Summary
Hier beschrijven we protocollen voor drie soorten vogelembryonale huidexplantatieculturen die kunnen worden gebruikt om weefselinteracties te onderzoeken, 4D-beeldvorming timelapse-film (3D plus tijd), globale of lokale verstoring van de moleculaire functie en karakterisering van systeembiologie.
Abstract
De zich ontwikkelende vogelhuid tijdens de embryogenese is een uniek model dat waardevolle inzichten kan verschaffen in weefselpatronen. Hier worden drie variaties op huidexplantatieculturen beschreven om verschillende aspecten van huidontwikkeling te onderzoeken. Ten eerste bieden ex vivo orgaanculturen en manipulaties onderzoekers de mogelijkheid om de ontwikkeling van verenknoppen direct te observeren en te bestuderen. De explantatiecultuur van de huid kan 7 dagen groeien, waardoor tijdens deze groeiperiode directe analyse van cellulair gedrag en 4D-beeldvorming met tussenpozen mogelijk is. Dit maakt ook fysieke en moleculaire manipulaties van kweekomstandigheden mogelijk om de weefselrespons te visualiseren. Groeifactorgecoate kralen kunnen bijvoorbeeld lokaal worden aangebracht om veranderingen in verenpatronen in een beperkt gebied te veroorzaken. Als alternatief kan virale transductie wereldwijd worden toegediend in de kweekmedia om de genexpressie op of neer te reguleren. Ten tweede stelt het huidrecombinatieprotocol onderzoekers in staat om weefselinteracties tussen de epidermis en het mesenchym te onderzoeken die zijn afgeleid van verschillende huidregio's, verschillende levensfasen of verschillende soorten. Dit biedt de mogelijkheid om het tijdvenster te testen waarin het epitheel in staat is om op signalen te reageren en het vermogen om verschillende huidaanhechtingen te vormen als reactie op signalen van verschillende mesenchymale bronnen. Ten derde reset huidreconstitutie met behulp van gedissocieerde huidcellen bedekt met intact epitheel de huidontwikkeling en maakt het de studie van de eerste processen van periodieke patroonvorming mogelijk. Deze aanpak verbetert ook ons vermogen om genexpressie tussen de gedissocieerde cellen te manipuleren voordat de gereconstitueerde huidexplantatie wordt gecreëerd. Dit artikel biedt de drie cultuurprotocollen en voorbeeldexperimenten om hun nut aan te tonen.
Introduction
De ontwikkeling van de huid van vogelembryo's is een uitstekend model voor het bestuderen van de mechanismen van morfogenese vanwege de duidelijke patronen en de toegankelijkheid tot microchirurgie en manipulatie 1,2. Het evalueren van cellulaire en moleculaire gebeurtenissen in intacte weefsels kan echter moeilijk zijn, omdat de aanwezigheid van externe weefsels microscopische waarnemingen kan bemoeilijken. Bovendien is het vermogen om genexpressie te manipuleren om hun rol in huidmorfogenese te testen niet altijd een eenvoudige taak. We ontdekken dat we genfuncties kunnen testen met behulp van retrovirale transductie met een hoger slagingspercentage met behulp van huidexplantatiemodellen. Hier bespreken we de voordelen van drie huidexplantatiemodellen die zijn ontwikkeld.
Aviaire embryonale huidcultuur is een krachtig systeem om celgedrag, genregulatie en functie tijdens de ontwikkeling van huidverenknoppen te beoordelen 3,4,5,6. Het maakt de evaluatie mogelijk van de moleculaire mechanismen van de ontwikkeling van verenknoppen door de wereldwijde toevoeging van groeifactoren die in de kweekmedia zijn geplaatst of hun lokale afgifte van met groeifactor gecoate kralen. Ontwikkelingsregulerende genen kunnen ook worden gemanipuleerd met behulp van virale gentransductie van intacte of dominante negatieve vormen voor functionele studies die hun rol in specifieke morfogenetische gebeurtenissen evalueren 7,8.
Aviaire epitheliale-mesenchymale recombinatiecultuur stelt onderzoekers in staat om de bijdragen van elke huidcomponent tijdens de vroege stadia van huidmorfogenese te bepalen. Rawles' gebruik van deze benadering toonde aan dat interacties tussen het mesenchym en het epitheel essentieel zijn voor de vorming van huidaanhechtingen9. Het mesenchym kan condensaties vormen en het epitheel is nodig om mesenchymale condensatieformaties te induceren en in stand te houden2. Later werd deze benadering gebruikt om te beoordelen waarom schaalloze kippen geen veren vormen. Het defect bleek zich in mesenchym10 te bevinden. Dhouailly voerde weefselepitheel-mesenchymale recombinatiestudies uit bij embryo's van verschillende soorten. Deze studies leverden ontwikkelings- en evolutionaire inzichten op in epitheel-mesenchymale communicatie die huidmorfogenese bevordert3.
