Summary
Här presenterar vi ett protokoll som möjliggör snabb, robust och billig tillverkning av tumörsfäroider följt av hydrogelinkapsling. Det är allmänt tillämpligt eftersom det inte kräver specialutrustning. Det skulle vara särskilt användbart för att utforska sfäroid-matrisinteraktioner och bygga in vitro-vävnadsfysiologi eller patologimodeller.
Abstract
Tredimensionell (3D) inkapsling av sfäroider är avgörande för att på ett adekvat sätt replikera tumörmikromiljön för optimal celltillväxt. Här designade vi en in vitro 3D-glioblastommodell för sfäroidinkapsling för att efterlikna tumörens extracellulära mikromiljö. Först formade vi fyrkantiga pyramidala mikrobrunnsformar med hjälp av polydimetylsiloxan. Dessa mikrobrunnsformar användes sedan för att tillverka tumörsfäroider med noggrant kontrollerade storlekar från 50-500 μm. När sfäroider väl hade bildats skördades de och kapslades in i polyetylenglykol (PEG)-baserade hydrogeler. PEG-hydrogeler är en mångsidig plattform för sfäroidinkapsling, eftersom hydrogelegenskaper som styvhet, nedbrytbarhet och cellvidhäftning kan justeras oberoende av varandra. Här använde vi en representativ mjuk (~8 kPa) hydrogel för att kapsla in glioblastomsfäroider. Slutligen utvecklades en metod för att färga och avbilda sfäroider för att få bilder av hög kvalitet via konfokalmikroskopi. På grund av den täta sfäroidkärnan och den relativt glesa periferin kan det vara svårt att avbilda, men att använda en rensningslösning och konfokal optisk snittning hjälper till att lindra dessa avbildningssvårigheter. Sammanfattningsvis visar vi en metod för att tillverka enhetliga sfäroider, kapsla in dem i PEG-hydrogeler och utföra konfokalmikroskopi på de inkapslade sfäroiderna för att studera sfäroidtillväxt och olika cell-matrix-interaktioner.
Introduction
Tumörsfäroider har visat sig vara användbara in vitro-verktyg för att studera canceretiologi, patologi och läkemedelsrespons1. Traditionellt har sfäroider odlats under förhållanden som plattor med låg vidhäftning eller bioreaktorer, där cell-cell-adhesion gynnas framför cell-ythatsion2. Men det är nu erkänt att för att rekapitulera tumörmikromiljön mer exakt, bör in vitro-sfäroidmodeller fånga både cell-cell och cell-matrisinteraktioner. Detta har föranlett flera grupper att designa byggnadsställningar, såsom hydrogeler, där sfäroider kan kapslas in 3,4. Sådana hydrogelbaserade sfäroidmodeller gör det möjligt att belysa cell-cell- och cell-matrisinteraktioner på olika cellbeteenden, såsom viabilitet, proliferation, stamhet eller terapirespons3.
Här beskriver vi ett protokoll för inkapsling av glioblastomsfäroider i polyetylenglykolhydrogeler (PEG). Det finns flera litteraturrapporter om glioblastomcellers sfäroidinkapsling i hydrogeler. Till exempel bildades sfäroider genom att kapsla in U87-celler i PEG-hydrogeler dekorerade med en RGDS-adhes-ligand och tvärbundna med en enzymatiskt klyvbar peptid för att bestämma effekten av hydrogelstyvhet på cellbeteende5. U87-celler har också bildats i andra PEG-baserade eller hyaluronsyrabaserade hydrogeler för att utöka cancerstamcellspopulationen6 eller för att utforska matrismedierade mekanismer för kemoterapiresistens 7,8,9. Glioblastomsfäroider har också kapslats in i gelatinhydrogeler för att studera överhörningen mellan mikroglia och cancerceller och dess effekt på cellinvasion10. Sammantaget har sådana studier visat användbarheten av hydrogelbaserade in vitro-modeller för att förstå glioblastompatologi och utforma behandlingar.
Vidare finns det olika metoder för tillverkning av tumörsfäroider och hydrogelinkapsling11. Till exempel kan dispergerade celler sås i hydrogeler och tillåtas bilda sfäroider över tid 5,12. En nackdel med en sådan metod är polydispersiteten hos de bildade sfäroiderna, vilket kan leda till differentiella cellsvar. För att producera enhetliga sfäroider kan celler kapslas in i mikrogeler och odlas under längre perioder tills de invaderar och omformar gelen13, eller så kan celler deponeras i mallgeler med sfäriska "hål" och tillåtas aggregera14. Nackdelen med dessa metoder är deras relativa komplexitet, behovet av en droppgenerator eller andra medel för att bilda mikrogeler eller "hålen" i gelen, och den tid det tar för sfäroider att växa och mogna. Alternativt kan sfäroider förformas i mikrobrunnar 9,15,16 eller i hängande droppplattor17,18 och sedan kapslas in i en hydrogel, liknande den teknik som beskrivs här. Dessa metoder är enklare och kan göras med högre dataflöde. Intressant nog har det visat sig att metoden för sfäroidbildning kan påverka sfäroidcellers beteenden, såsom genuttryck, cellproliferation eller läkemedelsrespons19,20.
Här fokuserar vi på glioblastom eftersom det är en solid tumör vars naturliga miljö är den mjuka, nanoporösa hjärnmatrisen21, som kan efterliknas av en mjuk, nanoporös hydrogel. Glioblastom är också den dödligaste hjärncancern som det inte finnsnågot botemedel mot. Protokollet som beskrivs här kan dock användas för inkapsling av sfäroider som representerar vilken solid tumör som helst. Vi valde att använda PEG-hydrogeler som bildas genom en additionsreaktion av Michael-typ23. PEG är en syntetisk, icke-nedbrytbar och biokompatibel hydrogel som är inert och fungerar som byggnadsställningar och fysiskt cellstöd men stöder inte cellbindning23. Celladhesivitet kan tillsättas separat via uppbindning av hela proteiner eller adhesiva ligander24, och nedbrytbarhet kan tillsättas via kemiska modifieringar av PEG-polymerkedjan eller hydrolytiskt eller enzymatiskt nedbrytbara tvärbindare 25,26. Detta gör det möjligt att justera biokemiska egenskaper oberoende av mekaniska eller fysikaliska hydrogelegenskaper, vilket kan vara fördelaktigt vid studier av cell-matrix-interaktioner. Gelningskemin av Michael-typ är selektiv och sker vid fysiologiska förhållanden; Därför möjliggör det sfäroidinkapsling genom att helt enkelt blanda sfäroiderna med hydrogelprekursorlösningen.
Sammantaget har den metod som presenteras här flera anmärkningsvärda egenskaper. För det första är det effektivt, snabbt och kostnaden för de material som krävs är låg att tillverka tumörsfäroider i en multibrunnsmontering. För det andra produceras sfäroiderna i stora partier i olika storlekar med låg polydispersitet. Slutligen krävs endast kommersiellt tillgängliga material. Metodens användbarhet illustreras genom att undersöka effekten av substrategenskaper på sfäroidcellers viabilitet, cirkularitet och cellstam.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Förberedelse av lösningar
- Beredning av prekursorlösning av polydimetylsiloxan (PDMS)
- Bered den negativa PDMS-prekursorlösningen (används även för limprekursorlösningen). Skopa upp elastomeren i en vågbåt med hjälp av en spatel och väg den. Tillsätt härdaren till elastomerbasen i förhållandet 1:10. Blanda PDMS och härdare försiktigt och noggrant med spateln i plastvågsbåten.
OBS: Denna PDMS-prekursorlösning hälls i den 6-håls fyrkantiga pyramidala mikrobrunnsplattan för att bilda den negativa formen. Detta är samma lösning som används för limprekursorlösningen. - Bered den positiva PDMS-prekursorlösningen. Skopa upp elastomerbasen i vågbåten med hjälp av en spatel och väg den. Tillsätt härdaren till elastomerbasen i förhållandet 1:9. Blanda PDMS och härdare försiktigt och noggrant med spateln i plastvågsbåten.
