Floresan Görüntüleme Kullanılarak Jurkat Eksprese Eden Kimerik Antijen Reseptörünün Hızlı İn Vitro Sitotoksisite Değerlendirmesi
Summary
Tek tümör antijenini hedefleyen kimerik antijen reseptörü (CAR) eksprese eden Jurkat hücreleri tarafından kantitatif tümör hücresi öldürmesini değerlendirmek için bir protokol. Bu protokol, periferik kandan türetilen T hücrelerinde onaylanmadan önce CAR menteşe yapılarının hızlı optimizasyonu için bir tarama platformu olarak kullanılabilir.
Abstract
Kimerik antijen reseptörü (CAR) T hücreleri onkolojinin ön saflarında yer alır. Bir CAR, eşlik eden bir zincir içi bağlayıcı ve ardından bir menteşe, transmembran ve yardımcı uyarıcı alan ile bir hedefleme alanından (genellikle tek zincirli değişken bir parça, scFv) oluşur. Zincir içi bağlayıcı ve menteşe alanının değiştirilmesi, CAR aracılı öldürme üzerinde önemli bir etkiye sahip olabilir. Bir CAR yapısının her bir parçası için birçok farklı seçenek göz önüne alındığında, çok sayıda permütasyon vardır. CAR-T hücreleri yapmak zaman alıcı ve pahalı bir süreçtir ve birçok yapıyı yapmak ve test etmek ağır bir zaman ve malzeme yatırımıdır. Bu protokol, Jurkat hücrelerinde (CAR-J) menteşe için optimize edilmiş CAR yapılarını hızlı bir şekilde değerlendirmek için bir platformu açıklar. Jurkat hücreleri, verimli CAR transdüksiyonuna izin veren, yüksek lentivirüs alımına sahip ölümsüzleştirilmiş bir T hücre hattıdır. Burada, bir floresan görüntüleyici kullanarak CAR-J’yi hızlı bir şekilde değerlendirmek için bir platform sunuyoruz, ardından PBMC’den türetilen T hücrelerinde sitolizin doğrulanması geliyor.
Introduction
CAR-T hücre tedavisi, Ulusal Kanser Enstitüsü6 tarafından bildirildiği üzere, 2017’den bu yana 1 FDA onaylı CAR-T ürününden de anlaşılacağı gibi, hematolojik malignitelerde büyük umut vaat etmektedir. Katı tümörleri hedeflemek için klinik çalışmalarda çok sayıda CAR-T hücresi vardır. Yeni CAR hedeflerinin mühendisliği ve CAR yapısının optimize edilmesi, bir CAR-T hücresinin etkinliği için hayati önem taşır. Her uygulama için ideal CAR yapısının seçilmesi, normal dokularda düşük TAA ekspresyon seviyelerinden kaçınırken, tümörle ilişkili antijenlerin (TAA) doğru hedeflenmesi için gereklidir2.
Bir CAR yapısı temel olarak beş bölmeden oluşur: (1) tümör antijenini hedefleyen hücre dışı tek zincirli değişken fragman (scFv) alanı; (2) menteşe alanı; (3) transmembran alanı; (4) hücre içi sitoplazmik T hücresi uyarıcı alanı; ve (5) sinyal alanı. Bu alanların her birinin değiştirilmesi, hedef hücresi3 ile etkileşime giren CAR-T hücresinin hassasiyetini etkiler. Bu nedenle, bu CAR yapılarının sitotoksisitesini ve çapraz reaktivitesini in vitro olarak değerlendirmek, in vivo deneylere doğru ilerlemek için doğru yapıyı seçmek için kritik öneme sahiptir. T hücreleri tarafından sitolizi değerlendirmenin mevcut yöntemleri arasında 51Cr salım testi, laktat dehidrojenaz salım testi, biyolüminesan görüntüleme testi, gerçek zamanlı empedans tabanlı hücre analizi ve hücre bazlı akış sitometrisi testi 4,5 bulunur. Burada açıklanan floresan görüntüleme tabanlı platform, T hücreleri tarafından sitolizi değerlendirmenin dolaylı bir yönteminin aksine, T hücresi sitolizinin doğrudan bir miktar tayini olan canlı ve ölü hücrelerin sayısını tanımlar.
