Summary
هنا نصف بروتوكولات لثلاثة أنواع من مزارع زرع الجلد الجنيني للطيور التي يمكن استخدامها لفحص تفاعلات الأنسجة ، وفيلم التصوير الفاصل الزمني 4D (3D plus time) ، والاضطراب العالمي أو المحلي للوظيفة الجزيئية ، وتوصيف بيولوجيا الأنظمة.
Abstract
يعد جلد الطيور النامي أثناء التطور الجنيني نموذجا فريدا يمكن أن يوفر رؤى قيمة حول أنماط الأنسجة. فيما يلي ثلاثة اختلافات في مزارع زراعة الجلد لفحص الجوانب المختلفة لنمو الجلد. أولا ، توفر ثقافات الأعضاء خارج الجسم الحي والتلاعب فرصا للباحثين لمراقبة ودراسة تطور براعم الريش مباشرة. يمكن أن تنمو زراعة الجلد لمدة 7 أيام مما يتيح التحليل المباشر للسلوك الخلوي والتصوير 4D على فترات خلال فترة النمو هذه. وهذا يسمح أيضا للتلاعب الفيزيائي والجزيئي لظروف الثقافة لتصور استجابة الأنسجة. على سبيل المثال ، يمكن تطبيق الخرز المطلي بعامل النمو محليا لإحداث تغييرات في نقوش الريش في منطقة محدودة. بدلا من ذلك ، يمكن توصيل النقل الفيروسي عالميا في وسائط الثقافة لزيادة أو تقليل التعبير الجيني. ثانيا ، يسمح بروتوكول إعادة تركيب الجلد للباحثين بالتحقيق في تفاعلات الأنسجة بين البشرة واللحمة المتوسطة المشتقة من مناطق الجلد المختلفة أو مراحل الحياة المختلفة أو الأنواع المختلفة. وهذا يتيح فرصة لاختبار النافذة الزمنية التي تكون فيها الظهارة مؤهلة للاستجابة للإشارات وقدرتها على تكوين زوائد جلدية مختلفة استجابة لإشارات من مصادر مختلفة للحمة المتوسطة. ثالثا ، إعادة تكوين الجلد باستخدام خلايا جلدية منفصلة مغطاة بظهارة سليمة تعيد نمو الجلد وتمكن من دراسة العمليات الأولية للأنماط الدورية. يعزز هذا النهج أيضا قدرتنا على التعامل مع التعبير الجيني بين الخلايا المنفصلة قبل إنشاء نبات الجلد المعاد تشكيله. تقدم هذه الورقة بروتوكولات الاستزراع الثلاثة والتجارب النموذجية لإثبات فائدتها.
Introduction
يعد تطور جلد جنين الطيور نموذجا ممتازا لدراسة آليات التشكل بسبب الأنماط المميزة وإمكانية الوصول إلى الجراحة المجهرية والتلاعب1،2. ومع ذلك ، قد يكون تقييم الأحداث الخلوية والجزيئية في الأنسجة السليمة أمرا صعبا لأن وجود الأنسجة الدخيلة يمكن أن يعقد الملاحظات المجهرية. علاوة على ذلك ، فإن القدرة على التلاعب بالتعبير الجيني لاختبار دورها في تشكل الجلد ليست دائما مهمة بسيطة. نجد أنه يمكننا اختبار وظائف الجينات باستخدام نقل الفيروسات القهقرية بمعدل نجاح أعلى باستخدام نماذج زراعة الجلد. نناقش هنا مزايا ثلاثة نماذج لزرع الجلد تم تطويرها.
زراعة الجلد الجنيني للطيور هي نظام قوي لتقييم سلوك الخلية وتنظيم الجينات ووظيفتها أثناء تطور برعم ريشة الجلد3،4،5،6. يسمح بتقييم الآليات الجزيئية لتطور برعم الريش من خلال الإضافة العالمية لعوامل النمو الموضوعة في وسائط الاستزراع أو إطلاقها محليا من الخرز المطلي بعامل النمو. يمكن أيضا التلاعب بالجينات التنظيمية التنموية باستخدام نقل الجينات الفيروسية للأشكال السلبية السليمة أو السائدة للدراسات الوظيفية التي تقيم أدوارها في أحداث مورفوجينية محددة 7,8.
تمكن ثقافة إعادة التركيب الظهارية والوسيطة للطيور الباحثين من تحديد مساهمات كل مكون من مكونات الجلد خلال المراحل المبكرة من تشكل الجلد. كشف استخدام رولز لهذا النهج أن التفاعلات بين اللحمة المتوسطة والظهارة ضرورية لتشكيل الزوائدالجلدية 9. يمكن أن يشكل اللحمة المتوسطة تكاثفات وهناك حاجة إلى ظهارة للحث والحفاظ على تكوينات تكثيف اللحمةالمتوسطة 2. في وقت لاحق ، تم استخدام هذا النهج لتقييم سبب فشل الدجاج بلا قشور في تكوين الريش. تم اكتشاف أن العيب موجود في اللحمة المتوسطة10. أجرى Dhouailly دراسات إعادة التركيب الظهاري الوسيطة للأنسجة في أجنة من أنواع مختلفة. قدمت هذه الدراسات رؤى تنموية وتطورية في الاتصالات الظهارية المتوسطة التي تعزز تشكل الجلد3.