OBS: Denna PDMS-prekursorlösning hälls senare på den negativa formen för att bilda den positiva formen.
- Bered den negativa PDMS-prekursorlösningen (används även för limprekursorlösningen). Skopa upp elastomeren i en vågbåt med hjälp av en spatel och väg den. Tillsätt härdaren till elastomerbasen i förhållandet 1:10. Blanda PDMS och härdare försiktigt och noggrant med spateln i plastvågsbåten.
- Beredning av 0,3 M trietanolamin (TEA) buffert med pH 8
- Pipettera 1 ml TEA och 9 ml 1x fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) till en 50 ml konisk lösning med ett pipetthjälpmedel för att skapa en 0,75 M TEA-lösning. Titrera lösningen till ett pH på 8 med 1 N HCl eller 1 N NaOH. Tillsätt sedan tillräckligt med 1x PBS för att uppnå en slutlig volym på 25 ml för att uppnå en slutlig TEA-koncentration på 0,3 M med ett pH på 8.
VARNING: Förvara HCl- och NaOH-lösningar i ett brandfarligt skåp vid rumstemperatur (RT). Använd personlig skyddsutrustning vid hantering.
- Pipettera 1 ml TEA och 9 ml 1x fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) till en 50 ml konisk lösning med ett pipetthjälpmedel för att skapa en 0,75 M TEA-lösning. Titrera lösningen till ett pH på 8 med 1 N HCl eller 1 N NaOH. Tillsätt sedan tillräckligt med 1x PBS för att uppnå en slutlig volym på 25 ml för att uppnå en slutlig TEA-koncentration på 0,3 M med ett pH på 8.
- Beredning av kompletta medier
- För att bereda det kompletta mediet, tillsätt 10 % (vikt/volym) eller 56 ml fetalt bovint serum och 1 % (vikt/volym) eller 5,6 ml penicillin och streptomycin till 500 ml RPMI-medium.
- Placera lösningen vid 37 °C i 10-20 minuter eller tills lösningen är varm före användning.
- Förvara lösningen vid 0-4 °C i upp till 6 månader.
- Beredning av stamlösningar av 20 % (vikt/volym) polyetylenglykol (PEG)
OBS: Beräkningen är baserad på 100 μL-lösningar som kan skalas upp eller ner efter behov.- För att bereda en 100 μL stamlösning av 20 % w/v 4-armad PEG-akrylat (4-armad PEG-Ac), väg 20 mg 4-armat PEG-Ac-pulver i ett mikrofugerör. Tillsätt 70 μl 0,3 M TEA-buffert och virvla sedan lösningen i cirka 30 s eller tills den är helt upplöst. Ta hänsyn till volymförändring på grund av pulverupplösning genom att tillsätta tillräckligt med TEA-buffert (~27 μL) för att nå en slutlig lösningsvolym på 100 μL.
- För att bereda en 100 μL stamlösning av 20 % w/v PEG-diSH, väg 20 mg PEG-diSH-pulver i ett mikrofugerör. Tillsätt 70 μl TEA-buffert och virvla sedan lösningen i cirka 30 s eller tills den är helt upplöst. Ta hänsyn till volymförändring på grund av pulverupplösning genom att tillsätta tillräckligt med TEA-buffert (~27 μL) för att nå en slutlig lösningsvolym på 100 μL.
OBS: PEG-pulvret är mycket hygroskopiskt och behöver förvaras i en uttorkad behållare vid -20 °C. När du tar ut det ur frysen, låt PEG-pulvret tina i 10 minuter innan du öppnar flaskan för att väga pulvret. Rensa flaskan med en inert gas som kväve eller argon för att tränga undan den fuktiga luften innan du sätter tillbaka den i frysen. Stamlösningen av 4-armad PEG-Ac kan förvaras vid 4 °C i upp till 2 veckor före användning. Stamlösningen av PEG-diSH måste beredas omedelbart före användning och kan inte lagras eftersom tiolgrupperna reagerar med varandra för att bilda disulfidbindningar.
- Beredning av 2% v/v basalmembranmatrislösning
- För att bereda en 2 % v/v arbetslösning för basalmembranmatrisen, tillsätt 20 μL av basalmembranmatrisen (LDEV-fri) till 9.98 ml komplett media och blanda noggrant genom att pipettera upp och ner ~10 gånger. Bered lösningen vid 4 °C (på is), värm den sedan till 37 °C (i ugn eller inkubator) och använd omedelbart.
OBS: Basalmembranmatrisen kommer att börja bilda en gel vid >10 °C, så se till att blanda basalmembranmatrislösningen med komplett media vid 2-6 °C. Den fullständiga mediesammansättningen beskrivs i steg 1.3.
- För att bereda en 2 % v/v arbetslösning för basalmembranmatrisen, tillsätt 20 μL av basalmembranmatrisen (LDEV-fri) till 9.98 ml komplett media och blanda noggrant genom att pipettera upp och ner ~10 gånger. Bered lösningen vid 4 °C (på is), värm den sedan till 37 °C (i ugn eller inkubator) och använd omedelbart.
- Beredning av cellfixeringslösningen
- För att bereda 1 ml cellfixeringslösning innehållande 4 % vikt/volym paraformaldehyd och 0,1 % volymprocent nonjoniskt ytaktivt ämne, blanda först 891 μL 1x PBS och 108 μL paraformaldehyd (37 % vikt/volymkoncentration) och tillsätt sedan 1 μL nonjoniskt ytaktivt ämne (100 % koncentration). Blanda lösningen ordentligt.
OBS: Fixativ lösning ska göras ny varje gång fixering utförs.
VARNING: Paraformaldehyd är brandfarligt och kan bilda brännbara dammkoncentrationer i luften. Det orsakar hudirritation och allvarliga ögonskador. Undvik att andas in eftersom det kan orsaka irritation i luftvägarna. Hantera paraformaldehyd i ett kemiskt dragskåp och använd personlig skyddsutrustning. Tvätta händerna noggrant efter hantering. Det nonjoniska ytaktiva ämnet orsakar hudirritation och allvarliga ögonskador. Använd skyddshandskar och ögonskydd eller ansiktsskydd vid hantering. För att undvika utsläpp i miljön, öppna flaskan i ett kemiskt dragskåp. Tvätta händerna noggrant efter hantering.
- För att bereda 1 ml cellfixeringslösning innehållande 4 % vikt/volym paraformaldehyd och 0,1 % volymprocent nonjoniskt ytaktivt ämne, blanda först 891 μL 1x PBS och 108 μL paraformaldehyd (37 % vikt/volymkoncentration) och tillsätt sedan 1 μL nonjoniskt ytaktivt ämne (100 % koncentration). Blanda lösningen ordentligt.
- Beredning av färgningslösningarna
- För att bereda 3 mM 3,3'-dihexyloxakarbocyaninjodid (DiOC), blanda 2,65 mg DiOC i 1 ml DMSO.
- För att bereda 1.5 mM propidiumjodidlösning (PI), blanda 1 mg PI i 1 ml avjoniserat vatten.
- Beredning av sfäroidrensningslösningen
- Förbered clearinglösningar av 20 %, 40 % och 80 % v/v formamid i 1x PBS för sfäroidrensning.
- För att göra 10 ml 20 % v/v formamid, blanda 8 ml 1x PBS följt av 2 ml formamid. För att göra 10 ml 40 % v/v formamid, blanda 6 ml 1x PBS följt av 4 ml formamid. För att göra 10 ml 80 % v/v formamid, blanda 2 ml 1x PBS följt av 8 ml formamid.
- Efter att ha kombinerat formamid och 1x PBS, blanda lösningen genom virvlning i cirka 30 s.
