Summary
Burada, doku etkileşimlerini, 4D görüntüleme timelapse filmini (3D artı zaman), moleküler fonksiyonun küresel veya yerel bozulmasını ve sistem biyolojisi karakterizasyonunu incelemek için kullanılabilecek üç tip kuş embriyonik deri eksplant kültürü için protokolleri açıklıyoruz.
Abstract
Embriyogenez sırasında gelişen kuş derisi, doku modellemesi hakkında değerli bilgiler sağlayabilen benzersiz bir modeldir. Burada, cilt gelişiminin farklı yönlerini incelemek için deri eksplant kültürlerinde üç varyasyon açıklanmaktadır. İlk olarak, ex vivo organ kültürleri ve manipülasyonları, araştırmacılara tüy tomurcuklarının gelişimini doğrudan gözlemleme ve inceleme fırsatları sunar. Deri eksplant kültürü 7 gün boyunca büyüyebilir ve bu büyüme periyodu boyunca aralıklarla hücresel davranışın doğrudan analizine ve 4D görüntülemeye olanak tanır. Bu aynı zamanda doku tepkisini görselleştirmek için kültür koşullarının fiziksel ve moleküler manipülasyonlarına da izin verir. Örneğin, büyüme faktörü kaplı boncuklar, sınırlı bir alanda tüy deseninde değişikliklere neden olmak için yerel olarak uygulanabilir. Alternatif olarak, viral transdüksiyon, gen ekspresyonunu yukarı veya aşağı regüle etmek için kültür ortamında küresel olarak verilebilir. İkincisi, cilt rekombinasyon protokolü, araştırmacıların farklı cilt bölgelerinden, farklı yaşam evrelerinden veya farklı türlerden türetilen epidermis ve mezenşim arasındaki doku etkileşimlerini araştırmalarına olanak tanır. Bu, epitelin sinyallere yanıt vermeye yetkin olduğu zaman penceresini ve farklı mezenkimal kaynaklardan gelen sinyallere yanıt olarak farklı cilt uzantıları oluşturma yeteneğini test etme fırsatı verir. Üçüncüsü, sağlam epitel ile kaplanmış ayrışmış dermal hücreler kullanılarak cildin sulandırılması, cilt gelişimini sıfırlar ve periyodik modellemenin ilk süreçlerinin incelenmesini sağlar. Bu yaklaşım aynı zamanda, yeniden yapılandırılmış deri eksplantını oluşturmadan önce ayrışmış hücreler arasındaki gen ekspresyonunu manipüle etme yeteneğimizi de geliştirir. Bu makale, faydalarını göstermek için üç kültür protokolünü ve örnek deneyleri sunmaktadır.
Introduction
Kuş embriyosu derisi gelişimi, farklı desenler ve mikrocerrahi ve manipülasyona erişilebilirlik nedeniyle morfogenez mekanizmalarını incelemek için mükemmel bir modeldir 1,2. Bununla birlikte, sağlam dokulardaki hücresel ve moleküler olayları değerlendirmek zor olabilir, çünkü yabancı dokuların varlığı mikroskobik gözlemleri zorlaştırabilir. Ayrıca, cilt morfogenezindeki rollerini test etmek için gen ekspresyonunu manipüle etme yeteneği her zaman basit bir iş değildir. Deri eksplant modellerini kullanarak daha yüksek bir başarı oranıyla retroviral transdüksiyon kullanarak gen fonksiyonlarını test edebileceğimizi bulduk. Burada, geliştirilmiş olan üç cilt eksplant modelinin avantajlarını tartışıyoruz.
Kuş embriyonik deri kültürü, deri tüy tomurcuğu gelişimi sırasında hücre davranışını, gen regülasyonunu ve işlevini değerlendirmek için güçlü bir sistemdir 3,4,5,6. Tüy tomurcuğu gelişiminin moleküler mekanizmalarının, kültür ortamına yerleştirilen büyüme faktörlerinin küresel olarak eklenmesi veya bunların büyüme faktörü kaplı boncuklardan yerel olarak salınması yoluyla değerlendirilmesine izin verir. Gelişimsel düzenleyici genler, spesifik morfogenetik olaylardaki rollerini değerlendiren fonksiyonel çalışmalar için bozulmamış veya baskın negatif formların viral gen iletimi kullanılarak da manipüle edilebilir 7,8.