تم استخدام هذه الدراسة لفهم العوامل التي تتحكم في نمو الريش بشكل أفضل. تعمل الطريقة أيضا على تحسين تصور الأحداث الخلوية والجزيئية التي تنطوي عليها أنماط الجلد التي تحدث أثناء بدء الريش وتطوره واستطالته على طول المحور الأمامي الخلفي. عندما يتم فصل الظهارة عن اللحمة المتوسطة ثم يتم إعادة دمج المكونين ، فإن التفاعلات الجديدة تعيد تأسيس نمط الجلد. يسمح لنا هذا النهج بتقييم الإشارات المحفزة للحمة المتوسطة وجزيئات الكفاءة الظهارية التي تمكن البشرة من الاستجابة لإشارات اللحمة المتوسطة11. يمكن أيضا فحص التعبير الجزيئي اللاحق المطلوب لتطوير برعم الريش وتشكيل الأنماط. أثبتت هذه الدراسات أن موقع البراعم يتحكم فيه اللحمة المتوسطة. يوضح دوران الظهارة 90o قبل إعادة التركيب مع اللحمة المتوسطة أن اتجاه استطالة برعم الريش يتم التحكم فيه بواسطة الظهارة. كانت هذه الطريقة ضرورية بالنسبة لنا لدراسة الآلية الجزيئية التي تنظم اتجاه برعم الريش12.
ثقافة إعادة تكوين جلد الطيور ، حيث يتم فصل اللحمة المتوسطة للجلد إلى خلايا مفردة قبل الطلاء بكثافة عالية للخلايا وتغطيتها بظهارة سليمة ، تعيد الخلايا الجلدية إلى حالة بدائية. ثم ينظم الزرع نفسه لتشكيل نمط دوري جديد مستقل عن الإشارات السابقة13. يمكن استخدام نموذج إعادة تكوين الجلد هذا لدراسة العمليات الأولية للزخرفة الدورية للريش. استخدمنا هذا الأسلوب لاستكشاف كيف يمكن أن يؤثر تعديل نسبة خلايا اللحمة المتوسطة إلى قطعة واحدة من الظهارة على حجم أو عدد براعم الريش. وجد أن عدد البراعم يزداد ولكن ليس حجم البراعم مع زيادة نسبة خلايا اللحمة المتوسطة. ميزة أخرى لهذا النهج هي أن النقل الفيروسي للخلايا الوسيطة يظهر كفاءة أعلى مما هو عليه في حالتي الثقافة الأخريين ويمكن أن ينتج أنماطا ظاهرية أكثر وضوحا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. زراعة جلد الدجاج (الشكل 1)
- احتضان بيض الدجاج المخصب في حاضنة مرطبة عند 38 درجة مئوية وترتيبها وفقا ل Hamburger و Hamilton14.
- في المرحلة 28 (~ E5.5) ، يكون الرقم الثاني للطرف وإصبع القدم الثالث أطول من الآخرين ؛ ثلاثة أرقام وأربعة أصابع متميزة.
- في المرحلة 29 (~ E6) ، ينحني الجناح عند الكوع ؛ الرقم الثاني أطول بشكل واضح من الأرقام الأخرى.
- في المرحلة 30 (~ E6.5) ، يظهر صفان من برعم الريش الظهري على جانبي الحبل الشوكي على المستوى العضدي وثلاثة صفوف على مستوى الساقين.
- في المرحلة 31 (~ E7) ، هناك ~ 7 صفوف من الريش على المستويات العجزية.
- في المرحلة 32 ، يوجد أحد عشر صفا أو أكثر من براعم الريش على مستوى الساقين.
- ضع جنين دجاج المرحلة 28-32 في طبق بتري 60 مم يحتوي على محلول ملحي مخزن من هانكس (HBSS) أو محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS).
- تشريح الجلد الظهري الجنيني بين أسفل الرقبة إلى منطقة الذيل. استخدم المقص لإزالة الرأس من الرقبة. اسحب براعم الأطراف برفق لوضع الجانب البطني من الجسم لأسفل مع انتشار الزوائد للخارج.