- Förbered clearinglösningar av 20 %, 40 % och 80 % v/v formamid i 1x PBS för sfäroidrensning.
2. Tillverkning av kvadratiska pyramidformade mikrobrunnar
- Tillverka negativ PDMS-form av kvadratiska pyramidala mikrobrunnar som visas i figur 1.
- Bered 2 g (~1 ml) negativ PDMS-prekursorlösning och häll den på en brunn i en 6-håls fyrkantig pyramidform. Observera att 1 ml täcker en brunn på plattan helt. Efter att ha täckt huvudformen med PDMS, avgasa PDMS-prekursorlösningen i 30 minuter genom att placera den 6-håls fyrkantiga pyramidplattan i en vakuumexsickator. Härda sedan PDMS genom att placera plattan i en 60 °C ugn i 24 timmar.
OBS: Se till att locket tas bort för avgasning och sätts tillbaka för härdning. Avgasa lösningen i en vakuumexsickator eller genom rening med en inert gas som kväve eller argon. Om den negativa mögelprekursorlösningen fortfarande har bubblor efter 30 minuter, vilket indikerar otillräcklig avgasning, placera den i en vakuumexsickator i ytterligare 30 minuter. Använd en eller flera plattbrunnar samtidigt för att förbereda en eller flera PDMS-negativa formar. Kvadratiska pyramidformade mikrobrunnar av olika storlekar kan användas, t.ex. sidlängder på 400 och 800 μm, som visas i tabell 1. Samma mängd PDMS används oavsett de kvadratiska pyramidstorlekarna. - När PDMS härdar medan det fortfarande är varmt, ta försiktigt bort den negativa PDMS-formen från huvudformen med en spatel och skär den negativa formen i en platta med en diameter på 35 mm med hjälp av en biopsistans. Lägg i en petriskål och täck med lock och låt fortsätta härdningen RT i ytterligare 24 timmar.
OBS: För att ta bort negativa formar, använd en spatel för att komma mellan brunnsplattan och PDMS-formen och dra försiktigt den negativa formen från huvudformen. Formen skärs i 35 mm plattor för att passa en 35 mm petriskål. Formar kan tillverkas i andra storlekar för att passa plattor med olika diametrar. De 35 mm negativa formplattorna kan lagras, skyddas från damm vid RT och återanvändas i 6 månader.
- Bered 2 g (~1 ml) negativ PDMS-prekursorlösning och häll den på en brunn i en 6-håls fyrkantig pyramidform. Observera att 1 ml täcker en brunn på plattan helt. Efter att ha täckt huvudformen med PDMS, avgasa PDMS-prekursorlösningen i 30 minuter genom att placera den 6-håls fyrkantiga pyramidplattan i en vakuumexsickator. Härda sedan PDMS genom att placera plattan i en 60 °C ugn i 24 timmar.
- Bered positiv PDMS-form av fyrkantiga pyramidala mikrobrunnar.
- Placera 35 mm plattorna av den negativa PDMS-formen i en 35 mm petriskål med de texturerade mikrobrunnarna uppåt.
- Bered 2,5 g (~1,2 ml) positiv PDMS-prekursorlösning enligt ovan och häll den på den negativa formen i 35 mm petriskålen för att helt täcka den negativa formen. Avgasa sedan prekursorlösningen i 30 minuter enligt ovan och placera den i 60 °C ugn i 3-4 timmar.
OBS: Eftersom PDMS är trögflytande kan en bubbla bildas från luft som är instängd under den negativa formen. Om en bubbla bildas under den negativa formen, tryck försiktigt ner formen med en spatel för att frigöra bubblan. Om luftbubblor finns kvar, fortsätt avgasningen i 30 minuter, eller ta en spatel och rör försiktigt om den positiva formlösningen tills bubblorna spricker. - När den positiva PDMS-formen härdar, ta bort formarna från 35 mm petriskålen och skala omedelbart den positiva formen från den negativa formen.
OBS: Timing är viktigt för framgångsrik skalning av den positiva formen. Borttagning görs bäst genom att skära lätt i den positiva formen med en rakhyvel för att exponera gränssnittet mellan den positiva och negativa formen och skala formarna från varandra. Dra sedan bort kanterna på den runda formen. Dra försiktigt av den negativa formen från den positiva formen.
- Limma fast formarna på botten av brunnarna på en platta med 48 brunnar.
OBS: Här används en 48-hålsplatta, men andra plattor kan användas så länge formplattorna skärs i rätt diametrar (till exempel 6 mm i diameter för en 96-hålsplatta).- Skär de positiva formarna i plattor med en 10 mm biopsistans.
OBS: Cirka 4 formar (vardera 10 mm i diameter) kan skäras från en positiv form med en diameter på 35 mm. - För att limma formarna på botten av en 48-hålsplatta, förbered PDMS-limprekursorlösningen (~0.5 ml eller 1 g) som tidigare beskrivits27. Använd en pincett för att försiktigt doppa den platta sidan (inte sidan med mönstret av mikrobrunnar) av den 10 mm positiva formen i PDMS-prekursorlösningen. Placera försiktigt en form per brunn på en 48-hålsplatta och tryck försiktigt varje form till brunnens botten med pincetten. Placera den monterade plattan i en 60 °C ugn i 4-24 timmar så att PDMS-limmet härdar.
OBS: Om PDMS-limprekursorlösning kommer på de positiva formmikrobrunnarna kan den torkas av med mjukt silkespapper och steget kan upprepas. När du limmar, se till att limmet inte täcker mikrobrunnarna. - Sterilisera formar genom att tillsätta 300 μL 70 % etanol i varje brunn på plattan med 48 hål med en 1000 μL pipett. Aspirera 70 % etanol och placera plattan med 48 brunnar utan lock i en vävnadsodlingshuv under UV (302 nm) i 2 timmar.
OBS: Formar kan användas i 6 månader och omsteriliseras vid behov.
- Skär de positiva formarna i plattor med en 10 mm biopsistans.
3. Multicellulär tumörsfäroidbildning, skörd och inkapsling i hydrogeler
OBS: Protokollet som beskrivs i detta avsnitt är för U87 human glioblastomcellinje (se figur 1 och figur 2), men ett liknande protokoll kan användas med andra cancercelltyper.
- Bildning av flercelliga tumörsfäroider
- Tvätta mikrobrunnsformarna först med en anti-vidhäftande sköljlösning genom att tillsätta 300 μL av lösningen till varje brunn med en 1000 μL pipett. Centrifugera sedan vid 1620 x g i 3 minuter och aspirera lösningen med en vakuumpump och en Pasteurpipett.
OBS: Utför detta steg omedelbart före cellsådd. - Utsätt cellerna för ~80 μL 0,25 % trypsin/EDTA per cm2 av odlingskolvens yta i 5 minuter vid 37 °C. Till exempel är 1 ml trypsin/EDTA lämpligt för en T-25-cellodlingskolv. Neutralisera trypsinet genom att tillsätta samma volym av det kompletta cellodlingsmediet. Tillsätt till exempel 1 ml helmedium till den trypsininnehållande T-25-cellodlingskolven. Samla upp cellerna från vävnadsodlingskolven.
- Överför 10 μl av cellsuspensionen till varje port på en hemocytometer för cellräkning. Använd ett inverterat mikroskop för att räkna det totala antalet celler och medelvärdet av det cellantalet från minst 8 kvadranter, och se till att cellantalet i varje hemocytometerkvadrant är 20-50 för bra cellräkningsresultat. Multiplicera det beräknade talet med 104 för att bestämma den slutliga cellkoncentrationen.
- Återsuspendera de uppsamlade cellerna i det kompletta RPMI-cellodlingsmediet kompletterat med 10 % fetalt bovint serum och 1 % penicillin/streptomycin vid en önskad slutlig cellkoncentration, beroende på önskad sfäroidstorlek, som visas i tabell 1.