Kuş epitelyal-mezenkimal rekombinasyon kültürü, araştırmacıların cilt morfogenezinin erken aşamalarında her bir cilt bileşeninin katkılarını belirlemelerini sağlar. Rawles'ın bu yaklaşımı kullanması, mezenşim ve epitel arasındaki etkileşimlerin cilt eklerinin oluşturulması için gerekli olduğunu ortaya koymuştur9. Mezenkim yoğuşmalar oluşturabilir ve mezenkimal yoğuşma oluşumlarını indüklemek ve sürdürmek için epitel gereklidir2. Daha sonra, bu yaklaşım Pulsuz tavukların neden tüy oluşturamadığını değerlendirmek için kullanıldı. Defektin mezenkim10'da olduğu keşfedildi. Dhouailly, farklı türlerden embriyolarda doku epitelyal-mezenkimal rekombinasyon çalışmaları yaptı. Bu çalışmalar, cilt morfogenezini destekleyen epitelyal-mezenkimal iletişime gelişimsel ve evrimsel içgörüler sağladı3.
Bu çalışma, tüy büyümesini kontrol eden faktörleri daha iyi anlamak için kullanılmıştır. Yöntem ayrıca, ön-arka eksen boyunca tüy başlangıcı, gelişimi ve uzaması sırasında meydana gelen deri desenlemesinde yer alan hücresel ve moleküler olayların görselleştirilmesini de geliştirir. Epitel mezenşimden ayrıldığında ve iki bileşen daha sonra yeniden birleştirildiğinde, yeni etkileşimler cilt desenini yeniden oluşturur. Bu yaklaşım, epidermisin mezenkimal sinyallere yanıt vermesini sağlayan mezenkimal indükleyici sinyalleri ve epitelyal yeterlilik moleküllerinideğerlendirmemize izin verir 11. Tüy tomurcuğu gelişimi ve desen oluşumu için gerekli olan sonraki aşağı akış moleküler ifadesi de incelenebilir. Bu çalışmalar, tomurcukların konumunun mezenşim tarafından kontrol edildiğini ortaya koymuştur. Mezenşim ile rekombinasyondan önce epitelin 90o dönmesi, tüy tomurcuğu uzama yönünün epitel tarafından kontrol edildiğini gösterir. Bu yöntem, tüy tomurcuğu oryantasyonunu düzenleyen moleküler mekanizmayı incelememiz için gerekliydi12.
Deri mezenşiminin yüksek hücre yoğunluğunda kaplamadan önce tek hücrelere ayrıldığı ve sağlam epitel ile kaplandığı kuş derisi sulandırma kültürü, dermal hücreleri ilkel bir duruma sıfırlar. Eksplant daha sonra önceki ipuçlarından bağımsız olarak yeni bir periyodik model oluşturmak için kendi kendini organize eder13. Bu cilt sulandırma modeli, tüy periyodik desenlemenin ilk süreçlerini incelemek için kullanılabilir. Bu yaklaşımı, mezenkimal hücrelerin tek bir epitel parçasına oranının modüle edilmesinin tüy tomurcuklarının boyutunu veya sayısını nasıl etkileyebileceğini keşfetmek için kullandık. Mezenkimal hücrelerin oranı arttıkça tomurcuk sayısının arttığı, ancak tomurcukların boyutunun artmadığı bulundu. Bu yaklaşımın bir başka avantajı, mezenkimal hücre viral transdüksiyonunun diğer iki kültür koşuluna göre daha yüksek verimlilik göstermesi ve daha belirgin fenotipler üretebilmesidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Tavuk derisi eksplant kültürü (Şekil 1)
- Döllenmiş tavuk yumurtalarını nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde 38 °C'de kuluçkaya yatırın ve Hamburger ve Hamilton14'e göre hazırlayın.
- Aşama 28'de (~ E5.5), uzvun ikinci basamağı ve üçüncü parmağı diğerlerinden daha uzundur; Üç basamak ve dört ayak parmağı belirgindir.
- Aşama 29'da (~ E6), kanat dirsekten bükülür; İkinci basamak diğerlerinden belirgin şekilde daha uzundur.
- Evre 30'da (~ E6.5), omuriliğin her iki yanında iki dorsal tüy tomurcuğu sırası brakiyal seviyede ve bacak seviyesinde üç sıra görülür.
- Aşama 31'de (~ E7), jumbo-sakral seviyelerde ~ 7 sıra tüy vardır.
- 32. aşamada, bacak seviyesinde on bir veya daha fazla sıra tüy tomurcuğu bulunur.
- Hanks'in tamponlu tuzlu su çözeltisi (HBSS) veya fosfat tamponlu salin (PBS) içeren 60 mm'lik bir Petri kabına 28-32 evre bir tavuk embriyosu yerleştirin.