- قم بعمل شق أمامي إلى خلفي في الجلد على طول الجانبين الجانبيين لجسم الجنين باستخدام ملقط صانع الساعات أو مقص زنبركي حاد. تأكد من تثبيت الجسم بزوج من الملقط عن طريق قرص براعم الأطراف طوليا. قشر الجلد برفق من الرقبة إلى منطقة الذيل أو من الذيل إلى الرقبة باستخدام ملقط صانع الساعات.
- قم بإزالة الأنسجة تحت الجلد التي تظل ملتصقة بالجلد المقشر برفق وقم بتنعيم حواف الجلد باستخدام مقص الربيع الحاد.
- أضف 2 مل / بئر من وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) المكمل بمصل بقري جنيني بنسبة 10٪ (FBS) ومحلول البنسلين / الستربتومايسين (مخفف 1: 100) إلى بئر في طبق مكون من 6 آبار. بمجرد إضافة الوسط والمضادات الحيوية ، ضع ملحق زراعة الأنسجة المعقمة داخل البئر ، بحيث تكون الوسائط على السطح الخارجي لملحق الاستزراع.
- انقل الجلد باستخدام ملعقة إلى ملحق المزرعة مع توجيه البشرة لأعلى وتوجيه اللحمة المتوسطة لأسفل على غشاء الإدخال. للتأكد من أن الجلد مسطح دون أي تجاعيد ، اسحب الجلد على الملعقة في HBSS. حرك الجلد من الملعقة بالسائل لتسهيل نقل الجلد دون طي.
- قم بإزالة HBSS الزائد من ملحق الثقافة باستخدام ماصة 200 ميكرولتر. اترك طبقة رقيقة من HBSS داخل ملحق الثقافة للحفاظ على النبات شبه رطب لتوفير واجهة هواء سائلة.
- احتضان مزارع زرع الجلد عند 37 درجة مئوية باستخدام 5٪ CO2 و 95٪ هواء. تغيير المتوسطة كل 2 أيام.
ملاحظة: تم نشر هذا الإجراء4. يمكن أيضا استخدام نظام الاستزراع هذا مع جلد الطيور الأخرى مثل مزارع السمان أو جلد العصافير.
2. إعادة تركيب جلد الدجاج الظهاري الوسيطة (الشكل 2)
- احتضان بيض الدجاج المخصب في حاضنة مرطبة عند 38 درجة مئوية وترتيب الأجنة وفقا ل Hamburger and Hamilton14 (القسم 1.1).
- تحضير 2x محلول ملحي خال من الكالسيوم والمغنيسيوم (CMF) مع محلول مؤقت بنسبة 0.25٪ من حمض الإيثيلين ديامينيترايتيك (EDTA).
- اصنع 10x CMF buffer (كلوريد الصوديوم (1.37 م) 80 جم ، KCl (0.04 م) 3 جم ، NaH2PO4 (0.004 م) 0.5 جم ، KH2PO4 (2 م) 0.25 جم ، NaHCO3 (0.12 م) 10 جم ، الجلوكوز (0.1 م) 20 جم في 1000 مل من الماء المقطر. اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.3. لصنع 100 مل من 2x CMF مع 0.25٪ EDTA عازلة ، يجب إذابة EDTA في 80 مل من الماء المقطر أولا ، ثم إضافة 20 مل من 10x CMF buffer لصنع 2x CMF مع 0.25٪ EDTA حل العمل.
- تشريح المرحلة 30-32 من الجلود الظهرية لجنين الدجاج في HBSS كما هو موضح أعلاه (القسم 1.2) واحتضانها في محلول ملحي 2x CMF مع 0.25٪ EDTA على الجليد لمدة 15-20 دقيقة.
- افصل بعناية بين الظهارة واللحمة المتوسطة باستخدام ملقط صانع الساعات. انقل الظهارة المنفصلة واللحمة المتوسطة إلى طبق نظيف يحتوي على HBSS.
- أعد دمج الظهارة مع اللحمة المتوسطة عن طريق وضع اللحمة المتوسطة أولا على طبق بتري يحتوي على HBSS ، ثم ضع الظهارة فوق اللحمة المتوسطة. ضع الظهارة على طول نفس المحور الأمامي الخلفي مثل اللحمة المتوسطة أو أدر الظهارة 90o من المحور الأمامي الخلفي للحمة المتوسطة لتحديد المكون الذي ينظم الجوانب المختلفة لتشكل الجلد.
- انقل الجلود المعاد تجميعها إلى إدخالات الثقافة في أطباق استزراع 6 آبار للنمو وإزالة HBSS الزائد حول الجلد المعاد تجميعه.
- ضع 2 مل من وسط زراعة DMEM مع 10٪ FBS في البئر خارج الملحق. ضع طبقة رقيقة من DMEM داخل حجرة الإدخال للحفاظ على النبات شبه رطب لتوفير واجهة هواء سائلة.