OBS: Mikrobrunnarna på 800 μm ger ~75 sfäroider i en brunn på en platta med 48 brunnar, och mikrobrunnarna på 400 μm ger ~300 sfäroider i en brunn på en platta med 48 brunnar. - Placera 500 μl cellsuspension i önskad koncentration i mikrobrunnar och centrifugera plattan vid 1620 x g i 3 minuter. Placera plattan i en fuktad inkubator vid 37 °C och 5 % CO2 i 24 timmar så att sfäroider bildas.
OBS: Om sfäroider inte bildas kan 2 % v/v av basalmembranmatrisen i kombination med komplett media användas för att återsuspendera celler (mer information i steg 1.5).
- Tvätta mikrobrunnsformarna först med en anti-vidhäftande sköljlösning genom att tillsätta 300 μL av lösningen till varje brunn med en 1000 μL pipett. Centrifugera sedan vid 1620 x g i 3 minuter och aspirera lösningen med en vakuumpump och en Pasteurpipett.
- Skörd av sfäroider
- Använd en 1000 μL pipett och pipettera fast 500 μL komplett medium i brunnen. Använd 500 μl medium från brunnen och spola de fyra kvadranterna i brunnen (särskilt de övre, nedre, vänstra och högra kvadranterna) genom att pipettera upp och ner vid kvadranterna tre till fyra gånger för att lossa sfäroiderna. Aspirera försiktigt mediet som innehåller sfäroiderna (~1000 μL totalt) i ett mikrocentrifugrör med en 1000 μL pipett och låt sfäroiderna sjunka till botten.
- Ta bort supernatanten och återsuspendera sfäroiderna till önskad slutlig koncentration. Till exempel, för att uppnå ~8 sfäroider i en 20 μL gel efter inkapsling, återsuspendera sfäroiderna i 100 μL media, vilket ger en sfäroidkoncentration på ~75 sfäroider/100 μL i sfäroidsuspensionen.
- Inkapsling av sfäroider i hydrogeler, som visas i figur 2.
- För att skapa 100 μL av en 10 % w/v PEG-hydrogelprekursorlösning, kombinera 50 μL av sfäroidsuspensionen, följt av 30 μL 20 % w/v 4-arm PEG-Ac och slutligen 20 μL 20 % w/v PEG-diSH i ett mikrocentrifugrör. Detta kommer att ge ett stochiometriskt molärt förhållande mellan akrylat- (Ac) och tiolgrupper (SH), vilket säkerställer optimal tvärbindning. Blanda gelprekursorlösningen genom att pipettera upp och ner ~10 gånger.
OBS: Hydrogelsammansättning, volym och polymersamordning kan ändras efter behov. De resulterande hydrogelerna kommer att brytas ned långsamt och inte vara cellvidhäftande. För att göra hydrogelcellen vidhäftande kan en adhesiv ligand som RGDS tillsättas. För att göra hydrogelen enzymatiskt nedbrytbar kan en enzymatiskt nedbrytbar peptidtvärbindare innehållande cysteinrester i båda ändar tillsättas. Vid överföring av sfäroider, pipettera försiktigt lösningen två gånger för att få bort sfäroider och få dem i suspension för att säkerställa jämn fördelning av sfäroider. - Pipettera 20 μl av gelprekursorlösningen mellan två parafilmfodrade glasskivor separerade med 1 mm silikondistanser och placera objektglasen med gelprekursorlösning i 37 °C, 5 % CO 2-inkubator i 15 minuter för att möjliggöra gelning.
OBS: Se till att de två glasskivorna är täckta med parafilm för att skapa en hydrofob yta som möjliggör enkel skalning vid gelning. Istället för parafilm kan en hydrofob beläggningslösning användas. En volym på 20 μL hydrogelprekursorlösning ger en hydrogelplatta med en diameter på ~6 mm och en höjd på 1 mm före svällning. Vilken typ av distans och tjocklek som helst kan användas, men det rekommenderas att geltjockleken hålls på eller under 1 mm (tjockare hydrogeler kan begränsa syrediffusion och transport av näringsämnen till cellerna) men större än sfäroiddiametern (så att sfäroider är helt inkapslade i gelen). Vilken volym hydrogelprekursorlösning som helst kan användas. Gelerna på 20-30 μL är lämpliga för en platta med 24 brunnar. - När hydrogelgelningen är klar, separera de två glasglasen och dra försiktigt av gelerna från glasplattan med hjälp av en spatel. Placera gelerna i en platta med 24 brunnar, en per brunn, och se till att ytan som innehåller sfäroiderna är vänd uppåt.
OBS: Sfäroider kommer att falla till botten av gelen under gelning, så om du vänder dem för odling säkerställer du att sfäroiderna är nära hydrogelens yta för bättre tillgång till näringsämnen och syre. Gelning kan övervakas genom att observera eventuell hydrogelprekursorlösning som finns kvar i mikrocentrifugröret och inte används för att skapa plattor genom att vända röret och notera den tid då gelen slutar flöda. - Tillsätt komplett medium (~500 μL) till varje brunn och se till att hydrogelen är helt nedsänkt. Placera multibrunnsplattan i en fuktad inkubator vid 37 °C och 5 % CO2 och odla cellerna med medelstora förändringar var 2-3:e dag.
OBS: Hydrogeler kan odlas i upp till 4 veckor eller tills hydrogelerna bryts ned, byt media varannan dag.
- För att skapa 100 μL av en 10 % w/v PEG-hydrogelprekursorlösning, kombinera 50 μL av sfäroidsuspensionen, följt av 30 μL 20 % w/v 4-arm PEG-Ac och slutligen 20 μL 20 % w/v PEG-diSH i ett mikrocentrifugrör. Detta kommer att ge ett stochiometriskt molärt förhållande mellan akrylat- (Ac) och tiolgrupper (SH), vilket säkerställer optimal tvärbindning. Blanda gelprekursorlösningen genom att pipettera upp och ner ~10 gånger.
4. Fluorescerande färgning
- Cellviabilitet
- Använd färg-3,3'-dihexyloxakarbocyaninjodid (DiOC), som färgar mitokondrierna och det endoplasmatiska nätverket i alla celler, för att bestämma cellviabiliteten. Använd DiOC (3 mM) i en koncentration av 0,02 μg/ml. Använd en 20 μL pipett för att tillsätta 2 μL DiOC per 1000 μL medium i kolven som odlar de dissocierade cellerna (minst 24 timmar före bildningsprocessen av sfäroider i avsnitt 3). Låt DiOC färga cellerna i 24 timmar.
- Använd kärn- och kromosomfärgen, propidiumjodid, PI (1,50 mM), som endast kommer in i döda celler. För att färga cellerna, aspirera först alla medier och skölj gelen genom att använda en 1000 μL pipett för att tillsätta 500 μL 1x PBS så att gelen är helt nedsänkt.
- Aspirera PBS och tillsätt 500 μl färska medier, följt av 30 μl PI-lösning till varje brunn (dvs. 6 μL per 100 μL media). Täck brunnsplattan med aluminiumfolie för att skydda den från ljus. Placera brunnsplattan i en inkubator vid 37 °C och 5 % CO2 och låt PI färga de döda cellerna i 30 minuter.
- Ta bort folien och aspirera mediet från brunnarna. Använd en 1000 μL pipett för att tillsätta 500 μL 1x PBS för att sänka hydrogelen. Aspirera 1x PBS och upprepa sköljningen ytterligare två gånger. Tillsätt 500 μl media till varje brunn och bild under ett fluorescerande inverterat eller konfokalmikroskop.
- Beräkna cellviabiliteten genom att jämföra arean av DiOC (alla celler) med PI (döda celler), som representeras i ekvation 1, med hjälp av z-stackbilder från ett konfokalmikroskop eller ett inverterat fluorescerande mikroskop.
Ekv. 1.
