Limosilactobacillus reuteri DSM20016의 전기천공 및 변형 확인 방법
Summary
여기에서는 리 모실락토바실러스 루테리 DSM20016 작업을 위한 프로토콜, 성장, 플라스미드 형질전환, 콜로니 PCR, 형광 리포터 단백질 측정, 제한된 플라스미드 미니 프렙, 일반적인 문제 및 문제 해결을 자세히 설명합니다. 이러한 프로토콜을 통해 DSM20016에서 리포터 단백질을 측정하거나 리포터가 관여하지 않는 경우 콜로니 PCR을 통해 확인할 수 있습니다.
Abstract
락토바실러스 는 261종으로 구성된 믿을 수 없을 정도로 크고 다양한 박테리아 속으로, 그 중 일부는 위장관 내에서 합성 생물학적 노력을 위한 섀시로 사용할 수 있는 공생 균주였습니다. 속 내에서 관찰된 광범위한 표현형 및 유전형 변이로 인해 최근 재분류와 23개의 새로운 속이 도입되었습니다.
이전 속의 다양한 변형으로 인해 한 구성원에서 입증된 프로토콜이 다른 구성원과 함께 광고된 대로 작동하지 않을 수 있습니다. 특정 균주를 정확히 조작하는 방법에 대한 중앙 집중식 정보가 부족하여 종종 다른 박테리아 계열에서 채택된 다양한 임시 접근 방식이 도입되었습니다. 이것은 현장에서 시작하는 연구자들에게 문제를 복잡하게 만들 수 있으며, 어떤 정보가 자신이 선택한 균주에 적용되는지 또는 적용되지 않는지 모를 수 있습니다.
이 백서에서는 특히 리모실락토바실러스 루테리 균주 명칭 F275(기타 수집 번호: DSM20016, ATCC23272, CIP109823)에서 입증된 성공 프로토콜 세트와 함께 문제 해결 조언 및 발생할 수 있는 일반적인 문제를 중앙 집중화하는 것을 목표로 합니다. 이러한 프로토콜은 L. 루테리 DSM20016 사용한 경험이 거의 또는 전혀 없는 연구자가 플라스미드를 형질전환하고, 형질전환을 확인하고, 리포터 단백질을 통해 플레이트 판독기에서 시스템 피드백을 측정할 수 있도록 해야 합니다.
Introduction
락토바실러스(Lactobacillus) 속은 역사적으로 그람 양성, 막대 모양, 포자 형성이 없는 통성 혐기성 세균 또는 주로 젖산1을 생성하기 위해 당을 분해하는 미세호기성 미생물로 분류되었습니다. 이러한 느슨한 기준으로 인해 락토바실러스는 표현형적으로나 유전형적으로 매우 다양한 속이 되었습니다. 이러한 광범위한 분류로 인해 속이 재분류되어 2020년에 23개의 새로운 속이 도입되었습니다2.
오래되고 더 넓은 속(genus)에는 일반적으로 섭취하기에 안전한 것으로 간주되는(GRAS) 주요 공생 및 프로바이오틱 종(probiotic species)이 포함되었다3. 락토바실라과(Lactobacillaceae)는 다양한 균주 4,5,6,7의 섭취를 통해 제공되는 많은 보고된 건강상의 이점으로 인해 ‘좋은 박테리아’라는 대중의 인식을 유지하고 있습니다. 위장관을 쉽게 탐색할 수 있는 방법8과 대중의 인정은 락토바실라과(Lactobacillaceae) 균주를 섭취 가능한 의약, 치료 또는 진단 응용 분야를 위한 섀시 유기체와 같은 강력한 후보로 포지셔닝합니다.
Lactobacillaceae 계통에 존재하는 광범위한 특성으로 인해 사실상의 모델-유기체 균주가 없는 상황이 발생했습니다. 연구 그룹은 특정 목표와 가장 관련이있는 특성을 가진 종을 선택하는 경향이 있습니다. (예를 들어, 유제품 발효 실험실은 L. lactis를 선택할 수 있고, 식물성 발효 연구는 L. plantarum을 선택할 수 있으며, 프로바이오틱스에 대한 연구는 L. acidophilus에 초점을 맞출 수 있습니다.)
종에 걸친 이와 같은 광범위한 특성으로 인해 락토바실라과(Lactobacillaceae ) 계열의 한 하위 집합에서는 잘 작동할 수 있지만 다른 부분집합에서는 효율적으로 작동하기 위해(또는 전혀 기능하지 않는) 최적화가 필요한 프로토콜과 절차가 축적되었습니다9. 가족 구성원 간, 심지어 같은 종의 구성원 내에서도 최적화에 대한 이러한 필요성은 익숙하지 않은 연구자의 노력을 좌절시킬 수 있습니다. 논문의 방법 섹션에 발표된 프로토콜은 또한 그들 자신의 수정(10)을 포함할 수 있으며, 이는 단편화되고 분산된 프로토콜 모음으로 이어진다.
L. 루테리(L. reuteri)는 포유류, 조류11 및 어류12 위장관(GI)에서 일관되게 발견되는 널리 척추동물 공생동물로 여겨진다. L. 루테리 하위 균주는 종종 점액 접착 단백질 적응을 통해 유전적으로 특수화되어 특정 토착 숙주를 보다 영구적으로 식민지화합니다 8,11,13. 위장관 리모실락토바실러스(Limosilactobacillus) 종은 본래 숙주 외부의 숙주에서 분리될 수 있지만, 일시적인 성질을 띠는 경향이 있다8.