- احتضان مؤتلف الجلد عند 37 درجة مئوية في خليط من 5٪ CO2 و 95٪ هواء. تغيير المتوسطة كل 2 أيام. قم بتوثيق التغيرات في النمط الظاهري في مراحل الجلد الأولية لتطور الجلد باستخدام التصوير الفوتوغرافي بفاصل زمني باستخدام كاميرا مثبتة على مجهر تشريح.
ملاحظة: تم نشر هذا الإجراء11.
3. إعادة تكوين جلد الدجاج (الشكل 3)
- احتضان بيض الدجاج المخصب في حاضنة مرطبة عند 38 درجة مئوية وترتيب الأجنة وفقا ل Hamburger and Hamilton14 (القسم 1.1).
- تشريح المرحلة 30-33 الجلود الظهرية لجنين الدجاج في HBSS. احتضان القشرة في محلول ملحي 2x CMF مع 0.25٪ EDTA على الثلج لمدة 15-20 دقيقة كما هو موضح أعلاه (القسم 2.3).
- افصل بعناية بين الظهارة واللحمة المتوسطة باستخدام ملقط صانع الساعات. نقل الظهارة المنفصلة واللحمة المتوسطة إلى HBSS على الجليد.
ملاحظة: احرص على عدم إتلاف الطبقة القاعدية للظهارة عند فصل الظهارة عن اللحمة المتوسطة. - اجمع اللحمة المتوسطة المنفصلة في أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل واحتضانها بمحلول كولاجيناز / تربسين 0.1٪ مصنوع في برنامج تلفزيوني في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 10-15 دقيقة.
- افصل اللحمة المتوسطة للجلد باستخدام ماصة باستور لعمل تعليق أحادي الخلية. أضف DMEM مع 10٪ FBS لوقف عملية الهضم.
- بيليه وأجهزة الطرد المركزي الخلايا في 233 × غرام لمدة 5 دقائق. يعاد تعليق الخلايا بوسط استزراع بتركيز 2 × 107 خلايا / مل.
ملاحظة: في هذه الخطوة ، يمكن أيضا إعادة تعليق خلايا اللحمة المتوسطة في وسط يحتوي على فيروس لمدة 2-3 ساعات على الجليد لنقل الجينات. - ضع ملحق زراعة الخلايا في بئر واحد من طبق مكون من 6 آبار. إسقاط 10 ميكرولتر من 2 × 107 خلايا / مل خلايا اللحمة المتوسطة على إدراج زراعة الأنسجة. ضع 2 مل من وسط زراعة DMEM مع 10٪ FBS في البئر خارج الملحق. احتضان خلايا اللحمة المتوسطة المطلية عند 37 درجة مئوية باستخدام حاضنة هواء 5٪ CO2 و 95٪ لمدة 1 ساعة للسماح للخلايا بالاستقرار على غشاء الإدخال.
- انقل الظهارة السليمة أعلى قطرة اللحمة المتوسطة المطلية مع طبقة الخلايا القاعدية الظهارية التي تواجه خلايا اللحمة المتوسطة باستخدام ماصة 1 مل.
ملاحظة: عند نقل الظهارة إلى قطرة اللحمة المتوسطة ، لا ينبغي إزعاج خلايا اللحمة المتوسطة. - قم بتسطيح الظهارة السليمة فوق اللحمة المتوسطة لجعل الجلد المعاد تشكيله يزرع. اترك طبقة رقيقة من الوسط على الملحق للحفاظ على الجلد المعاد تشكيله شبه مبلل لتوفير واجهة هواء سائلة. احتضان نبتة الجلد المعاد تشكيلها عند 37 درجة مئوية في حاضنة هواء 5٪ CO2 و 95٪. تغيير المتوسطة كل 2 أيام.
ملاحظة: تم نشر هذا الإجراء13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
مزارع زرع الجلد
يمكن ملاحظة تطور برعم الريش من ثقافات أعضاء الجلد خارج الجسم الحي مباشرة تحت المجهر. باستخدام نموذج زراعة الجلد للجلد الظهري للمرحلة 30 من الدجاج ، تظهر اللافتات على طول خط الوسط. ثم تنتشر الجبهة المورفولوجية تدريجيا بشكل جانبي نحو محيط الجلد مع تكوين ريشة بريمورديا جديدة. سوف تتطور هذه الريشة البدائية إلى براعم ريش قصيرة بعد يومين في الثقافة وبراعم ريش طويلة بعد 4 أيام في الثقافة (الشكل 1).
ثقافات إعادة تركيب الجلد
لإعادة تركيب الجلد ، عندما يتم إعادة دمج الظهارة واللحمة المتوسطة ، تختفي اللافتات الأصلية. ستظهر لافتات جديدة بعد فترة وجيزة من إعادة التركيب وتتطور لتشكيل براعم ريش قصيرة وبراعم ريش طويلة بعد 2 و 4 أيام في الثقافة ، على التوالي. إذا تم تدوير الظهارة 90 درجة بالنسبة إلى اللحمة المتوسطة ، تحديد اتجاه البراعم المستطيلة بواسطة الظهارة (الشكل 2).