- Embriyo sırt derisini alt boyun ile kuyruk bölgesi arasında inceleyin. Kafayı boyundan çıkarmak için makas kullanın. Uzantılar dışa doğru yayılacak şekilde vücudun ventral tarafını aşağı doğru konumlandırmak için uzuv tomurcuklarını nazikçe çekin.
- Saatçinin forsepslerini veya keskin yaylı makası kullanarak embriyo gövdesinin iki yan tarafı boyunca deride önden arkaya bir kesi yapın. Uzuv tomurcuklarını uzunlamasına sıkıştırarak vücudu bir çift forseps ile stabilize ettiğinizden emin olun. Saatçinin forsepslerini kullanarak cildi boyundan kuyruk bölgesine veya kuyruktan boyuna kadar nazikçe soyun.
- Soyulmuş cilde bağlı kalan deri altı dokuları nazikçe çıkarın ve keskin yaylı makasla cildin kenarlarını düzeltin.
- % 10 fetal sığır serumu (FBS) ve Penisilin / streptomisin çözeltisi (1:100 seyreltilmiş) ile desteklenmiş Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle's besiyerinden (DMEM) 2 mL / kuyucuğu 6 oyuklu bir tabakta bir kuyuya ekleyin. Besiyeri ve antibiyotikler eklendikten sonra, ortam kültür ekinin dışında olacak şekilde kuyucuğun içine steril bir doku kültürü eki yerleştirin.
- Cildi bir spatula ile epidermis yukarı bakacak ve mezenkim iç zarı aşağı bakacak şekilde kültür ekine aktarın. Cildin herhangi bir kırışıklık olmadan düz durmasını sağlamak için, cildi HBSS'deki spatulanın üzerine çekin. Cildin katlanmadan transferini kolaylaştırmak için cildi sıvı ile spatuladan kaydırın.
- 200 μL'lik bir pipet ile kültür ekindeki fazla HBSS'yi çıkarın. Bir hava-sıvı arayüzü sağlamak için eksplantı yarı ıslak tutmak için kültür ekinin içinde ince bir HBSS tabakası bırakın.
- Deri eksplant kültürlerini %5 CO2 ve% 95 hava kullanarak 37 ° C'de inkübe edin. Ortamı her 2 günde bir değiştirin.
NOT: Bu prosedür yayınlanmıştır4. Bu kültür sistemi, bıldırcın veya ispinoz derisi eksplant kültürleri gibi diğer kuşların derileri ile de kullanılabilir.
2. Tavuk derisi epitelyal-mezenkimal rekombinasyon (Şekil 2)
- Döllenmiş tavuk yumurtalarını 38 °C'de nemlendirilmiş bir inkübatörde kuluçkaya yatırın ve embriyoları Hamburger ve Hamilton14'e göre evrelendirin (bölüm 1.1).
- % 0.25 etilendiamintetraasetik asit (EDTA) tamponu ile 2 adet kalsiyum-magnezyum içermeyen (CMF) salin hazırlayın.
- 10x CMF tamponu yapın (NaCl (1.37 M) 80 g, KCl (0.04 M) 3 g, NaH2PO4 (0.004 M) 0.5 g, KH2PO4 (2 M) 0.25 g, NaHCO3 (0.12 M) 10 g, glikoz (0.1 M) 20 g 1.000 mL damıtılmış suda. PH'ı 7.3'e ayarlayın. % 0.25 EDTA tamponu ile 100 mL 2x CMF yapmak için, EDTA önce 80 mL damıtılmış su içinde çözülmeli, daha sonra% 0.25 EDTA çalışma çözeltisi ile 2x CMF yapmak için 20 mL 10x CMF tamponu eklenmelidir.
- Evre 30-32 tavuk embriyo dorsal derilerini yukarıda tarif edildiği gibi HBSS'de diseke edin (bölüm 1.2) ve bunları buz üzerinde% 0.25 EDTA ile 2x CMF salin içinde 15-20 dakika inkübe edin.
- Saatçinin forsepslerini kullanarak epitel ve mezenkimi dikkatlice ayırın. Ayrılan epitel ve mezenşimi HBSS içeren temiz bir kaba aktarın.
- Önce mezenşimi HBSS içeren bir Petri kabına yerleştirerek epiteli mezenşim ile yeniden birleştirin, ardından epiteli mezenşimin üzerine yerleştirin. Epiteli mezenşim ile aynı ön-arka eksen boyunca yerleştirin veya hangi bileşenin cilt morfogenezinin farklı yönlerini düzenlediğini belirlemek için epiteli mezenşimin ön-arka ekseninden 90o çevirin.
- Yeniden birleştirilmiş derileri, büyüme için 6 oyuklu kültür kaplarındaki kültür eklerine aktarın ve yeniden birleştirilmiş derinin etrafındaki fazla HBSS'yi çıkarın.