Ekv. 1.5. Immunofluorescensfixering, färgning, rensning och avbildning av inkapslade sfäroider
- Fixering och färgning
- Aspirera mediet från brunnarna där hydrogelerna odlas och skölj hydrogelerna genom att pipettera 500 μL 1x PBS direkt på hydrogelerna. Aspirera försiktigt 1x PBS.
- Fixera sfäroiderna i 24-hålsplattan genom att använda en 1000 μL pipett för att tillsätta 500 μL volym fixativ lösning per brunn. Låt fixeringsmedlet blötlägga gelerna i 30 minuter vid RT. Ta bort fixeringslösningen med en 1000 μL pipett och släng i en avsedd avfallsbehållare.
- Skölj hydrogelerna genom att tillsätta 500 μL 1x PBS till varje brunn. Aspirera 1x PBS med en 1000 μL pipett och upprepa PBS-sköljningen ytterligare två gånger. Förvara brunnsplattan i 500 μL 1x PBS per brunn vid 4 °C i upp till 1 vecka eller använd omedelbart.
OBS: Var försiktig så att du inte drar in hydrogelerna i pipetten när du aspirerar PBS och fixativ lösning. Gör det genom att tippa plattan till en ~45-graders vinkel, vilket hjälper till att se hydrogelerna och förhindra oavsiktlig aspiration.
VARNING: Formaldehyd är giftigt vid inandning och kontakt. Hanteras med handskar i ett kemiskt dragskåp. - För att färga cellerna, inkubera de hydrogelinkapslade sfäroiderna med primära antikroppar mot Nestin (200 μg/ml) och SOX2 (200 μg/ml) vid en utspädning av 1:200 av antikroppen: PBS. Använd en 1000 μL pipett för att aspirera 1x PBS från brunnarna. Tillsätt 50 μl av den utspädda antikroppen till varje brunn. Låt färgningen vara klar i 24 timmar. Ta sedan bort färglösningen med en 1000 μL pipett och kassera avfallet på lämpligt sätt.
- Använd en 1000 μL pipett för att tillsätta 500 μL 1xPBS, vilket räcker för att sänka hydrogelen. Aspirera PBS och upprepa det två gånger till. Förvara den färgade och nedsänkta hydrogelen i 1x PBS vid 4 °C i upp till 2 veckor före avbildning eller bild omedelbart.
OBS: Mindre optimeringar kan behövas beroende på antikroppen för att säkerställa korrekt färgning. Koncentrationen (1:200) och tiden (24 timmar) är betydligt högre än i typisk 2D-monolagercellodling eftersom 3D-färgning kräver diffusion genom hydrogelen och sfäroiderna.
- Efter färgning av sfäroiderna, rensa sfäroiden för att förbättra transparensen för avbildning genom att ersätta PBS med en sekventiell koncentrationsökning av formamid (valfritt).
- Aspirera 1x PBS från varje brunn. Tillsätt 500 μl 20 % (v/v) formamid till varje brunn och låt hydrogelen inkubera i 90 minuter. Aspirera formamiden med en 1000 μL pipett och samla upp avfallet i en avfallsbehållare.
- Tillsätt 500 μl 40 % (v/v) formamid i brunnen. Låt hydrogelen inkubera i lösningen i 90 minuter. Aspirera formamiden och samla upp avfallet i avfallsbehållaren.
- Tillsätt 500 μl 80 % v/v formamid till varje brunn och inkubera i 90 minuter. Aspirera formamiden och släng den i avfallsbehållaren. Tillsätt 500 μl 100 % (volym/volym) formamid och låt inkubationen inkuberas i 24 timmar före avbildningen. När rensningen är klar, kassera formamidavfall på rätt sätt genom lämpliga tjänster från ett laboratorieavfallshanteringssystem.
OBS: Clearing möjliggör konfokal avbildning i sfäroidens kärna och är valfritt om endast sfäroidens periferi undersöks.
- Avbildning av hydrogelinkapslade sfäroider med hjälp av konfokalmikroskopi.
OBS: Alla mikroskop - inverterade, fluorescerande eller konfokala - kan användas för cellavbildning; Konfokal möjliggör dock isolering av enskilda plan.- Placera hydrogelerna i kammare med täckglasbottnar och placera sfäroiderna så nära täckglaset som möjligt.
OBS: Täckglas eller brunnar med kammare med täckglasbottnar kan användas. Det är viktigt att hålla hydrogeler hydrerade eftersom uttorkade prover kommer att resultera i dålig bildkvalitet. - Avbilda proverna med ett mål för långt arbetsavstånd (10x-20x) för att möjliggöra avbildning djupt in i sfäroiden med hjälp av Z-stackar för 3D-rekonstruktioner.
OBS: Högre förstoringsobjektiv tillåter mer detaljerad bildbehandling och optisk sektionering men offrar bilddjupet. - Kvantifiera mängden signal som finns i den optiska sektionen i förhållande till sfäroidens totala area för både den rensade och den oclearade signalen med hjälp av ekvation 2.
Ekv. 2
- Placera hydrogelerna i kammare med täckglasbottnar och placera sfäroiderna så nära täckglaset som möjligt.
Ekv. 2Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sfäroidbaserade läkemedelsscreeningplattformar för att studera kemoterapeutiska effekter blir alltmer eftertraktade på grund av betoningen på att modulera tumörmikromiljön vid sfäroidinkapsling i biomaterial som replikerar naturlig vävnad. Här utvecklade vi en metod för multicellulär tumörsfäroidpreparering och efterföljande inkapsling och avbildning i en 3D-hydrogel. Sfäroiderna bereds i mikrobrunnsformar (figur 3A,B), vilket resulterar i sfäroider med sfäriska former och noggrant kontrollerad polydispersitet. Till exempel, för sfäroider med 3 300 celler per mikrobrunn, var den genomsnittliga sfäroidstorleken ~250 μm, och cirkulariteten var >0,8, där 1 är en perfekt sfär (Figur 3C,D). Den procentuella varianskoefficienten (%CV) för sfäroiddiameter var 19,3 % och %CV för cirkularitet var 4,5 %. Sfäroiddiametrarna var beroende av antalet celler per mikrobrunn, vilket visas i tabell 1. Observera att vissa celler i mikrobrunnarna kanske inte är inkorporerade i sfäroiden och kommer att tvättas bort under sfäroidskörden.
Sfäroiden kan avbildas på olika djup i Z-stacken, vilket gör det möjligt att använda cellviabiliteten för varje plats i Z-stacken (figur 4). Observera att på grund av konfokala avbildningsbegränsningar och den höga celltätheten kunde sfäroidkärnan inte avbildas fullständigt. Som diskuteras senare kan sfäroidrensning eller snittning behövas för förbättrad avbildning i hela sfäroiden. Genom denna metod bestämdes sfäroidernas viabilitet till hög (~90 %) omedelbart efter skörd och inkapsling, även om cellviabiliteten sjönk något till 85 % i sfäroidkärnan jämfört med periferin. För att säkerställa viabilitet genom hela sfäroiden dissocierades sfäroider med hjälp av akutas, och viabiliteten hos de dissocierade cellerna beräknades med samma metod och befanns vara lika hög (>90%). En maximal projektion som använder sfäroidstapeln representerar den högsta punkten för ljusintensitet inom varje plats i Z-stapeln komprimerad till en bild (figur 4B).
Representativa bilder av fritt flytande sfäroider (ingen gel) och inkapslade sfäroider (PEG-gel) färgade för stjälkmarkörer Nestin och SOX2 visas i figur 5. Nestin är ett mellanliggande filament och en stamcellsmarkör som finns i gliom. SOX2 är en transkriptionsfaktor för självförnyelse, som även finns i gliom. SOX2 visade sig vara samlokaliserad med DAPI i cellkärnan, medan Nestin fanns i hela cellen. Data visar ingen skillnad mellan gel- och ingen gel-betingelser, möjligen på grund av att PEG-gelen som används här är inert och inte underlättar cell-matrix-interaktioner genom integrinsignalering.
