रैपिड इन विट्रो साइटोटॉक्सिसिटी फ्लोरोसेंट इमेजिंग का उपयोग करके जुर्काट व्यक्त चिमेरिक एंटीजन रिसेप्टर का मूल्यांकन
Summary
जुर्काट कोशिकाओं द्वारा मात्रात्मक ट्यूमर सेल हत्या का मूल्यांकन करने के लिए एक प्रोटोकॉल, जो एकल ट्यूमर एंटीजन को लक्षित करने वाले काइमेरिक एंटीजन रिसेप्टर (सीएआर) को व्यक्त करता है”. इस प्रोटोकॉल का उपयोग परिधीय रक्त-व्युत्पन्न टी कोशिकाओं में पुष्टि से पहले कार काज निर्माणों के तेजी से अनुकूलन के लिए एक स्क्रीनिंग प्लेटफॉर्म के रूप में किया जा सकता है।
Abstract
काइमेरिक एंटीजन रिसेप्टर (सीएआर) टी कोशिकाएं ऑन्कोलॉजी में सबसे आगे हैं। एक सीएआर का निर्माण एक लक्ष्यीकरण डोमेन (आमतौर पर एक एकल श्रृंखला चर टुकड़ा, एससीएफवी) से किया जाता है, जिसमें एक इंट्रा-चेन लिंकर होता है, जिसके बाद एक काज, ट्रांसमेम्ब्रेन और कॉस्टिमुलेटरी डोमेन होता है। इंट्रा-चेन लिंकर और काज डोमेन के संशोधन से सीएआर-मध्यस्थता हत्या पर महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ सकता है। सीएआर निर्माण के प्रत्येक भाग के लिए कई अलग-अलग विकल्पों को ध्यान में रखते हुए, बड़ी संख्या में क्रमपरिवर्तन हैं। CAR-T सेल बनवणे हा एक वेळ घेतने आणि महँगी प्रक्रिया आहे, आणि अनेक निर्माणे करणे आणि चाचणी करणे एक भारी वेळ आणि मॅटेरियल गुंतवणूक आहे. यह प्रोटोकॉल जुर्काट कोशिकाओं (सीएआर-जे) में काज-अनुकूलित कार निर्माणों का तेजी से मूल्यांकन करने के लिए एक मंच का वर्णन करता है। जुर्काट कोशिकाएं उच्च लेंटवायरस तेज के साथ एक अमर टी सेल लाइन हैं, जो कुशल सीएआर पारगमन की अनुमति देती हैं। यहां, हम फ्लोरोसेंट इमेजर का उपयोग करके कार-जे का तेजी से मूल्यांकन करने के लिए एक मंच प्रस्तुत करते हैं, इसके बाद पीबीएमसी व्युत्पन्न टी कोशिकाओं में साइटोलिसिस की पुष्टि होती है।
Introduction
CAR-T सेल थेरापाईले हेमटोलॉजिकल विकृतींमध्ये खूप वादाखिलाफी दर्शविले आहे, 6 पासून स्पष्ट 2017 पासून FDA-मंजूर CAR-T उत्पादनांत, जैसा कि राष्ट्रीय कैंसर संस्थान1 द्वारा रिपोर्ट किया गया है. ठोस ट्यूमर को लक्षित करने के लिए नैदानिक परीक्षणों में कई CAR-T कोशिकाएं हैं। इंजीनियरिंग उपन्यास सीएआर लक्ष्य और कार निर्माण का अनुकूलन एक सीएआर-टी सेल की प्रभावकारिता के लिए महत्वपूर्ण है। प्रत्येक आवेदन के लिए आदर्श कार निर्माण का चयन ट्यूमर जुड़े एंटीजन (टीएए) के सटीक लक्ष्यीकरण के लिए आवश्यक है, जबकि सामान्य ऊतकों2 में टीएए अभिव्यक्ति के निम्न स्तर से परहेज.
एक सीएआर निर्माण मुख्य रूप से पांच डिब्बों से बना है: (1) बाह्य एकल श्रृंखला चर टुकड़ा (scFv) ट्यूमर प्रतिजन को लक्षित डोमेन; (2) काज डोमेन; (3) ट्रांसमेम्ब्रेन डोमेन; (4) इंट्रासेल्युलर साइटोप्लाज्मिक टी सेल कॉस्टिमुलेटरी डोमेन; और (5) सिग्नलिंग डोमेन। यी डोमेनहरू प्रत्येक संशोधन यसको लक्ष्य सेल3 सँग संलग्न CAR-T सेलको सटीकता प्रभावित गर्दछ। इसलिए, इन विट्रो में इन कार निर्माणों के साइटोटॉक्सिसिटी और क्रॉस-रिएक्टिविटी का मूल्यांकन विवो प्रयोगों में प्रगति के लिए सही निर्माण का चयन करना महत्वपूर्ण है। टी कोशिकाओं द्वारा साइटोलिसिस के मूल्यांकन के वर्तमान तरीकों में 51सीआर रिलीज परख, लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज रिलीज परख, बायोलुमिनसेंट इमेजिंग परख, वास्तविक समय प्रतिबाधा-आधारित सेल विश्लेषण और सेल-आधारित प्रवाह साइटोमेट्री परख 4,5 शामिल हैं। यहां वर्णित फ्लोरोसेंट इमेजिंग-आधारित प्लेटफॉर्म जीवित बनाम मृत कोशिकाओं की संख्या की पहचान करता है, जो टी कोशिकाओं द्वारा साइटोलिसिस के मूल्यांकन की अप्रत्यक्ष विधि के विपरीत टी सेल साइटोलिसिस का प्रत्यक्ष परिमाणीकरण है।
एमडीए-एमबी -231 ट्रिपल-नेगेटिव स्तन कैंसर (टीएनबीसी) कोशिकाओं के खिलाफ एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर रिसेप्टर (ईजीएफआर) सीएआर व्यक्त करने वाली जुर्काट कोशिकाओं की साइटोटॉक्सिसिटी का मूल्यांकन करने के लिए न्यूनतम हस्तक्षेप के साथ यहां एक आसान, लागत-कुशल, तेजी से और उच्च थ्रूपुट तकनीक है और ईजीएफआर सीआरआईएसपीआर एमडीए-एमबी -231 कोशिकाओं को खटखटाता है। जुर्काट कोशिकाएं अमर मानव टी लिम्फोसाइट कोशिकाएंहैं 6 जिनका व्यापक रूप से टी सेल सक्रियण और सिग्नलिंग तंत्र7 का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया गया है। इसके अलावा, Jurkat कोशिकाओं कई अध्ययन 8,9,10,11 में इन विट्रो कार परीक्षण में के लिए इस्तेमाल किया गया है. जुर्काट कोशिकाओं को आसानी से लेंटवायरस द्वारा ट्रांसड्यूस किया जाता है और निरंतर प्रसार होता है, और इस प्रणाली का लाभ विभिन्न ईजीएफआर कार निर्माणों के काज डोमेन को अनुकूलित करने के लिए उठाया गया था।