- Ek parçanın dışındaki kuyucuğa% 10 FBS ile 2 mL DMEM kültür ortamı yerleştirin. Bir hava-sıvı arayüzü sağlamak üzere eksplantı yarı ıslak tutmak için ekleme haznesinin içine ince bir DMEM tabakası yerleştirin.
- Cilt rekombinantlarını 37 ° C'de% 5 CO2 ve% 95 hava karışımı içinde inkübe edin. Ortamı her 2 günde bir değiştirin. Diseksiyon mikroskobuna monte edilmiş bir kamera ile hızlandırılmış fotoğrafçılık kullanarak cilt gelişiminin ilk cilt aşamalarındaki fenotipik değişiklikleri belgeleyin.
NOT: Bu prosedür yayınlanmıştır11.
3. Tavuk derisinin sulandırılması (Şekil 3)
- Döllenmiş tavuk yumurtalarını 38 °C'de nemlendirilmiş bir inkübatörde kuluçkaya yatırın ve embriyoları Hamburger ve Hamilton14'e göre evrelendirin (bölüm 1.1).
- HBSS'de evre 30-33 tavuk embriyo dorsal derilerini inceleyin. Derileri, yukarıda açıklandığı gibi buz üzerinde 15-20 dakika boyunca% 0.25 EDTA ile 2x CMF salin içinde inkübe edin (bölüm 2.3).
- Saatçinin forsepslerini kullanarak epitel ve mezenkimi dikkatlice ayırın. Ayrılan epitel ve mezenkimi buz üzerinde HBSS'ye aktarın.
NOT: Epiteli mezenşimden ayırırken epitelin bazal tabakasına zarar vermemeye dikkat edin. - Ayrılan mezenşimi 15 mL'lik bir santrifüj tüpünde toplayın ve PBS'de yapılan %0.1 kollajenaz / tripsin çözeltisi ile 37 ° C'lik bir su banyosunda 10-15 dakika inkübe edin.
- Tek hücreli bir süspansiyon yapmak için cilt mezenşimini bir Pasteur pipeti ile ayırın. Sindirimi durdurmak için% 10 FBS ile DMEM ekleyin.
- Hücreleri 5 dakika boyunca 233 × g'da pelet ve santrifüjleyin. Hücreleri 2 × 107 hücre / mL konsantrasyonda kültür ortamı ile yeniden süspanse etti.
NOT: Bu adımda, mezenkimal hücreler, gen transdüksiyonu için buz üzerinde 2-3 saat boyunca virüs içeren ortamda yeniden süspanse edilebilir. - 6 oyuklu bir tabağın bir oyuğuna bir hücre kültürü eki yerleştirin. Doku kültürü ekine 10 μL 2 × 107 hücre / mL mezenkimal hücre bırakın. Ekin dışındaki kuyucuğa% 10 FBS içeren 2 ml DMEM kültür ortamı yerleştirin. Kaplanmış mezenkimal hücreleri, hücrelerin insert membranına yerleşmesine izin vermek için% 5 CO2 ve% 95 hava inkübatörü kullanarak 1 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
- Sağlam epiteli, 1 mL'lik bir pipet kullanarak epitel bazal hücre tabakası mezenkimal hücrelere bakacak şekilde kaplanmış mezenkimal damlacığın üzerine aktarın.
NOT: Epitel mezenkimal damlacığa aktarılırken, mezenkimal hücreler rahatsız edilmemelidir. - Sulandırılmış cildin eksplant yapmasını sağlamak için sağlam epiteli mezenşim üzerinde düzleştirin. Hava-sıvı bir arayüz sağlamak için sulandırılmış cilt eksplantını yarı ıslak tutmak için ek parça üzerinde ince bir ortam tabakası bırakın. Sulandırılmış deri eksplantını 37 °C'de %5 CO2 ve %95 hava inkübatörde inkübe edin. Ortamı her 2 günde bir değiştirin.
NOT: Bu prosedür yayınlanmıştır13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Deri eksplant kültürleri
Ex vivo deri organ kültürlerinden tüy tomurcuğu gelişimi doğrudan mikroskop altında gözlemlenebilir. Tavuk evre 30 sırt derisinin deri eksplant kültürü modelini kullanarak, plakodlar orta hat boyunca görülebilir. Morfogenetik cephe daha sonra yeni tüy primordia oluşumu ile cilt çevresine doğru yavaş yavaş yanal olarak yayılır. Bu tüy primordiaları, kültürde 2 gün sonra kısa tüy tomurcuklarına ve kültürde 4 gün sonra uzun tüy tomurcuklarına dönüşecektir (Şekil 1).