En stor begränsning av avbildning är den höga sfäroiddensiteten, vilket gör det svårt att avbilda i sfäroidkärnan. Vanliga metoder för att avbilda sfäroidkärnan inkluderar sektionering och rensning av sektionerna. Detta kan fungera bra med fritt flytande sfäroider, men att snitta hydrogeler är svårt, och de flesta vävnadsrensningar innebär uttorkning av prover, vilket resulterar i deformerade prover. Här anpassade vi ett protokoll från Kuwajima et al.28 för hydrogelprover för att bibehålla sfäroidstrukturen samtidigt som sfäroiderna rensas. För att demonstrera nyttan av rensningsmetoden fixerades sfäroider, färgades med PI och rensades (figur 6). Figur 6A visar representativa bilder av optiska snitt vid ~90 μm i rensade och oclearade sfäroider och sfäroidens totala area när sfäroidområdet är fyllt. När rensningen utfördes kunde sfäroidkärnan avbildas ~30 μm djupare, jämfört med en orensad sfäroid (Figur 6B). Clearing kan vara mycket fördelaktigt för immunofluorescens, eftersom den rumsliga organisationen av biomarkörer kan analyseras i kärnan av sfäroider. Denna metod kan endast användas för fasta prover eftersom membranintegriteten störs.
Figur 1: PDMS-formtillverkning och sfäroidbildning. PDMS-prekursorlösningar tillsätts till fyrkantiga pyramidala mikrobrunnsplattor för att bilda PDMS-formar. Den dissocierade cellsuspensionen tillsätts till de bildade PMDS-formarna och spinns ner för att möjliggöra sfäroidbildning efter 24 timmar. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Inkapsling, odling och avbildning av hydrogel. (A) 4-armad PEG-Ac, PEG diSH och sfäroidsuspensionen kombineras i ett mikrocentrifugrör och (B) blandas väl genom pipettering upp och ner för att bilda en gelprekursorlösning. C) 20 μl av gelprekursorlösningen pipetteras på ett objektglas och ett andra glasglas placeras ovanpå lösningen och separeras med 1 mm distanser. (D) Hydrogel överförs till 24 brunnsplattor med sfäroider uppåt och täcks med media (500 μL). (E) Hydrogel överförs till ett täckglas för mikroskopiavbildning. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Sfäroidbildning i mikrobrunnar före skörd, 24 timmar efter den första cellsådden i mikrobrunnarna. A) Sfäroider i mikrobrunnar färgade med DiOC (grön). Skalstapeln är 200 μm. (B) Ljusfältsbild av sfäroider i mikrobrunnar. C) Histogram över sfäroiddiameter i mikrobrunnar. (D) Histogram för sfäroid cirkularitet i mikrobrunnar. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Representativ Z-stack konfokalbild av levande sfäroid för analys av levande döda. (A) Bilder från 4 skivor av Z-stack med DiOC (grön) och PI (röd). Skalstapeln är 200 μm. (B) Max projektion av Z-stacken. (C) Cellviabilitet som en funktion av sfäroiddjupet. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Nestin och SOX2 immunfärgning av fritt flytande (ingen gel) och hydrogelinkapslad (PEG-gel) U87-cellssfäroider på dag 5 av odlingen. Representativa konfokalbilder av sfäroiderna bekräftar Nestin (rött) och SOX2 (grönt) uttryck, som motfärgades med DAPI (blå; kärna). Skalstapeln är 100 μm. Bilder som beskurits och zoomats från den vita fyrkanten visar förhållandet mellan kärnan (blå) och SOX2 (grön). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Bilddjup för rensade sfäroider. (A) Representativa bilder av sfäroider avbildade vid 91,6 μm i sfäroidområdet och det totala sfäroidområdet. (B) Procentandel av sfäroidområdet som avbildas när djupet i sfäroiden ökar. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Storlek på mikrobrunn (μm) | Antal celler per sfäroid | Antal celler per brunn | Cellkoncentration (celler/ml) | Sfäroiddiameter (μm) |
| 400 | 200 | 120000 | 240000 | 115,4 ± 13,5 |
| 500 | 300000 | 600000 | 144,6 ± 14,3 | |
| 1000 | 600000 | 1200000 | 176,5 ± 12,5 | |
| 800 | 2000 | 300000 | 600000 | 212,4 ± 15,7 |
| 3000 | 450000 | 900000 | 258,9 ± 16,3 | |
| 4000 | 600000 | 1200000 | 305,7 ± 21,6 | |
| 5000 | 750000 | 1500000 | 323,4 ± 29,8 |
Tabell 1: Speroiddiameter och mikrobrunnsstorlek. Det beräknade antalet celler per sfäroid, antalet celler per brunn på en 48-brunnsplatta, cellkoncentration och resulterande sfäroiddiameter beroende på mikrobrunnsstorleken hos den negativa PDMS-formen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hydrogelbaserade multicellulära tumörsfäroidmodeller utvecklas i allt högre grad för att främja cancerterapeutiska upptäckter 11,13,29. De är fördelaktiga eftersom de emulerar viktiga parametrar i tumörmikromiljön på ett kontrollerat sätt och, trots sin komplexitet, är enklare och billigare att använda än in vivo-modeller, och många är kompatibla med screeningteknik med hög genomströmning. Hydrogelbiomaterialen kan justeras för att efterlikna tumörens extracellulära matris och underlätta cell-matrisinteraktioner, och sfäroiden (i motsats till dissocierade celler) emulerar cell-cellinteraktionerna hos den ursprungliga tumören. Syntetiska hydrogeler, som demonstreras här, är särskilt fördelaktiga eftersom hydrogelen ger önskat strukturellt stöd och fysiska och mekaniska egenskaper, medan adhesiva ligander eller nedbrytbara sekvenser kan användas för att oberoende justera biokemiska materialegenskaper. Syntetiska hydrogeler erbjuder också lägre variabilitet från sats till sats och större utbud av materialegenskaper, som omfattar de flesta mjukvävnader i kroppen.
Här beskriver vi i detalj användningen av en inert PEG-baserad hydrogel som bildas via tillsats av Michael-typ som beskrivits tidigare25,30. Den representativa PEG-hydrogelen som används här har Youngs modul på ~8 kPa, liknande glioblastomvävnadens styvhet9. PEG-hydrogelen är bekväm eftersom den har avstämbara egenskaper och mycket specifik gelningskemi och kan bildas i närvaro av sfäroider utan att kompromissa med cellviabiliteten (figur 4). Medan PEG-hydrogelen är inert och fungerar som cellbyggnadsställningar med definierade fysikaliska och mekaniska egenskaper, kan celladhesiva ligander tillsättas för att vägleda cell-matrisinteraktioner, och enzymatiskt nedbrytbara peptidtvärbindare kan läggas till för att underlätta matrisombyggnad9. Adhesiva ligander och peptidtvärbindare kan väljas för att efterlikna den cellulära mikromiljön för att lägga till fysiologisk eller patologisk relevans till modellen. För mer information om PEG-hydrogelmodifieringar för att ställa in hydrogelens nedbrytbarhet, mekaniska egenskaper och vidhäftningsförmåga, hänvisas läsarna till följande publicerade arbete 9,27.
