Metoder til bekræftelse af elektroporation og transformation i Limosilactobacillus reuteri DSM20016
Summary
Her præsenterer vi protokoller til at arbejde med Limosilactobacillus reuteri DSM20016, der beskriver vækst, plasmidtransformation, koloni-PCR, fluorescerende reporterproteinmåling og begrænset plasmid mini-prep samt almindelige problemer og fejlfinding. Disse protokoller tillader måling af reporterproteiner i DSM20016 eller bekræftelse via koloni-PCR, hvis ingen indberetter er involveret.
Abstract
Lactobacillus var en utrolig stor, forskelligartet slægt af bakterier bestående af 261 arter, hvoraf flere var kommensale stammer med potentiale til brug som chassis for syntetiske biologiske bestræbelser i mave-tarmkanalen. Den store fænotypiske og genotypiske variation, der blev observeret inden for slægten, førte til en nylig omklassificering og introduktionen af 23 nye slægter.
På grund af bredden af variationer inden for de gamle slægter fungerer protokoller, der er demonstreret i et medlem, muligvis ikke som annonceret med andre medlemmer. Mangel på centraliseret information om, hvordan man præcist manipulerer specifikke stammer, har ført til en række ad hoc-tilgange , ofte tilpasset fra andre bakteriefamilier. Dette kan komplicere tingene for forskere, der starter i marken, som måske ikke ved, hvilke oplysninger der gælder eller ikke gælder for deres valgte stamme.
I dette papir sigter vi mod at centralisere et sæt protokoller med demonstreret succes, specifikt i Limosilactobacillus reuteri stammebetegnelsen F275 (andre indsamlingsnumre: DSM20016, ATCC23272, CIP109823) sammen med fejlfindingsråd og almindelige problemer, man kan støde på. Disse protokoller skal gøre det muligt for en forsker med ringe eller ingen erfaring med at arbejde med L. reuteri DSM20016 at omdanne et plasmid, bekræfte transformation og måle systemfeedback i en pladelæser via et reporterprotein.
Introduction
Slægten Lactobacillus blev historisk klassificeret som gram-positive, stavformede, ikke-sporedannende, enten fakultative anaerober eller mikroaerofiler, der nedbryder sukker til primært at producere mælkesyre1. Disse løse kriterier førte til, at Lactobacillus er, fænotypisk og genotypisk, en ekstremt forskelligartet slægt. Denne brede kategorisering resulterede i, at slægten blev omklassificeret og introducerede 23 nye slægter i 20202.
Den gamle, bredere slægt omfattede vigtige kommensale og probiotiske arter, der generelt betragtes som sikre (GRAS) til forbrug3. Den Lactobacillaceae familie opretholder en offentlig opfattelse af at være ‘gode bakterier’ på grund af mange rapporterede sundhedsmæssige fordele skænket via forbruget af forskellige stammer 4,5,6,7. Den lethed, hvormed de kan navigere i mave-tarmkanalen8 og deres offentlige accept kombinere for at positionere Lactobacillaceae stammer som stærke kandidater som chassis organismer til indtagelige medicinske, terapeutiske, eller diagnostiske applikationer.
Den brede vifte af egenskaber, der findes inden for Lactobacillaceae-familien , har ført til en situation, hvor der ikke er nogen de facto-modelorganismestamme ; Forskergrupper har haft tendens til at vælge arter med de egenskaber, der er mest relevante for deres særlige mål. (For eksempel kan mejerifermenteringslaboratorier vælge L. lactis; undersøgelser af vegetabilsk fermentering kan vælge L. plantarum; forskning i probiotika kan fokusere på L. acidophilus; og så videre.)
Den samme brede vifte af egenskaber på tværs af arter har ført til en ophobning af protokoller og procedurer, der kan fungere godt for en delmængde af Lactobacillaceae familien, men kræver optimering til at arbejde effektivt (eller måske til at fungere overhovedet) i andre9. Dette behov for optimering mellem familiemedlemmer og endda inden for medlemmer af samme art kan frustrere indsatsen fra ukendte forskere. Protokoller offentliggjort i metodeafsnittene i papirer kan også omfatte deres egne ændringer10, hvilket fører til fragmenterede, decentraliserede protokolsamlinger.
L. reuteri betragtes som et bredt hvirveldyr kommensal, der findes konsekvent i pattedyr, fugle11 og fisk12 gastrointestinale (GI) kanaler. L. reuteri sub-stammer er ofte genetisk specialiseret, via slim adhæsion protein tilpasning, til mere permanent kolonisere specifikke indfødte værter 8,11,13. GI-kanal Limosilactobacillus arter kan isoleres i værter uden for deres oprindelige vært, men har tendens til mere mod en forbigående natur8.
På grund af specialisering mellem mennesker og værter positionerer L. reuteri sig DSM20016 meget godt som et chassis til diagnostiske eller terapeutiske anvendelser på ethvert tidspunkt i den menneskelige mave-tarmkanal, og den stamme, DSM20016 kunne give et længerevarende effektvindue for interventioner sammenlignet med mere forbigående stammer.