Deri rekombinasyon kültürleri
Deri rekombinasyonu için, epitel ve mezenşim yeniden birleştirildiğinde, orijinal plakodlar kaybolur. Yeni plakodlar, rekombinasyondan kısa bir süre sonra ortaya çıkacak ve kültürde sırasıyla 2 ve 4 gün sonra kısa tüy tomurcukları ve uzun tüy tomurcukları oluşturmak üzere gelişecektir. Epitel mezenşime göre 90° döndürülürse, uzayan tomurcukların yönü epitel tarafından belirlenecektir (Şekil 2).
Cilt sulandırma kültürleri
Cildin sulandırılması için, ex vivo organ kültürleri önce homojen görünür ve daha sonra kültürde 1 gün sonra eş zamanlı olarak eşit aralıklı dermal yoğunlaşmalar oluşur. Tüy tomurcuklarının sayısının mezenkimal hücrelerin sayısına bağlı olduğuna dikkat edilmelidir. Daha düşük mezenkimal sayılar,11'i oluşturmak için benzer boyutta daha az tomurcuk indükledi. Kültürde 2-3 gün sonra kısa tüy tomurcukları, kültürde ise 4-5 gün sonra uzun tüy tomurcukları oluşacaktır (Şekil 3).
Şekil 4, ex vivo cilt organ kültürü, cilt rekombinasyon organ kültürü ve cilt sulandırma organ kültürünün özet diyagramlarını göstermektedir.
Şekil 1: Ex vivo deri organ kültürü. Evre 32 tavuk embriyo derisi HBSS'de diseke edilir ve 2 ve 4 gün boyunca 6 oyuklu kültür eklerinde (T0, zaman 0'da) kültürlenir. Tüy primordia, kültürde 2 gün sonra kısa tüy tomurcuklarına ve kültürde 4 gün sonra uzun tüy tomurcuklarına dönüşür. Dermal plakodlar beyaz okla gösterilir. Orta hattaki tomurcukların her iki yan taraftakilerden daha olgun olduğuna dikkat edin. Bu yöntem Jiang ve Chuong4'ten değiştirildi. Ölçek çubuğu = 500 μm. Kısaltma: HBSS = Hank'in tamponlu tuzlu su çözeltisi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Ex vivo deri rekombinasyon organ kültürü. Evre 32 tavuk embriyo derisi HBSS'de diseke edildi ve epitel ve mezenkimal 2x CMF tamponunda ayrıldı. Deri epiteli ve mezenşim, rotasyonlu veya rotasyonsuz olarak yeniden birleştirilir ve 2 gün ve 4 gün boyunca kültüre edilir. Yeni plakodlar, kültürde 2 ve 4 gün sonra kısa ve uzun tüy tomurcuklarına dönüşür. Epitel mezenşime göre 90° döndürülürse, yeni tomurcukların yönü epitel12 tarafından belirlenir. Bu yöntem Chuong ve ark.11'den değiştirilmiştir. Ölçek çubuğu = 500 μm. Kısaltma: CMF = kalsiyum-magnezyum içermez. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Ex vivo cilt sulandırma organ kültürü. Evre 32 tavuk embriyo derisi diseke edilir ve epitel ve mezenşim 2x CMF tamponunda ayrılır. Mezenşim,% 0.1 kollajenaz ve tripsin ile tek hücrelere ayrışır ve bir kültür eki üzerinde yüksek hücre yoğunluğunda peletlenir. Dermal hücre peleti, sağlam bir epitel (T0, zaman 0'da) ile yeniden oluşturulur ve 6 saat, 2 gün ve 5 gün boyunca kültürlenir. Eksitler önce homojen görünür (6 saat) ve daha sonra kültürde 1 gün sonra eş zamanlı olarak eşit aralıklı dermal kondasyonlar oluşur. Kısa tüy tomurcukları kültürde 2-3 gün sonra, uzun tüy tomurcukları ise kültürde 4-5 gün sonra oluşacaktır. Bu yöntem Jiang ve ark.13'ten değiştirilmiştir. Ölçek çubuğu = 500 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Ex vivo deri organ kültürü modellerinin diyagramları. Deri, mezenkimal hücreleri kaplayan tek bir epitel tabakası olarak E6.5'te başlar. Bu, üç eksplant yönteminin tepesinde tasvir edilmiştir. (A) Ex vivo cilt organ kültürü. Deri, havadaki bir kültür ekinin üzerine sağlam bir şekilde kaplanır: %5 CO2 ve %95 hava inkübatörde 37 °C'de medya arayüzü. (B) Ex vivo cilt rekombinasyon organ kültürü. Deri epiteli mezenşimden ayrılır ve daha sonra havadaki hücre kültürü ekine kaplamadan önce yeniden birleştirilir: %5 CO2 ve %95 hava inkübatörde 37 °C'de ortam arayüzü. (C) Ex vivo cilt sulandırma organ kültürü. Deri epiteli mezenşimden ayrılır. Mezenkim daha sonra tek hücreli bir süspansiyona ayrışır ve mezenkimal hücreler bir santrifüjde peletlenir. Mezenkimal hücreler daha