Med hjälp av den metod som beskrivs här kan stora mängder cancersfäroider bildas snabbt och kapslas in i PEG-hydrogelen för att utforska effekten av substrategenskaper på sfäroidcellers viabilitet, morfologi eller cellstamsförmåga (Figur 4 och Figur 5), bland andra egenskaper. Cellerna får först aggregera och bilda en sfäroid och kapslas sedan in i hydrogelerna, som visas i figur 2 och figur 3. Aggregeringsprocessen gör det möjligt att variera sfäroidstorlekarna baserat på storleken på mikrobrunnsformarna och koncentrationen av cellsuspensionen som pipetteras in i mikrobrunnsformarna (tabell 1). De resulterande sfäroiderna är relativt monodispersa i storlek, med en genomsnittlig varianskoefficient på ~10%-20% för alla förhållanden. Detta är fördelaktigt för en mängd olika applikationer, eftersom liknande storlekar kommer att uppvisa liknande diffusionsbegränsningar, vare sig det gäller läkemedel, näringsämnen eller syre, in i sfäroiden. Sfäroiderna har också en cirkularitet på >0,8, vilket är jämförbart med andra ultralåga fäst- eller hängande droppmetoder31. Observera att andra metoder för sfäroidbildning kan användas först, såsom hängande droppmetod eller roterande cellodlingssystem32, och sedan inkapslas i hydrogelen. Metoden som beskrivs här kräver dock ingen specialutrustning eller dyra förbrukningsvaror, vilket underlättar tillgängligheten för alla laboratorier.
Medan de metoder som visas här använder U87-MG glioblastomcellinjen, kan den sfäroidtillverknings- och inkapslingsmetod som beskrivs användas för olika cancercelltyper som bildar solida tumörer. Om cellerna inte lätt aggregerar för att bilda en sfäroid kan en blandning av ECM-proteiner, såsom en basalmembranmatris, tillsättas till cellsuspensionen för att underlätta processen (som beskrivs i metoderna). När sfäroiderna väl är inkapslade är det bäst att avbildas och analyseras direkt i hydrogelen istället för att extraheras från hydrogelen eller cellerna som dissocieras. Detta beror på att sfäroider vanligtvis är heterogena (t.ex. kan en hypoxisk kärna bildas på grund av syre- och näringsgradienter), och cellsvaren kommer att skilja sig åt beroende på positionen i sfäroiden. Cellextraktion kan också dölja den roll som cell-matrix-interaktioner spelar för sfäroidernas öde. Till exempel har vi tidigare visat att celler i sfäroidernas periferi kontra kärna har olika respons på cellgifter, vilket i sin tur är beroende av substratets mekaniska egenskaper27. Därför rekommenderar vi att man använder mikroskopitekniker för att studera sfäroidbeteenden, som lyfts fram i detta manuskript.
En fråga att tänka på när man avbildar täta vävnader som sfäroider är deras opacitet. Här beskriver vi en rensningsmetod för att förbättra bildbarheten genom sfäroidens inre (Figur 6). Men även om sfäroidrensning hjälper till att maximera bilddjupet, kan begränsningar hittas när man placerar de inkapslade sfäroiderna i formamid, vilket resulterar i potentiell strukturell skada och påverkar sfäroidernas bildbarhet. Denna process kan inte heller utföras när man observerar cellviabilitet genom levande/död färgning eftersom rensning kräver fixering. Rensningsprocessen kräver också flera timmars inkubation i formamid efter färgning, så det kan potentiellt påverka de färgämnen som används. Andra tekniker, t.ex. kryosektion och sedan immunfärgning, kan också fungera, förutsatt att snittningen inte förvränger eller äventyrar sfäroidvävnadens integritet. I våra händer resulterade kryosektionering i "klämda" sfäroider på grund av hydrogelens mjukhet, som är ~8 kPa i Youngs modul, för att efterlikna glioblastomvävnadens styvhet.
Sammantaget är de kritiska stegen i detta protokoll framgångsrik tillverkning av sfäroider, inkapsling och odling av hydrogel samt avbildning och analys av sfäroider. Därför har vi tillhandahållit anteckningar och felsökningsstrategier för dessa steg. De hydrogelinkapslade sfäroiderna som beskrivs här kan användas i en mängd olika tillämpningar, såsom läkemedelsscreeningplattformar, detaljerade studier av cell-matrix-interaktioner och deras effekt på cellbeteenden, studier av sjukdomsetiologi, etc. Sådana studier kan underlättas av avstämbarheten hos det beskrivna systemet som diskuterats ovan och de förutsägbara och kontrollerbara egenskaperna hos den syntetiska PEG-hydrogelen. Några begränsningar i det beskrivna systemet inkluderar en medelhög genomströmning, där hög genomströmning är att föredra för multiplex- eller högvolymstudier såsom läkemedelsscreening. En annan begränsning är behovet av avbildning, såsom konfokal avbildning, för dataanalys. Även om avbildning möjliggör detaljerad speciell och tidsmässig analys, är den också tidskrävande och hindras av penetrationsbegränsningar på grund av djup och sfäroidcelltäthet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete finansierades av startmedel som gavs till Dr. Silviya P Zustiak av Saint Louis University samt av ett startbidrag från Henry and Amelia Nasrallah Center for Neuroscience vid Saint Louis University som tilldelades Dr. Silviya P Zustiak.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 70% Ethanol | Fisher Scientific | LC22210-4 | |
| 15 mL Conicals | FALCON | 352097 | |
| 24-Well Plate Ultra Low Attachment plates | Fisher Scientific | 07-200-602 | |
| 35 mm Petri Dish | Amazon | 706011 | |
| 4-arm poly(ethylene glycol)-acrylate (4-arm PEG-Ac; 10 kDa) | Laysan Bio | ACRL-PEG-ACRL-10K-5g | |
| 50 mL Conicals | Fisher Scinetific | 3181345107 | |
| 6-well AggreWell 400 | StemCell Technologies, Vancouver, Canada | 34421 | Square pyramidal microwells |
| anti-adherence rinsing solution | StemCell Technologies, Vancouver, Canada | Cat #: 07010 | |
| Aspartic Acid-Arginine-Cysteine-Glycine-Valine-Proline-Methionine-Serine-Methionine-Arginine-Glycine-Cysteine-Arginine- Aspartic Acid (DRCG-VPMSMR-GCRD) peptide | Genic Bio, Shanghai, China | n/a | Custom synthesis |
| Chemical Fume Hood | KEWAUNEE | 99151 | |
| Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, LDEV Free | Corning | 356234 | Basement membrane matrix |
| Detergent - Triton-X | Sigma Aldrich | T8787 | Nonionic surfactant |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| Disposable Pipettes (1 mL, 2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL, 50 mL) | Fisher Scinetific | 1 mL: 13-678-11B, 2mL: 05214038, 5mL(FALCON): 357529, 10mL: 13-678-11E, 25mL: 13-678-11, 50mL: 13-678-11F | |
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30073-03 | |
| Formaldehyde 37% Solution | Sigma Aldrich | F1635 | |
| Glass Plates | Slumpys | GBS4100SFSL | |
| Glass Transfer Pipettes | Fisher Scinetific | 5 3/4": 1367820A, 9":136786B | |
| Glycine-Arginine-Cysteine-Aspartic Acid-Arginine-Glycine-Aspartic Acid-Serine (GRCD-RGDS) peptide | Genic Bio, Shanghai, China | n/a | Custom synthesis |
| Hemacytometer | Bright-Line | 383684 | |
| Hydrophobic solution - Repel Silane | GE Healthcare Bio-Sciences | 17-1332-01 | |
| Incubator | NUAIRE | NU-8500 | |
| Inverted Microscope (Axiovert 25) | Zeiss | 663526 | |
| Invitrogen DiOC16(3) (3,3'-Dihexadecyloxacarbocyanine Perchlorate) | Fisher Scientific | D1125 | |
| Leica Confocal SP8 | Leica Microsystems Inc. | ||
| Light and Flourescent Microscope (Axiovert 200M) | Zeiss | 3820005619 | |
| Micro centrifuge tubes | Fisher Scientific | 2 mL: 02681258 | |
| Microscope Software | Zeiss | AxioVision Rel. 4.8.2 | |
| Nestin Alexa Fluor 594 | Santa Cruz Biotechnology | sc-23927 | |
| Parafilm | PARAFILM | PM992 | |
| PBS (1x), pH 7.4 | HyClone | SH30256.01 | |
| Penicillin Streptomycin | MP Biomedicals | 1670046 | |
| Pipette Aid | Drummond Scientific Co. | P-76864 | |
| Pipette Tips (1–200 µL, 101–1000 µL) | Fisher Scinetific | 2707509 | |
| Plastic Standard Disposable Transfer Pipettes | Fisher Scientific | 13-711-9D | |
| Plastic Weigh Boats (100 mL) | Amazon | mdo-azoc-1030 | |
| poly(ethylene glycol)-dithiol (PEG-diSH; 3.4 kDa) | Laysan Bio | SH-PEG-SH-3400-5g | |
| Polydimehylsiloxane (PDMS) [Slygard 182 Elastomer Kit] | Elsworth Adhesives | 3097358-1004 | Polydimethylsiloxane |
| Powder Free Examination Gloves | Quest | 92897 | |
| Propidium iodide, 1 mg/mL aqueous soln. | Fisher Scientific | AAJ66584AB | |
| RPMI-1640 Medium (1x) | HyClone | SH30027-02 | |
| Silicone spacers - Silicone sheet, 0.5 mm thick/13 cm x 18 cm | Grace Bio-Labs | JTR-S-0.5 | |
| SOX2 Alexa Fluor 488 | Santa Cruz Biotechnology | sc-365823 | |
| Tissue Culture Hood | NUAIRE | NU-425-600 | |
| Triethanolamine, ≥99.0% (GC) | Sigma Aldrich | 90279 | |
| U-87 MG human glioblastoma cells | American Type Culture Collection | HTB-14 |
References
- Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again. Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).