I dette papir skitserer vi en række protokoller med demonstreret effektivitet i Limosilactobacillus reuteri (stammebetegnelse: F275; andre indsamlingsnumre: DSM20016, ATCC23272, CIP109823) sammen med centraliseret information om stammen fra andre kilder til hjælp i molekylære og systembiologiske applikationer. Procedurer, der er fastlagt heri, skal gøre det muligt for en forsker uden forudgående erfaring at dyrke L. reuteri, skabe elektrokompetente lagre, vælge transformerede kolonier, bekræfte transformation via kolonipolymerasekædereaktion (PCR) og måle designet systemrespons via fluorescerende reporterproteiner.
Vi bemærker, at relaterede protokoller har dækket CRISPR-Cas9-assisteret ssDNA-genomrekombinering i L. reuteri (stamme: ATCC-PTA-6475)14 og CRSIPR-Cas9 nickase-assisteret genomredigering i flere ikke-L. reuteri, Lactobacillaceae familie pletter15,16; Disse adresserer imidlertid ikke L. reuteri DSM20016 stamme, som er vores fokus her.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det mest kritiske trin for transformationen af L. reuteri DSM20016 er dannelsen af anaerobe vækstbetingelser efter transformationer er belagt; kolonier opnået under aerobe forhold er kun meget lejlighedsvise og vokser generelt ikke, når de podes i MRS-bouillon. Plating hele genopretningsvolumenet bør også praktiseres for at maksimere sandsynligheden for kolonivækst. Selv med disse to kritiske trin er transformationseffektivitet stadig en begrænsning for eksperimentering, da forventede kolonier kan tælle …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi sætter stor pris på det værdifulde råd fra professor J.P. van Pijkeren (University of Wisconsin-Madison), hvis vejledning om at arbejde med L. reuteri ATCC PTA 6475 gav et fundament for de metoder, der er beskrevet her.
Materials
| 1 kb Plus DNA Ladder | NEB | N3200L | |
| 1mL Spectrophotometer cuvettes | Thomas Scientific | 1145J12 | |
| Agarose | BioShop | AGR001 | |
| Allegra X-15R (refrigerated centrifuge) | Beckman Allegra | N/A | No longer in production |
| AnaeroGen 2.5 L Sachet | Thermo Scientific | OXAN0025A | |
| BTX, ECM 399 electroporation system | VWR | 58017-984 | |
| Centrifuge tubes (50 mL) | FroggaBio | TB50-500 | |
| DNA gel x6 loading dye | NEB | B7024S | |
| Electroporation cuvette | Fisherbrand | FB101 | |
| Erythromycin | Millipore Sigma | E5389-5G | |
| Gel electroporation bath/dock | VWR | 76314-748 | |
| Glycerol | BioShop | GLY001 | |
| Limosilactobacillus reuteri | Leibniz Institute DSMZ | DSM20016 | Strain designation F275 |
| Lysozyme | BioShop | LYS702.5 | |
| Microcentrifuge tubes (1.7 mL) | FroggaBio | LMCT1.7B | |
| Miniprep kit (Qiagen) | Qiagen | 27106 | slpGFP replaced with constitutive, codon optimised, mCherry2 reporter protein |
| MRS Broth (Dehydrated) | Thermo Scientific | CM0359B | |
| Mutanolysin | Millipore Sigma | M9901-5KU | |
| NaOH | Millipore Sigma | 1064691000 | |
| P100 Pipette | Eppendorf | 3123000047 | |
| P1000 Pipette | Eppendorf | 3123000063 | |
| P2.5 Pipette | Eppendorf | 3123000012 | |
| P20 Pipette | Eppendorf | 3123000039 | |
| P200 Pipette | Eppendorf | 3123000055 | |
| PCR tubes | FroggaBio | STF-A120S | |
| Personal benchtop microcentrifuge | Genlantis | E200100 | |
| Petri dishes | VWR | 25384-088 | |
| PTC-150 Thermal Cycler | MJ Research | N/A | No longer in production |
| pTRKH3_slpGFP (modified) | Addgene | 27168 | |
| SPECTRONIC 200 Spectrophotometer | Thermo Scientific | 840-281700 | |
| Storage microplate | Fisher Scientific | 14-222-225 | |
| Sucrose | BioShop | SUC507 | |
| TAE Buffer 50x | Thermo Scientific | B49 | |
| Vortex | VWR | 58816-121 | No longer in production |
| VWR 1500E incubator | VWR | N/A | No longer in production |
References
- Makarova, K., et al. Comparative genomics of the lactic acid bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (42), 15611-15616 (2006).
- Zheng, J., et al. A taxonomic note on the genus Lactobacillus: Description of 23 novel genera, emended description of the genus Lactobacillus beijerinck 1901, and union of Lactobacillaceae and Leuconostocaceae. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 70 (4), 2782-2858 (2020).