sonra 2 × 107 hücre / mL ve 10 μL süspansiyon konsantrasyonunda yeniden süspanse edilir, kültür ekine yerleştirilir ve daha sonra sağlam bir epidermis parçası ile kaplanır. Kültür havada inkübe edilir: 37 °C'de %5 CO2 ve %95 hava inkübatörde medya arayüzü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil S1: GFP eksprese eden virüs ile mezenşim hücrelerinin transdüksiyonu. Ayrışmış mezenkimal hücreler (2 × 10,7 hücre/mL), Yeşil Floresan Proteini (GFP) eksprese eden >107 enfeksiyöz birim/mL replikasyona yetkin kuş sarkomu virüsü ile buz üzerinde 3 saat inkübe edildi. Mezenkimal hücreler daha sonra yukarıdaki protokol bölüm 3'te tarif edildiği gibi yeniden yapılandırılmış cilt organ kültürleri oluşturmak için kullanıldı ve 24 saat sonra fotoğraflandı. Veriler, mezenkimal hücrelerin ~% 40'ının GFP ile etiketlendiğini göstermektedir. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Doku rekombinasyonu, epitel ve mezenşimin benzersiz katkılarını keşfetmek için bir test sağlar. Tavuklarda tüyler embriyonik gün 7'de (E7) gelişmeye başlarken, pullar E9'da başlar. E9 skalası mezenşimi, E7 skalası epiteli ile yeniden birleştirildiğinde, yeniden birleşen doku pulcukları oluşturur ve E7 tüy mezenşimi, E9 skalası epitel ile yeniden birleştirildiğinde, tüyler oluşur11. Bu çalışmalar, mezenkimin patern oluşumunu, aralığını ve organ kimliğini kontrol ettiğini göstermiştir. Tabii ki, epitel mezenkimal sinyalleri uygun şekilde alabilmek ve yorumlayabilmek için yetkin olmalıdır. Yetkinlik sadece kısa bir zaman aralığı için epitelde bulunur. Yukarıdaki sonuçların aksine, şaşırtıcı bir şekilde tavuk oral mukozası ve aboral E5 epiteli E8 gövde mezenşimi ile yeniden birleştirildiğinde, aboral epitel tüyler oluşturur; Bununla birlikte, ağız mukozası çok sayıda diş benzeri uzantıoluşturur 15. Bu da deri gövdesi mezenşiminin aboral epiteli tüy yapmaya yönlendirirken, ağız epitelinin tüy yapma yeteneğine sahip olmadığını ve sadece diş yapabildiğini göstermektedir. Bu çalışmada oral epitel zaten E5'te diş oluşturmaya adamış olabilir. İn situ hibridizasyon, RNAscope ve immün boyama, oluşan dokuların kimliğini doğrulamak için rekombine eksplantlarda moleküler ekspresyonu doğrulamak için kullanılabilir. Bu tahlil kullanılarak, bozulmalar özellikle epitel veya mezenşime yönlendirilebilir.
Doku sulandırması, mezenşim içindeki hücreleri işlenmemiş bir duruma sıfırlar. E7-E8 tüy derisi, deri ayrışmadan ve mezenşim tek hücrelere ayrışmadan önce dorsal sistemde mezenkimal yoğunlaşmalar oluşturmaya başlamıştır. İlkel tomurcuk veya intertomurcuk bölgelerindeki epitelyal veya mezenkimal hücreleri etiketleyerek, dermal hücreler önceki konumlarına bakılmaksızın tomurcukların içinde veya dışında bulunabilir. Düşük mezenkimal hücre yoğunluğunda, sulandırılmış deri eksplantları birkaç normal boyutlu tüy tomurcuğu oluşturur. Mezenkimal hücre yoğunluğu arttıkça, maksimum paketleme yoğunluğu elde edilene kadar tomurcuk sayısı artar13. Bu veriler, hücrelerin ilk komşularıyla temas kaybı yoluyla yeniden programlandığını ve yeni bir model oluşumu turuna girdiğini göstermektedir. Bu kültürler ayrıca yoğunlaşmalar ve tüy primordia geliştirir. İlginç bir şekilde, tomurcuklar, cilt eksplantlarında ve rekombine cilt eksplantlarında görülen tomurcuk oluşumunun ilerleyici yayılımının aksine, cilt boyunca aynı anda oluşur. Bu yöntem, erken evre cilt hücresel ve moleküler etkileşimlerinin gözlemlenmesini ve manipüle edilmesini sağlar. Moleküler ekspresyon, promotör-raportör tahlilleri kullanılarak kültürde değerlendirilebilir. Transgenik veya nakavt çizgileri arasındaki sulandırma, cilt şekillendirme sürecinde moleküllerin rollerini daha fazla analiz etmeye yardımcı olabilir. Viral transdüksiyon, ayrışmış mezenkimal hücrelerde artar ve sıklıkla artmış bir pertürbasyona neden olabilir.
