन्ड्रियल विखंडन
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Ciceri, D., Gregorio-Zabala, L., Llama-Pino, X., Kurt, B., Olano-Bringas, J., Villegas-Zafra, P., Bengoa-Vergniory, N. Histological Examination of Mitochondrial Morphology in a Parkinson's Disease Model. J. Vis. Exp. (196), e65453, doi:10.3791/65453 (2023).

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