İşte MDA-MB-231 üçlü negatif meme kanseri (TNBC) hücrelerine karşı epidermal büyüme faktörü reseptörü (EGFR) CAR eksprese eden Jurkat hücrelerinin sitotoksisitesini değerlendirmek için minimum müdahale ile kolay, uygun maliyetli, hızlı ve yüksek verimli bir tekniktir ve EGFR CRISPR MDA-MB-231 hücrelerini devre dışı bırakır. Jurkat hücreleri, T hücresi aktivasyonunu ve sinyal mekanizmalarını incelemek için yaygın olarak kullanılanölümsüzleştirilmiş insan T Lenfosit Hücreleri6’dır 7. Ayrıca, Jurkat hücreleri, çoklu çalışmalarda in vitro CAR testi için kullanılmıştır 8,9,10,11. Jurkat hücreleri, lentivirüs tarafından kolayca transdüksiyona sahiptir ve sürekli proliferasyona sahiptir ve bu sistem, çeşitli EGFR CAR yapılarının menteşe alanını optimize etmek için kullanılmıştır.
Bu test, çeşitli tümör antijenlerini hedef alan çoklu CAR yapılarını taramak için kullanılabilir ve çoklu yapışık tümör hücre hatlarına karşı ve çeşitli efektör/tümör (E:T) oranlarında kullanılabilir. Ek olarak, birden fazla zaman noktası değerlendirilebilir ve çeşitli CAR yapıları arasında en iyi öldürmeyi belirlemek için kopya sayısı değiştirilebilir. En iyi yapıların, periferik kan mononükleer hücrelerinden (PBMC’ler) türetilen CD3 T hücreleri kullanılarak doğrulanması gerekir. Bu yöntemin geliştirilmesinin arkasındaki genel amaç, düşük iletim verimliliği gibi engellerin üstesinden gelerek CAR menteşe geometrisini yüksek verimli bir şekilde hızla optimize etmek ve ardından PBMC’den türetilen T hücrelerinde onay almaktır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, Jurkat hücrelerinde CAR ekspresyonu tarafından indüklenen hedefe özgü sitolitik aktiviteyi verimli bir şekilde değerlendirmek için hızlı bir yöntem önerdik. Tüm CAR yapıları aynı scFv’ye sahiptir, ancak CAR-T hücrelerinin potensini etkilediği gösterilen farklı menteşe ve transmembran alanları13. Bu CAR-J tarafından spesifik olmayan öldürmenin daha ileri değerlendirmesi, antijen nakavt (KO) hücreleri ile kültürlenerek yapıldı. Bu, öldürmenin tümör antijeni…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
MDA-MB-231, Dr. Shane Stecklein’ın nazik bir hediyesiydi. Yazarlar, bu araştırmayı yürütmek için Kansas Üniversitesi Kanser Merkezi’nden fon aldığını kabul ediyor.
Materials
| 15 mL Conical Tube (Sterile) | Midwest Scientific | #C15B | Any similar will work |
| 50 mL Conical Tube (Sterile) | Thermo Scientific | 339652 | Any similar will work |
| Black/Clear 96 well plate | Falcon | 353219 | Celligo has a list of compatible plates |
| Celigo 4 Channel Imaging Cytomenter | Nexcelcom Bioscience | 200-BFFL-5C | Any similar will work |
| Celigo Software | Nexcelcom Bioscience | Version 5.3.0.0 | Any similar will work |
| Cell Culture Incubator | Thermo Scientific | HeraCell 160i | Any similar will work |
| Cell Culture Treated Flasks (T75, various sizes, Sterile) | TPP | 90076 | Any similar will work |
| CFSE | Tonbo | 13-0850-U500 | Any similar will work |
| Cytek Muse Cell Analyzer | Cytek | 0500-3115 | Any similar will work |
| DMEM | Gibco | 11995-040 | Any similar will work |
| FBS | Gemini bio-products | 900-108 | Any similar will work |
| Flow Cytometer | Cytek, BD, etc | Aurora, LSR II, etc | Any similar will work |
| FlowJo Sortware | Becton Dickinson & Company | Version 10.7.1 | Any similar will work |
| Fluorobrite DMEM | Gibco | A18967-01 | Any similar will work |
| GraphPad Software | GraphPad | Version 9.3.1 (471) | Any similar will work |
| Multichanel Pipette | Thermo Scientific | Finnpipette F2 | Any similar will work |
| PBS | Gibco | 10010-031 | Any similar will work |
| PenStrep | Gibco | 15070-063 | Any similar will work |
| Pipette tips (Sterile, filtered, 1 mL, Various sizes) | Pr1ma | PR-1250RK-FL, etc | Any similar will work |
| Pipettors | Thermo Scientific | Finnpipette F2 | Any similar will work |
| Propidium Iodide | Invitrogen | P1304MP | Any similar will work |
| RPMI | Corning | 10-041-cv | Any similar will work |
| Serological Pipette Aid | Drummond Scientific | 4-000-105 | Any similar will work |
| Serological Pipettes (Sterile, various sizes) | Pr1ma | PR-SERO-25, etc | Any similar will work |
| Sodium Pyruvate | Corning | 25-000-CI | Any similar will work |
| Sterile Reservoirs | Midwest Scientific | RESE-2000 | Any similar will work |
| Table top centrifuge | Eppendorf | 5810R | Any similar will work |
References
- Mitra, A. From bench to bedside: the history and progress of CAR T cell therapy. Front Immunol. 14, 1188049 (2023).