Bu deneysel yaklaşımların her biri, araştırmacıların cilt morfogenezi sırasında meydana gelen hücresel ve moleküler olayları keşfetmelerine yardımcı olabilir. Bu yaklaşımların her birini sıklıkla kullanıyoruz ve hangisinin en iyi içgörüleri sağladığını görüyoruz. Bulgular daha sonra diğer kültür koşulları altında veya bozulmamış embriyolar kullanılarak daha fazla araştırılabilir.
Bu yaklaşımların sınırlılıkları
Bu üç tahlilin her biri yüksek oranda tekrarlanabilir sonuçlar sağlar. Bununla birlikte, bu tahliller aynı bozulmaya farklı derecelerde yanıt verebildiğinden, başlangıçta herhangi bir değişiklikle karşılaşılmazsa, üç tahlili de kullanarak koşulları bozmak genellikle faydalı olacaktır. Deri eksplant kültürü, erken cilt paterni oluşumu ve cilt eki gelişimi için iyi bir model sağlasa da, eksplant sadece ~ 1 hafta boyunca kültürlenebilir. Bu, daha sonraki cilt uzantı gelişiminde, örneğin dermal papilla oluşumu ve folikül morfogenezi sürecinde kullanımlarını engeller, ancak bu eksplantları daha uzun süre kültürlemek için prosedürler geliştirilmektedir. Bugüne kadar, sulandırılmış deri eksplantları yapıldıktan sonraki erken zamanlarda, hücreler substratlarına gevşek bir şekilde bağlanır ve bu da in situ hibridizasyon gibi çeşitli yıkamaların kullanıldığı analizleri zorlaştırır. Bu kültürler, substratlarını 24 saat içinde daha sıkı bir şekilde bağlar ve bu noktada kültür boyunca yoğuşmalar oluşur.
Kuş embriyonik derisi, deri eklerinin gelişimini incelemek için mükemmel bir model sağlar. Deri eksplant kültürleri, ex vivo deri organ kültürlerinin büyüdüğü kültür koşullarının manipülasyonunu sağlama avantajına sahiptir. Ayrıca, tomurcukların zaman içinde orta hattan yan kenarlara yayılmasını görmek için gelişimin uzun vadeli hızlandırılmış görüntülemesini sağlar. Ek olarak, kültür, tüy desenleme ve büyümedeki farklı olayları keşfetmek için farklı embriyonik aşamalar kullanılarak başlatılabilir. Periyodik patern oluşumu için cilt E6'dan başlayarak kültürlenebilir ve 4 gün boyunca kültürlenebilir. Tüy folikülü morfogenezi için, kültür E8'de başlatılabilir ve 4 gün boyunca kültürlenebilir. E6'dan önceki aşamalarda cildi incelemek zordur. Eksplant kültürleri ile, cilt eksplant kültür ortamına büyüme faktörleri veya inhibitörler eklenerek global pertürbasyonlar yapılabilir 8,16,17. Cildin lokal olarak bozulması, cilt eksplantına protein kaplı boncuklar yerleştirilerek veya gen ekspresyonunu modüle etmek için hücrelerin viral olarak dönüştürülmesiyleelde edilebilir 8,16,17. Eksplant kültürleri, kalsiyum aktiviteleri6 gibi kolektif hücre davranışının görüntülenmesini ve doku gerilimi18 veya elektrik akımları12 gibi biyofiziksel kuvvetlerin uygulanmasını kolaylaştırır. Bu yöntemler, periyodik organ paternini düzenleyen faktörler hakkında yeni bilgiler sağlamak için harika fırsatlar sunar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların beyan edebilecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma NIH NIAMS hibesi R37 AR 060306, R01 AR 047364 ve RO1 AR078050 tarafından desteklenmektedir. Çalışma aynı zamanda USC ile Tayvan'daki Çin Tıp Üniversitesi arasında ortak bir araştırma sözleşmesi ile de destekleniyor. USC BISC 480 Gelişimsel Biyoloji 2023 sınıfına, bu kuş deri kültürü protokolünü çeşitli laboratuvar modülleri sırasında başarıyla test ettikleri için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well culture dish | Falcon | REF 353502 | Air-Liquid Interface (ALI) Cultures |
| Cell culture inset | Falcon | REF 353090. | 0.4 µm Transparent PET Membrane |
| Collagenase Type 1 | Worthington Biochemical | LS004196 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium | Corning | 10-013-CV | 4.5 g/L glucose |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher | 16140-071 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Hanks’s buffered saline solution | Gibco | 14170-112 | No calcium, no magnesium |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15-140-122 | |
| Pogassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5379 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Sodium chloride (Nacl) | EMD | CAS 7647-14-5 | |
| Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) | Sigma-Aldrich | S0751 | |
| Trypsin | Gibco | 27250-042 |
References
- Lucas, A. M., Stettenheim, P. R. Avian anatomy: Integument part I and part II. Agriculture Handbook. 362, Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture, Washington D.C.. (1972).