인간-숙주 전문화로 인해 L. 루테리 DSM20016는 인간 위장관의 어느 지점에서든 진단 또는 치료 적용을 위한 섀시로 매우 잘 자리 잡았으며, 균주 DSM20016은 더 일시적인 균주와 비교할 때 중재에 더 오래 지속되는 효과 창을 제공할 수 있습니다.
이 논문에서는 분자 및 시스템 생물학 응용 분야에 도움이 되는 다른 출처의 균주에 대한 중앙 집중식 정보와 함께 Limosilactobacillus reuteri( 균주 명칭: F275, 기타 수집 번호: DSM20016, ATCC23272, CIP109823)에서 효과가 입증된 일련의 프로토콜을 간략하게 설명합니다. 여기에 제시된 절차는 L. reuteri를 배양하고, 전기적격 스톡을 생성하고, 형질전환된 콜로니를 선택하고, 콜로니 중합효소 연쇄 반응(PCR) 을 통해 형질을 확인하고, 형광 리포터 단백질을 통해 설계된 시스템 반응을 측정할 수 있도록 해야 합니다.
관련 프로토콜은 L. 루테리(L. reuteri, 균주: ATCC-PTA-6475)14에서 CRISPR-Cas9 보조 ssDNA 게놈 재조합 및 여러 non-L에서 CRSIPR-Cas9 nickase-assisted genome editing을 다루었습니다. 루테리, 락토바실라과(Lactobacillaceae) 계열 염색15,16; 그러나 이것들은 여기서 우리가 초점을 맞추는 L. reuteri DSM20016 균주를 다루지 않습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
L. 루테리 DSM20016의 형질전환을 위한 가장 중요한 단계는 형질전환이 도금된 후 혐기성 성장 조건의 생성입니다. 호기성 조건에서 얻은 콜로니는 매우 가끔씩만 발생하며 일반적으로 MRS 국물에 접종하면 성장하지 않습니다. 콜로니 성장 가능성을 최대화하기 위해 전체 회수량을 도금하는 것도 연습해야 합니다. 이 두 가지 중요한 단계에도 불구하고, 형질전환 효율은 여전히 실험의 한계이?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
L. 루테리 ATCC PTA 6475 사용에 대한 지침을 통해 여기에 설명된 방법의 기초를 제공한 J.P. van Pijkeren 교수(University of Wisconsin-Madison)의 귀중한 조언에 깊은 감사를 드립니다.
Materials
| 1 kb Plus DNA Ladder | NEB | N3200L | |
| 1mL Spectrophotometer cuvettes | Thomas Scientific | 1145J12 | |
| Agarose | BioShop | AGR001 | |
| Allegra X-15R (refrigerated centrifuge) | Beckman Allegra | N/A | No longer in production |
| AnaeroGen 2.5 L Sachet | Thermo Scientific | OXAN0025A | |
| BTX, ECM 399 electroporation system | VWR | 58017-984 | |
| Centrifuge tubes (50 mL) | FroggaBio | TB50-500 | |
| DNA gel x6 loading dye | NEB | B7024S | |
| Electroporation cuvette | Fisherbrand | FB101 | |
| Erythromycin | Millipore Sigma | E5389-5G | |
| Gel electroporation bath/dock | VWR | 76314-748 | |
| Glycerol | BioShop | GLY001 | |
| Limosilactobacillus reuteri | Leibniz Institute DSMZ | DSM20016 | Strain designation F275 |
| Lysozyme | BioShop | LYS702.5 | |
| Microcentrifuge tubes (1.7 mL) | FroggaBio | LMCT1.7B | |
| Miniprep kit (Qiagen) | Qiagen | 27106 | slpGFP replaced with constitutive, codon optimised, mCherry2 reporter protein |
| MRS Broth (Dehydrated) | Thermo Scientific | CM0359B | |
| Mutanolysin | Millipore Sigma | M9901-5KU | |
| NaOH | Millipore Sigma | 1064691000 | |
| P100 Pipette | Eppendorf | 3123000047 | |
| P1000 Pipette | Eppendorf | 3123000063 | |
| P2.5 Pipette | Eppendorf | 3123000012 | |
| P20 Pipette | Eppendorf | 3123000039 | |
| P200 Pipette | Eppendorf | 3123000055 | |
| PCR tubes | FroggaBio | STF-A120S | |
| Personal benchtop microcentrifuge | Genlantis | E200100 | |
| Petri dishes | VWR | 25384-088 | |
| PTC-150 Thermal Cycler | MJ Research | N/A | No longer in production |
| pTRKH3_slpGFP (modified) | Addgene | 27168 | |
| SPECTRONIC 200 Spectrophotometer | Thermo Scientific | 840-281700 | |
| Storage microplate | Fisher Scientific | 14-222-225 | |
| Sucrose | BioShop | SUC507 | |
| TAE Buffer 50x | Thermo Scientific | B49 | |
| Vortex | VWR | 58816-121 | No longer in production |
| VWR 1500E incubator | VWR | N/A | No longer in production |
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