- Adams, M. R., Marteau, P. On the safety of lactic acid bacteria from food. International Journal of Food Microbiology. 27 (2-3), 263-264 (1995).
- Urbańska, M., Gieruszczak-Białek, D., Szajewska, H. Systematic review with meta-analysis: Lactobacillus reuteri DSM 17938 for diarrhoeal diseases in children. Alimentary Pharmacology and Therapeutics. 43 (10), 1025-1034 (2016).
- Jansson, P. A., et al. Probiotic treatment using a mix of three Lactobacillus strains for lumbar spine bone loss in postmenopausal women: a randomised, double-blind, placebo-controlled, multicentre trial. The Lancet Rheumatology. 1 (3), e154-e162 (2019).
- Yang, C., et al. Effects of non-viable Lactobacillus reuteri combining with 14-day standard triple therapy on Helicobacterpylori eradication: A randomized double-blind placebo-controlled trial. Helicobacter. 26 (6), 12856 (2021).
- Nikawa, H., et al. Lactobacillus reuteri in bovine milk fermented decreases the oral carriage of mutans streptococci. International Journal of Food Microbiology. 95 (2), 219-223 (2004).
- Reuter, G. The Lactobacillus and Bifidobacterium microflora of the human intestine: Composition and succession. Current Issues in Intestinal Microbiology. 2 (2), 43-53 (2001).
- Aukrust, T. W., Brurberg, M. B., Nes, I. F. Transformation of Lactobacillus by electroporation. Methods in Molecular Biology. 47, 201-208 (1995).
- Lubkowicz, D., et al. Reprogramming probiotic Lactobacillus reuteri as a biosensor for Staphylococcus aureus derived AIP-I detection. ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1229-1237 (2018).
- Walter, J., Britton, R. A., Roos, S. Host-microbial symbiosis in the vertebrate gastrointestinal tract and the Lactobacillus reuteri paradigm. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 4645-4652 (2011).
- Ahmad, W., et al. Production of bimodal molecular weight levan by a Lactobacillus reuteri isolate from fish gut. Folia Microbiologica. 67 (1), 21-31 (2022).
- MacKenzie, D. A., et al. Strain-specific diversity of mucus-binding proteins in the adhesion and aggregation properties of Lactobacillus reuteri. Microbiology. 156 (11), 3368-3378 (2010).
- Oh, J. H., van Pijkeren, J. P. CRISPR-Cas9-assisted recombineering in Lactobacillus reuteri. Nucleic Acids Research. 42 (17), 131 (2014).
- Song, X., Huang, H., Xiong, Z., Ai, L., Yang, S. CRISPR-Cas9D10A nickase-assisted genome editing in Lactobacillus casei. Applied and Environmental Microbiology. 83 (22), e01259 (2017).
- Goh, Y. J., Barrangoua, R. Portable CRISPR-Cas9N system for flexible genome engineering in Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus gasseri, and Lactobacillus paracasei. Applied and Environmental Microbiology. 87 (6), e02669 (2021).
- Berthier, F., Zagorec, M., Champomier-Verg, M., Ehrlich, S. D., Morel-Devillel, F. Efficient transformation of Lactobacillus sake by electroporation. Microbiology. 142 (5), 1273-1279 (1996).
- Rattanachaikunsopon, P., Phumkhachorn, P. Glass bead transformation method for gram-positive bacteria. Brazilian Journal of Microbiology. 40 (4), 923 (2009).
- Pflügl, S., Marx, H., Mattanovich, D., Sauer, M. Genetic engineering of Lactobacillus diolivorans. FEMS Microbiology Letters. 344 (2), 152-158 (2013).
- Spath, K., Heinl, S., Grabherr, R. Direct cloning in Lactobacillus plantarum: Electroporation with non-methylated plasmid DNA enhances transformation efficiency and makes shuttle vectors obsolete. Microbial Cell Factories. 11, 141 (2012).
- Ortiz-Velez, L., et al. Genome alterations associated with improved transformation efficiency in Lactobacillus reuteri. Microbial Cell Factories. 17 (1), 138 (2018).
- O’Sullivan, D. J., Klaenhammer, T. R. Rapid mini-prep isolation of high-quality plasmid DNA from Lactococcus and Lactobacillus spp. Applied and Environmental Microbiology. 59 (8), 2730-2733 (1993).
- Lizier, M., Sarra, P. G., Cauda, R., Lucchini, F. Comparison of expression vectors in Lactobacillus reuteri strains. FEMS Microbiology Letters. 308 (1), 8-15 (2010).
- Roberts, R. J., Vincze, T., Posfai, J., Macelis, D. REBASE-a database for DNA restriction and modification: Enzymes, genes and genomes. Nucleic Acids Research. 43, D298-D299 (2015).
- Ahrne, S., Molin, G., Axelsson, L. Transformation of Lactobacillus reuteri with electroporation: Studies on the erythromycin resistance plasmid pLUL631. Current Microbiology. 24, 199-205 (1992).