- Sengel, P. In Morphogenesis of Skin, l-277. , Cambridge Univ. Press. New York. (1976).
- Dhouailly, D., Wilehm Roux, Formation of cutaneous appendages in dermo-epidermal recombinations between reptiles, birds and mammals. Archives of Developmental Biology. 177 (4), 323-340 (1975).
- Jiang, T. -X., Chuong, C. -M. Mechanism of feather morphogenesis: I. Analyses with antibodies to Adhesion Molecules Tenascin, N-CAM and Integrin. Developmental Biology. 150 (1), 82-98 (1992).
- Li, A., et al. Shaping organs by a Wnt / Notch / non-muscle myosin module which orients feather bud elongation. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 110 (16), E1452-E1461 (2013).
- Li, A., et al. Calcium oscillations coordinate feather mesenchymal cell movement by SHH dependent modulation of gap junction networks. Nature Communications. 9 (1), 5377 (2018).
- Ting-Berreth, S. A., Chuong, C. M. Local delivery of TGF beta2 can restore epithelium dependent organization of mesenchymal condensation during skin appendage morphogenesis. Developmental Biology. 179 (2), 347-359 (1996).
- Widelitz, R. B., Jiang, T. -X., Noveen, A., Chen, C. -W. J., Chuong, C. -M. FGF induces new feather buds from developing avian skin. Journal of Investigation Dermatology. 107 (6), 797-803 (1996).
- Rawles, M. E. Tissue interactions in scale and feather development as studies in dermal-epidermal recombinations. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 11, 765-789 (1963).
- McAleese, S. R., Sawyer, R. H. Correcting the phenotype of the epidermis from chick embryos homozygous for the gene scaleless (sc/sc). Science. 214 (4524), 1033-1034 (1981).
- Chuong, C. M., Widelitz, R. B., Ting-Berreth, S., Jiang, T. X. Early events during avian skin appendage regeneration: dependence on epithelial-mesenchymal interaction and order of molecular reappearance. J Invest Dermatol. 107 (4), 639-646 (1996).
- Jiang, T. X., et al. Global feather orientations changed by electric current. iScience. 24 (6), 102671 (2021).
- Jiang, T. X., Jung, H. S., Widelitz, R. B., Chuong, C. M. Self-organization of periodic patterns by dissociated feather mesenchymal cells and the regulation of size, number and spacing of primordia. Development. 126 (22), 4997-5009 (1999).
- Hamburger, V., Hamilton, H. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 188, 49-92 (1951).
- Chen, Y. P., et al. Conservation of early odontogenic signaling pathway in Aves. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 97 (18), 10044-10049 (2000).
- Chuong, C. -M., Ting, S. A., Widelitz, R. B., Lee, Y. S. Mechanism of Skin Morphogenesis: II. Retinoic acid gradient modulates axis orientation and phenotypes of skin appendages. Development. 115 (3), 839-852 (1992).
- Noveen, A., Jiang, T. -X., Chuong, C. -M. Protein kinase A and protein kinase C modulators have reciprocal effects on mesenchymal condensation during skin appendage morphogenesis. Developmental Biology. 171 (2), 677-693 (1995).
- Wu, X. S., et al. Self-assembly of biological networks via adaptive patterning revealed by avian intradermal muscle network formation. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 116 (22), 10858-10867 (2019).