ثقافات إعادة تكوين الجلد
لإعادة تكوين الجلد ، تظهر ثقافات الأعضاء خارج الجسم الحي متجانسة في البداية ، ثم التكثيف الجلدي مع شكل تباعد متساو في وقت واحد بعد 1 يوم في الثقافة. تجدر الإشارة إلى أن عدد براعم الريش يعتمد على عدد خلايا اللحمة المتوسطة. أدت أعداد اللحمة المتوسطة المنخفضة إلى تحفيز عدد أقل من البراعم ذات الحجم المماثل لتشكيل11. تتشكل براعم الريش القصيرة بعد 2-3 أيام في الثقافة وستتشكل براعم الريش الطويلة بعد 4-5 أيام في الثقافة (الشكل 3).
يوضح الشكل 4 مخططات موجزة لثقافة أعضاء الجلد خارج الجسم الحي ، وثقافة أعضاء إعادة تركيب الجلد ، وثقافة أعضاء إعادة تكوين الجلد.
الشكل 1: زراعة أعضاء الجلد خارج الجسم الحي. يتم تشريح جلد جنين الدجاج في المرحلة 32 في HBSS وزراعته في 6 إدخالات استزراع جيدة (T0 ، في الوقت 0) لمدة 2 و 4 أيام. تتطور ريشة الريشة إلى براعم ريشة قصيرة بعد 2 أيام في الثقافة وبراعم ريشة طويلة بعد 4 أيام في الثقافة. يشار إلى اللافتات الجلدية بالسهم الأبيض. لاحظ أن البراعم في خط الوسط أكثر نضجا من تلك الموجودة على كلا الجانبين الجانبيين. تم تعديل هذه الطريقة من جيانغ وتشونغ4. شريط المقياس = 500 ميكرومتر. اختصار: HBSS = محلول ملحي مخزن لهانك. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: زراعة الأعضاء في إعادة تركيب الجلد خارج الجسم الحي. يتم تشريح جلد جنين الدجاج في المرحلة 32 في HBSS ، ويتم فصل الظهارة واللحمة المتوسطة في 2x CMF buffer. يتم إعادة دمج ظهارة الجلد واللحمة المتوسطة مع أو بدون دوران وثقافتها لمدة 2 أيام و 4 أيام. تتطور اللافتات الجديدة إلى براعم ريش قصيرة وطويلة بعد 2 و 4 أيام في الثقافة. إذا تم تدوير الظهارة 90 درجة بالنسبة إلى اللحمة المتوسطة ، يتم تحديد اتجاه البراعم الجديدة بواسطة الظهارة12. تم تعديل هذه الطريقة من Chuong et al.11. شريط المقياس = 500 ميكرومتر. اختصار: CMF = خالي من الكالسيوم والمغنيسيوم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: زراعة الأعضاء لإعادة تكوين الجلد خارج الجسم الحي. يتم تشريح جلد جنين الدجاج في المرحلة 32 ، ويتم فصل الظهارة واللحمة المتوسطة في 2x CMF buffer. يتم فصل اللحمة المتوسطة إلى خلايا مفردة بنسبة 0.1٪ كولاجيناز وتريبسين وحبيبات بكثافة خلايا عالية على ملحق مستزرع. يتم إعادة تشكيل حبيبات الخلايا الجلدية بظهارة سليمة (T0 ، في الوقت 0) وزراعتها لمدة 6 ساعات و 2 أيام و 5 أيام. تظهر النباتات الخارجية متجانسة في البداية (6 ساعات) ثم تتكثف الجلدية مع تباعد متساو في وقت واحد بعد 1 يوم في الثقافة. تتشكل براعم الريش القصيرة بعد 2-3 أيام في الثقافة وتتشكل براعم الريش الطويلة بعد 4-5 أيام في الثقافة. تم تعديل هذه الطريقة من Jiang et al.13. شريط المقياس = 500 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: مخططات لنماذج زراعة أعضاء الجلد خارج الجسم الحي. يبدأ الجلد عند E6.5 كطبقة واحدة من الظهارة التي تغطي خلايا اللحمة المتوسطة. تم تصوير هذا في الجزء العلوي من طرق الزرع الثلاثة. أ: زراعة أعضاء