इस परख स्क्रीनिंग कई कार विभिन्न ट्यूमर प्रतिजनों को लक्षित निर्माण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और कई पक्षपाती ट्यूमर सेल लाइनों के खिलाफ और ट्यूमर (ई: टी) अनुपात के लिए विभिन्न प्रभावक में इस्तेमाल किया. इसके अतिरिक्त, कई समय बिंदुओं का मूल्यांकन किया जा सकता है, और विभिन्न सीएआर निर्माणों के बीच सर्वश्रेष्ठ हत्या की पहचान करने के लिए प्रतिकृतियों की संख्या को संशोधित किया जा सकता है। परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (PBMCs) व्युत्पन्न CD3 T कोशिकाओं का उपयोग करके सर्वोत्तम निर्माणों की पुष्टि करने की आवश्यकता है। इस पद्धति को विकसित करने के पीछे समग्र लक्ष्य कम पारगमन दक्षता जैसी बाधाओं पर काबू पाने के लिए उच्च थ्रूपुट तरीके से सीएआर काज ज्यामिति को तेजी से अनुकूलित करना है, इसके बाद पीबीएमसी व्युत्पन्न टी कोशिकाओं में पुष्टि होती है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां हमने जुर्काट कोशिकाओं में सीएआर अभिव्यक्ति द्वारा प्रेरित लक्ष्य-विशिष्ट साइटोलाइटिक गतिविधि का कुशलतापूर्वक मूल्यांकन करने के लिए एक तीव्र विधि का प्रस्ताव दिया है। सबै CAR निर्माणहरूमा समान s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
एमडीए-एमबी -231 डॉ शेन स्टेक्लेन से एक तरह का उपहार था। लेखक इस शोध का संचालन करने के लिए कैनसस कैंसर सेंटर विश्वविद्यालय से वित्त पोषण स्वीकार करते हैं।
Materials
| 15 mL Conical Tube (Sterile) | Midwest Scientific | #C15B | Any similar will work |
| 50 mL Conical Tube (Sterile) | Thermo Scientific | 339652 | Any similar will work |
| Black/Clear 96 well plate | Falcon | 353219 | Celligo has a list of compatible plates |
| Celigo 4 Channel Imaging Cytomenter | Nexcelcom Bioscience | 200-BFFL-5C | Any similar will work |
| Celigo Software | Nexcelcom Bioscience | Version 5.3.0.0 | Any similar will work |
| Cell Culture Incubator | Thermo Scientific | HeraCell 160i | Any similar will work |
| Cell Culture Treated Flasks (T75, various sizes, Sterile) | TPP | 90076 | Any similar will work |
| CFSE | Tonbo | 13-0850-U500 | Any similar will work |
| Cytek Muse Cell Analyzer | Cytek | 0500-3115 | Any similar will work |
| DMEM | Gibco | 11995-040 | Any similar will work |
| FBS | Gemini bio-products | 900-108 | Any similar will work |
| Flow Cytometer | Cytek, BD, etc | Aurora, LSR II, etc | Any similar will work |
| FlowJo Sortware | Becton Dickinson & Company | Version 10.7.1 | Any similar will work |
| Fluorobrite DMEM | Gibco | A18967-01 | Any similar will work |
| GraphPad Software | GraphPad | Version 9.3.1 (471) | Any similar will work |
| Multichanel Pipette | Thermo Scientific | Finnpipette F2 | Any similar will work |
| PBS | Gibco | 10010-031 | Any similar will work |
| PenStrep | Gibco | 15070-063 | Any similar will work |
| Pipette tips (Sterile, filtered, 1 mL, Various sizes) | Pr1ma | PR-1250RK-FL, etc | Any similar will work |
| Pipettors | Thermo Scientific | Finnpipette F2 | Any similar will work |
| Propidium Iodide | Invitrogen | P1304MP | Any similar will work |
| RPMI | Corning | 10-041-cv | Any similar will work |
| Serological Pipette Aid | Drummond Scientific | 4-000-105 | Any similar will work |
| Serological Pipettes (Sterile, various sizes) | Pr1ma | PR-SERO-25, etc | Any similar will work |
| Sodium Pyruvate | Corning | 25-000-CI | Any similar will work |
| Sterile Reservoirs | Midwest Scientific | RESE-2000 | Any similar will work |
| Table top centrifuge | Eppendorf | 5810R | Any similar will work |
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