- Costa, E. C., de Melo-Diogo, D., Moreira, A. F., Carvalho, M. P., Correia, I. J. Spheroids formation on non-adhesive surfaces by liquid overlay technique: Considerations and practical approaches. Biotechnology Journal. 13 (1), 1700417 (2018).
- Li, Y., Kumacheva, E. Hydrogel microenvironments for cancer spheroid growth and drug screening. Science Advances. 4 (4), eaas8998 (2018).
- Kamatar, A., Gunay, G., Acar, H. Natural and synthetic biomaterials for engineering multicellular tumor spheroids. Polymers. 12 (11), 2506 (2020).
- Wang, C., Tong, X., Yang, F. Bioengineered 3D brain tumor model to elucidate the effects of matrix stiffness on glioblastoma cell behavior using PEG-based hydrogels. Molecular Pharmaceutics. 11 (7), 2115-2125 (2014).
- Nakod, P. S., Kim, Y., Rao, S. S. Three-dimensional biomimetic hyaluronic acid hydrogels to investigate glioblastoma stem cell behaviors. Biotechnology and Bioengineering. 117 (2), 511-522 (2020).
- Xiao, W., et al. Bioengineered scaffolds for 3D culture demonstrate extracellular matrix-mediated mechanisms of chemotherapy resistance in glioblastoma. Matrix Biology. 85, 128-146 (2020).
- Pedron, S., et al. Hyaluronic acid-functionalized gelatin hydrogels reveal extracellular matrix signals temper the efficacy of erlotinib against patient-derived glioblastoma specimens. Biomaterials. 219, 119371 (2019).
- Hill, L., Bruns, J., Zustiak, S. P. Hydrogel matrix presence and composition influence drug responses of encapsulated glioblastoma spheroids. Acta Biomaterialia. 132, 437-447 (2021).
- Chen, J. -W. E., et al. Crosstalk between microglia and patient-derived glioblastoma cells inhibit invasion in a three-dimensional gelatin hydrogel model. Journal of Neuroinflammation. 17 (1), 346 (2020).
- Thakuri, P. S., Liu, C., Luker, G. D., Tavana, H. Biomaterials-based approaches to tumor spheroid and organoid modeling. Advanced Healthcare Materials. 7 (6), 1700980 (2018).
- Shin, S., et al. Alginate-marine collagen-agarose composite hydrogels as matrices for biomimetic 3D cell spheroid formation. RSC Advances. 6 (52), 46952-46965 (2016).
- Pradhan, S., Clary, J. M., Seliktar, D., Lipke, E. A. A three-dimensional spheroidal cancer model based on PEG-fibrinogen hydrogel microspheres. Biomaterials. 115, 141-154 (2017).
- Imaninezhad, M., Hill, L., Kolar, G., Vogt, K., Zustiak, S. P. Templated macroporous polyethylene glycol hydrogels for spheroid and aggregate cell culture. Bioconjugate Chemistry. 30 (1), 34-46 (2018).
- Mirab, F., Kang, Y. J., Majd, S. Preparation and characterization of size-controlled glioma spheroids using agarose hydrogel microwells. PLoS One. 14 (1), e0211078 (2019).
- Razian, G., Yu, Y., Ungrin, M. Production of large numbers of size-controlled tumor spheroids using microwell plates. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 81, e50665 (2013).
- Timmins, N. E., Nielsen, L. K. Generation of Multicellular Tumor Spheroids by the Hanging-Drop Method. Hauser, H., Fussenegger, M. 140, Springer, Humana Press, NJ. (2007).
- Zhao, L., et al. A 3D printed hanging drop dripper for tumor spheroids analysis without recovery. Scientific Reports. 9 (1), 19717 (2019).
- Amaral, R. L., Miranda, M., Marcato, P. D., Swiech, K. Comparative analysis of 3D bladder tumor spheroids obtained by forced floating and hanging drop methods for drug screening. Frontiers in Physiology. 8, 605 (2017).
- Gencoglu, M. F., et al. Comparative study of multicellular tumor spheroid formation methods and implications for drug screening. ACS Biomaterials Science & Engineering. 4 (2), 410-420 (2018).
- Zhang, C., Liu, C., Zhao, H. Mechanical properties of brain tissue based on microstructure. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 126, 104924 (2021).
- Alifieris, C., Trafalis, D. T. Glioblastoma multiforme: Pathogenesis and treatment. Pharmacology & Therapeutics. 152, 63-82 (2015).
- Zustiak, S. P., Leach, J. B. Hydrolytically degradable poly (ethylene glycol) hydrogel scaffolds with tunable degradation and mechanical properties. Biomacromolecules. 11 (5), 1348-1357 (2010).
- Zustiak, S. P., Wei, Y., Leach, J. B. Protein-hydrogel interactions in tissue engineering: Mechanisms and applications. Tissue Engineering Part B: Reviews. 19 (2), 160-171 (2013).
- Kroger, S. M., et al. Design of hydrolytically degradable polyethylene glycol crosslinkers for facile control of hydrogel degradation. Macromolecular Bioscience. 20 (10), 2000085 (2020).
- Raeber, G., Lutolf, M., Hubbell, J. Molecularly engineered PEG hydrogels: a novel model system for proteolytically mediated cell migration. Biophysical Journal. 89 (2), 1374-1388 (2005).
- Bruns, J., Egan, T., Mercier, P., Zustiak, S. P. Glioblastoma spheroid growth and chemotherapeutic responses in single and dual-stiffness hydrogels. Acta Biomaterialia. 163, 400-414 (2023).
- Kuwajima, T., et al. ClearT: a detergent-and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).
- Holt, S. E., Ward, E. S., Ober, R. J., Alge, D. L. Shooting for the moon: using tissue-mimetic hydrogels to gain new insight on cancer biology and screen therapeutics. MRS Communications. 7 (3), 427-441 (2017).
- Jain, E., Scott, K. M., Zustiak, S. P., Sell, S. A. Fabrication of polyethylene glycol-based hydrogel microspheres through electrospraying. Macromolecular Materials and Engineering. 300 (8), 823-835 (2015).
- Raghavan, S., et al. Comparative analysis of tumor spheroid generation techniques for differential in vitro drug toxicity. Oncotarget. 7 (13), 16948 (2016).
- Lee, K. -H., Kim, T. -H. Recent advances in multicellular tumor spheroid generation for drug screening. Biosensors. 11 (11), 445 (2021).