الجلد خارج الجسم الحي. الجلد مطلي سليما فوق ملحق مزرعة في الهواء: واجهة وسائط عند 37 درجة مئوية في حاضنة هواء 5٪ CO2 و 95٪. (ب) زراعة أعضاء إعادة تركيب الجلد خارج الجسم الحي. يتم فصل ظهارة الجلد عن اللحمة المتوسطة ثم يعاد تجميعها قبل الطلاء على ملحق مزرعة الخلية في الهواء: واجهة الوسائط عند 37 درجة مئوية في حاضنة هواء 5٪ CO2 و 95٪. (ج) زراعة الأعضاء لإعادة تكوين الجلد خارج الجسم الحي. يتم فصل ظهارة الجلد عن اللحمة المتوسطة. ثم يتم فصل اللحمة المتوسطة إلى معلق أحادي الخلية ويتم تكوير خلايا اللحمة المتوسطة في جهاز طرد مركزي. ثم يتم إعادة تعليق خلايا اللحمة المتوسطة بتركيز 2 × 107 خلايا / مل و 10 ميكرولتر من المعلق الموضوعة على ملحق المزرعة ثم يتم تغطيتها بقطعة سليمة من البشرة. يتم تحضين الثقافة في الهواء: واجهة الوسائط عند 37 درجة مئوية في حاضنة هواء 5٪ CO2 و 95٪. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل التكميلي S1: نقل خلايا اللحمة المتوسطة مع فيروس يعبر عن GFP. تم تحضين خلايا اللحمة المتوسطة المنفصلة (2 × 107 خلايا / مل) لمدة 3 ساعات على الجليد مع >107 وحدات معدية / مل من فيروس ساركوما الطيور المختص بالتكرار الذي يعبر عن البروتين الفلوري الأخضر (GFP). ثم تم استخدام خلايا اللحمة المتوسطة لتشكيل مزارع أعضاء الجلد المعاد تشكيلها كما هو موضح في قسم البروتوكول 3 أعلاه وتم تصويرها بعد 24 ساعة. تظهر البيانات أن ~ 40٪ من خلايا اللحمة المتوسطة تم تصنيفها مع GFP. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
توفر إعادة تركيب الأنسجة مقايسة لاستكشاف المساهمات الفريدة للظهارة واللحمة المتوسطة. في الدجاج ، يبدأ الريش في التطور في اليوم الجنيني 7 (E7) بينما تبدأ القشور في E9. عندما يتم إعادة دمج اللحمة المتوسطة على نطاق E9 مع ظهارة الريش E7 ، تشكل الأنسجة المعاد تجميعها قشور ، وعندما يتم إعادة دمج اللحمة المتوسطة للريش E7 مع ريش ظهارة مقياس E9 تتشكل11. أظهرت هذه الدراسات أن اللحمة المتوسطة تتحكم في تباعد تكوين النمط وهوية الأعضاء. بالطبع ، يجب أن تكون الظهارة مؤهلة لتكون قادرة على استقبال وتفسير إشارات اللحمة المتوسطة بشكل مناسب. الكفاءة موجودة فقط في الظهارة لفترة زمنية قصيرة. على عكس النتائج المذكورة أعلاه ، من المدهش أنه عندما يتم إعادة دمج الغشاء المخاطي للفم الدجاج وظهارة E5 الفموية مع اللحمة المتوسطة الجذع E8 ، فإن ظهارة الفم تشكل الريش. ومع ذلك ، فإن الغشاء المخاطي للفم يشكل العديد من الزوائد الشبيهة بالأسنان15. هذا يدل على أنه في حين أن اللحمة المتوسطة لجذع الجلد توجه ظهارة الفم لصنع الريش ، فإن ظهارة الفم ليس لديها القدرة على صنع الريش ويمكنها فقط صنع الأسنان. قد تكون ظهارة الفم في هذه الدراسة ملتزمة بالفعل بتكوين الأسنان في E5. يمكن استخدام التهجين في الموقع ، RNAscope ، و immunostaining لتأكيد التعبير الجزيئي في النباتات المعاد تجميعها للتحقق من هوية الأنسجة التي تتشكل. باستخدام هذا الفحص ، يمكن توجيه الاضطرابات على وجه التحديد إلى الظهارة أو اللحمة المتوسطة.