- Labanieh, L., Mackall, C. L. CAR immune cells: design principles, resistance and the next generation. Nature. 614, 635-648 (2023).
- Sterner, R. C., Sterner, R. M. CAR-T cell therapy: current limitations and potential strategies. Blood Cancer J. 11 (4), 69 (2021).
- Lisby, A. N., Carlson, R. D., Baybutt, T. R., Weindorfer, M., Snook, A. E. . Methods in Cell Biology. 167, 81-98 (2022).
- Kiesgen, S., Messinger, J. C., Chintala, N. K., Tano, Z., Adusumilli, P. S. Comparative analysis of assays to measure CAR T-cell-mediated cytotoxicity. Nat Protoc. 16 (3), 1331-1342 (2021).
- Schneider, U., Schwenk, H. U., Bornkamm, G. Characterization of EBV-genome negative "null" and "T" cell lines derived from children with acute lymphoblastic leukemia and leukemic transformed non-Hodgkin lymphoma. Int J Cancer. 19 (5), 621-626 (1977).
- Abraham, R. T., Weiss, A. Jurkat T cells and development of the T-cell receptor signalling paradigm. Nat Rev Immunol. 4 (4), 301-308 (2004).
- Bloemberg, D., et al. A high-throughput method for characterizing novel chimeric antigen receptors in Jurkat cells. Mol Ther Methods Clin Dev. 16, 238-254 (2020).
- Lipowska-Bhalla, G., Gilham, D. E., Hawkins, R. E., Rothwell, D. G. Isolation of tumor antigen-specific single-chain variable fragments using a chimeric antigen receptor bicistronic retroviral vector in a Mammalian screening protocol. Hum Gene Ther Methods. 24 (6), 381-391 (2013).
- Alonso-Camino, V., et al. CARbodies: Human antibodies against cell surface tumor antigens selected from repertoires displayed on T cell chimeric antigen receptors. Mol Ther Nucleic Acids. 2 (5), e93 (2013).
- Jahan, F., et al. Using the Jurkat reporter T cell line for evaluating the functionality of novel chimeric antigen receptors. Front Mol Med. 3, 1070384 (2023).
- Subham, S., et al. EGFR as a potent CAR T target in triple negative breast cancer brain metastases. Breast Cancer Res Treat. 197 (1), 57-69 (2023).
- Guedan, S., Calderon, H., Posey, A. D., Maus, M. V. Engineering and Design of Chimeric Antigen Receptors. Mol Ther Methods Clin Dev. 12, 145-156 (2019).
- Zaritskaya, L., Shurin, M. R., Sayers, T. J., Malyguine, A. M. New flow cytometric assays for monitoring cell-mediated cytotoxicity. Expert Rev Vaccines. 9 (6), 601-616 (2010).
- Shan, X., et al. Deficiency of PTEN in Jurkat T cells causes constitutive localization of Itk to the plasma membrane and hyperresponsiveness to CD3 stimulation. Mol Cell Biol. 20 (18), 6945-6957 (2000).
- Wu, W., et al. Multiple signaling roles of CD3ε and its application in CAR-T cell therapy. Cell. 182 (4), 855-871 (2020).
- Wang, D. Glioblastoma-targeted CD4+ CAR T cells mediate superior antitumor activity. JCI Insight. 3 (10), e99048 (2018).
- Haggerty, T. J., Dunn, I. S., Rose, L. B., Newton, E. E., Kurnick, J. T. A screening assay to identify agents that enhance T-cell recognition of human melanomas. Assay Drug Dev Technol. 10 (2), 187-201 (2012).
- Spencer, V. A., Kumar, S., Paszkiet, B., Fein, J., Zmuda, J. F. Cell culture media for fluorescence imaging: Striking the right balance between signal strength and long-term cell health. Genetic Engineer Biotech News. 34 (10), 16-18 (2014).
- . Immune Cell Killing Assays for Live-Cell Analysis Available from: https://www.sartorius.com/en/applications/life-science-research/cell-analysis/live-cell-assays/cell-function/immune-cell-killing (2023)
- Kessel, S., et al. High-throughput 3D tumor spheroid screening method for cancer drug discovery using celigo image cytometry. SLAS Technol. 22 (4), 454-465 (2017).