إعادة تكوين الأنسجة تعيد تعيين الخلايا داخل اللحمة المتوسطة إلى حالة غير ملتزمة. بدأ جلد الريش E7-E8 في تكوين تكاثف اللحمة المتوسطة في القناة الظهرية قبل أن ينفصل الجلد وينفصل اللحمة المتوسطة إلى خلايا مفردة. من خلال تسمية الخلايا الظهارية أو الوسيطة في مناطق البراعم البدائية أو بين البراعم ، يمكن العثور على الخلايا الجلدية داخل البراعم أو خارجها بغض النظر عن موقعها السابق. في كثافة خلايا اللحمة المتوسطة المنخفضة ، تشكل نباتات الجلد المعاد تشكيلها عددا قليلا من براعم الريش ذات الحجم الطبيعي. مع زيادة كثافة الخلايا الوسيطة ، يزداد عدد البراعم حتى يتم تحقيق أقصى كثافة تعبئة13. تشير هذه البيانات إلى أن الخلايا يتم إعادة برمجتها من خلال فقدان الاتصال مع جيرانها الأوليين وتخضع لجولة جديدة من تكوين الأنماط. هذه الثقافات أيضا تطوير التكثيف والريش البدائية. ومن المثير للاهتمام أن البراعم تتشكل في وقت واحد عبر الجلد بدلا من الانتشار التدريجي لتكوين البراعم الذي يظهر في نباتات الجلد والنباتات الجلدية المعاد تجميعها. توفر هذه الطريقة مراقبة ومعالجة التفاعلات الخلوية والجزيئية للجلد في المراحل المبكرة. يمكن تقييم التعبير الجزيئي في الثقافة باستخدام مقايسات المروج والمراسل. يمكن أن تساعد إعادة التكوين بين الخطوط المعدلة وراثيا أو الضربة القاضية في إجراء مزيد من التحليل لأدوار الجزيئات في عملية نقش الجلد. يتم تعزيز التنبيغ الفيروسي في خلايا اللحمة المتوسطة المنفصلة ويمكن أن يؤدي في كثير من الأحيان إلى زيادة الاضطراب.
في حين أن كل من هذه الأساليب التجريبية يمكن أن تساعد الباحثين على استكشاف الأحداث الخلوية والجزيئية التي تحدث أثناء تكوين الجلد. كثيرا ما نستخدم كل من هذه الأساليب ونرى أيها يوفر أفضل الأفكار. يمكن بعد ذلك استكشاف النتائج بشكل أكبر في ظل ظروف زراعة أخرى أو باستخدام أجنة سليمة.
حدود هذه النهج
يوفر كل من هذه المقايسات الثلاثة نتائج قابلة للتكرار بدرجة كبيرة. ومع ذلك ، نظرا لأن هذه المقايسات قد تستجيب لنفس الاضطراب بدرجات مختلفة ، فغالبا ما يكون من المفيد إزعاج الظروف باستخدام جميع المقايسات الثلاثة إذا لم تتم مواجهة أي تغييرات في البداية. على الرغم من أن ثقافة زراعة الجلد توفر نموذجا جيدا لتشكيل نمط الجلد المبكر وتطوير الزائدة الدودية للجلد ، إلا أنه لا يمكن استزراع النبات إلا لمدة ~ 1 أسبوع. هذا يحول دون استخدامها في تطور الزائدة الجلدية في وقت لاحق ، على سبيل المثال ، عملية تكوين الحليمة الجلدية وتشكل الجريب على الرغم من أنه يتم تحسين الإجراءات لزراعة هذه النباتات لفترة أطول. حتى الآن ، في الأوقات المبكرة بعد إعادة تشكيل الجلد المزروع ، ترتبط الخلايا بشكل فضفاض بركائزها ، مما يجعل التحليلات التي تستخدم عدة غسلات ، مثل التهجين في الموقع ، صعبة. تربط هذه الثقافات ركائزها بقوة أكبر بمقدار 24 ساعة حيث تشكلت التكثيف في جميع أنحاء الثقافة.
يوفر الجلد الجنيني للطيور نموذجا ممتازا لدراسة تطور الزوائد الجلدية. تتمتع مزارع زراعة الجلد بميزة تمكين التلاعب بظروف الثقافة التي تنمو فيها مزارع أعضاء الجلد خارج الجسم الحي. كما أنه يتيح تصوير الفاصل الزمني طويل المدى للتطور لرؤية انتشار البراعم من خط الوسط إلى الحواف الجانبية بمرور الوقت. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن بدء الثقافة باستخدام مراحل جنينية مختلفة لاستكشاف الأحداث المختلفة في زخرفة الريش ونموه. لتشكيل نمط دوري ، يمكن زراعة الجلد بدءا من E6 واستزراعه لمدة 4 أيام. بالنسبة لتشكل جريب الريش ، يمكن بدء الثقافة في E8 وزراعتها لمدة 4 أيام. من الصعب تشريح الجلد على مراحل قبل E6. مع الثقافات النباتية ، يمكن إجراء اضطرابات عالمية عن طريق إضافة عوامل النمو أو مثبطات إلى وسط زراعة الجلد8،16،17. يمكن تحقيق اضطراب الجلد محليا عن طريق وضع حبات مغلفة بالبروتين على نبات الجلد أو عن طريق تحويل الخلايا فيروسيا لتعديل التعبير الجيني8،16،17. تسهل الثقافات المزروعة تصوير سلوك الخلية الجماعي مثل أنشطة الكالسيوم6 وتطبيق القوى الفيزيائية الحيوية مثل توتر الأنسجة18 أو التيارات الكهربائية12. توفر هذه الطرق فرصا رائعة لتقديم رؤى جديدة حول العوامل التي تنظم الأنماط الدورية للأعضاء.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان عنه.
Acknowledgments
يتم دعم هذا العمل من خلال منحة NIAMS من المعاهد الوطنية للصحة R37 AR 060306 و R01 AR 047364 و RO1 AR078050. كما يتم دعم العمل من خلال عقد بحث تعاوني بين جامعة جنوب كاليفورنيا وجامعة الصين الطبية في تايوان. نشكر فئة USC BISC 480 Developmental Biology 2023 على الاختبار الناجح لبروتوكول زراعة جلد الطيور هذا خلال العديد من الوحدات المعملية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well culture dish | Falcon | REF 353502 | Air-Liquid Interface (ALI) Cultures |
| Cell culture inset | Falcon | REF 353090. | 0.4 µm Transparent PET Membrane |
| Collagenase Type 1 | Worthington Biochemical | LS004196 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium | Corning | 10-013-CV | 4.5 g/L glucose |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher | 16140-071 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Hanks’s buffered saline solution | Gibco | 14170-112 | No calcium, no magnesium |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15-140-122 | |
| Pogassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5379 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Sodium chloride (Nacl) | EMD | CAS 7647-14-5 | |
| Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) | Sigma-Aldrich | S0751 | |
| Trypsin | Gibco | 27250-042 |
References
- Lucas, A. M., Stettenheim, P. R. Avian anatomy: Integument part I and part II. Agriculture Handbook. 362, Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture, Washington D.C.. (1972).
- Sengel, P. In Morphogenesis of Skin, l-277. , Cambridge Univ. Press. New York. (1976).
- Dhouailly, D., Wilehm Roux, Formation of cutaneous appendages in dermo-epidermal recombinations between reptiles, birds and mammals. Archives of Developmental Biology. 177 (4), 323-340 (1975).
- Jiang, T. -X., Chuong, C. -M. Mechanism of feather morphogenesis: I. Analyses with antibodies to Adhesion Molecules Tenascin, N-CAM and Integrin. Developmental Biology. 150 (1), 82-98 (1992).
- Li, A., et al. Shaping organs by a Wnt / Notch / non-muscle myosin module which orients feather bud elongation. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 110 (16), E1452-E1461 (2013).
- Li, A., et al. Calcium oscillations coordinate feather mesenchymal cell movement by SHH dependent modulation of gap junction networks. Nature Communications. 9 (1), 5377 (2018).
- Ting-Berreth, S. A., Chuong, C. M. Local delivery of TGF beta2 can restore epithelium dependent organization of mesenchymal condensation during skin appendage morphogenesis. Developmental Biology. 179 (2), 347-359 (1996).
- Widelitz, R. B., Jiang, T. -X., Noveen, A., Chen, C. -W. J., Chuong, C. -M. FGF induces new feather buds from developing avian skin. Journal of Investigation Dermatology. 107 (6), 797-803 (1996).
- Rawles, M. E. Tissue interactions in scale and feather development as studies in dermal-epidermal recombinations. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 11, 765-789 (1963).
- McAleese, S. R., Sawyer, R. H. Correcting the phenotype of the epidermis from chick embryos homozygous for the gene scaleless (sc/sc). Science. 214 (4524), 1033-1034 (1981).
- Chuong, C. M., Widelitz, R. B., Ting-Berreth, S., Jiang, T. X. Early events during avian skin appendage regeneration: dependence on epithelial-mesenchymal interaction and order of molecular reappearance. J Invest Dermatol. 107 (4), 639-646 (1996).
- Jiang, T. X., et al. Global feather orientations changed by electric current. iScience. 24 (6), 102671 (2021).
- Jiang, T. X., Jung, H. S., Widelitz, R. B., Chuong, C. M. Self-organization of periodic patterns by dissociated feather mesenchymal cells and the regulation of size, number and spacing of primordia. Development. 126 (22), 4997-5009 (1999).
- Hamburger, V., Hamilton, H. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 188, 49-92 (1951).
- Chen, Y. P., et al. Conservation of early odontogenic signaling pathway in Aves. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 97 (18), 10044-10049 (2000).
- Chuong, C. -M., Ting, S. A., Widelitz, R. B., Lee, Y. S. Mechanism of Skin Morphogenesis: II. Retinoic acid gradient modulates axis orientation and phenotypes of skin appendages. Development. 115 (3), 839-852 (1992).
- Noveen, A., Jiang, T. -X., Chuong, C. -M. Protein kinase A and protein kinase C modulators have reciprocal effects on mesenchymal condensation during skin appendage morphogenesis. Developmental Biology. 171 (2), 677-693 (1995).
- Wu, X. S., et al. Self-assembly of biological networks via adaptive patterning revealed by avian intradermal muscle network formation. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 116 (22), 10858-10867 (2019).