Deze studie werd gebruikt om beter inzicht te krijgen in factoren die de groei van veren beheersen. De methode verbetert ook de visualisatie van cellulaire en moleculaire gebeurtenissen die betrokken zijn bij huidpatronen die plaatsvinden tijdens het initiëren, ontwikkelen en verlengen van veren langs de voorste-achterste as. Wanneer het epitheel wordt gescheiden van het mesenchym en de twee componenten vervolgens opnieuw worden gecombineerd, herstellen nieuwe interacties het huidpatroon. Deze benadering stelt ons in staat om mesenchymale inducerende signalen en epitheliale competentiemoleculen te evalueren die de epidermis in staat stellen te reageren op de mesenchymale signalen11. De daaropvolgende stroomafwaartse moleculaire expressie die nodig is voor de ontwikkeling van veerknoppen en patroonvorming kan ook worden onderzocht. Deze studies hebben aangetoond dat de locatie van knoppen wordt gecontroleerd door het mesenchym. Rotatie van het epitheel 90o vóór recombinatie met het mesenchym toont aan dat de richting van de verlenging van de veerknop wordt gecontroleerd door het epitheel. Deze methode was essentieel voor ons om het moleculaire mechanisme te bestuderen dat de oriëntatie van de veerknop reguleert12.
Aviaire huidreconstitutiecultuur, waarbij het huidmesenchym wordt gedissocieerd tot enkele cellen voordat het met hoge celdichtheid wordt bekleed en bedekt met intact epitheel, reset huidcellen naar een primordiale toestand. De explantatie organiseert zichzelf vervolgens om een nieuw periodiek patroon te vormen, onafhankelijk van de vorige signalen13. Dit huidreconstitutiemodel kan worden gebruikt om de initiële processen van periodieke patronen van veren te bestuderen. We gebruikten deze benadering om te onderzoeken hoe het moduleren van de verhouding tussen mesenchymale cellen en een enkel stuk epitheel de grootte of het aantal veerknoppen kan beïnvloeden. Het aantal knoppen bleek toe te nemen, maar niet de grootte van de knoppen omdat de verhouding van mesenchymale cellen toenam. Een ander voordeel van deze aanpak is dat virale transductie van mesenchymale cellen een hogere efficiëntie vertoont dan in de andere twee kweekomstandigheden en meer voor de hand liggende fenotypes kan produceren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Explantatiecultuur van kippenhuid (figuur 1)
- Broed bevruchte kippeneieren uit in een bevochtigde broedmachine bij 38 °C en voer ze op volgens Hamburger en Hamilton14.
- In stadium 28 (~E5.5) zijn de tweede teen en de derde teen van de ledemaat langer dan de andere; Drie cijfers en vier tenen zijn verschillend.
- In stadium 29 (~E6) wordt de vleugel bij de elleboog gebogen; Het tweede cijfer is duidelijk langer dan de andere.
- In stadium 30 (~E6.5) zijn twee rijen dorsale veerknoppen aan weerszijden van het ruggenmerg zichtbaar ter hoogte van de armmantel en drie rijen ter hoogte van de benen.
- In stadium 31 (~E7) zijn er ~7 rijen veren op jumbo-sacraal niveau.
- In stadium 32 zijn elf of meer rijen verenknoppen aanwezig ter hoogte van de poten.
- Plaats een stadium 28-32 kippenembryo in een petrischaaltje van 60 mm met Hanks's gebufferde zoutoplossing (HBSS) of fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
- Ontleed de dorsale huid van het embryo tussen de onderste nek en het staartgebied. Gebruik een schaar om het hoofd uit de nek te verwijderen. Trek voorzichtig aan de knoppen van de ledematen om de ventrale zijde van het lichaam naar beneden te positioneren, waarbij de aanhangsels zich naar buiten spreiden.
- Maak een anterieure tot posterieure incisie in de huid langs de twee flankerende zijden van het embryolichaam met behulp van een horlogemakertang of een scherpe veerschaar. Zorg ervoor dat u het lichaam stabiliseert met een tang door de ledemaatknoppen in de lengterichting samen te knijpen. Trek de huid voorzichtig van de nek naar de staart of van de staart naar de nek met behulp van een pincet van de horlogemaker.
- Verwijder voorzichtig de onderhuidse weefsels die aan de gepelde huid vastzitten en strijk de randen van de huid glad met de scherpe veerschaar.
- Voeg 2 ml/putje Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en penicilline/streptomycine-oplossing (verdund 1:100) toe aan een putje in een schaaltje met 6 putjes. Zodra het medium en de antibiotica zijn toegevoegd, plaatst u een steriel weefselkweekinzetstuk in het putje, zodat het medium zich aan de buitenkant van het kweekinzetstuk bevindt.
- Breng de huid met een spatel over op het kweekinzetstuk met de epidermis naar boven en het mesenchym naar beneden op het insteekmembraan. Om ervoor te zorgen dat de huid plat en zonder kreukels ligt, trekt u de huid op de spatel in HBSS. Schuif de huid van de spatel met de vloeistof om de overdracht van de huid te vergemakkelijken zonder te vouwen.
- Verwijder overtollig HBSS van het kweekinzetstuk met een pipet van 200 μl. Laat een dunne laag HBSS in het kweekinzetstuk om de explantatie semi-nat te houden om een lucht-vloeistofinterface te bieden.
- Incubeer de huidexplantatieculturen bij 37 °C met 5% CO2 en 95% lucht. Vervang het medium elke 2 dagen.
OPMERKING: Deze procedure is gepubliceerd4. Dit kweeksysteem kan ook worden gebruikt met de huid van andere vogels, zoals explantculturen van kwartels of vinken.
2. Epitheliale-mesenchymale recombinatie van kippenhuid (figuur 2)
- Bevruchte kippeneieren uitbroeden in een bevochtigde broedmachine bij 38 °C en de embryo's in scène zetten volgens Hamburger en Hamilton14 (paragraaf 1.1).
- Bereid 2x calcium-magnesiumvrije (CMF) zoutoplossing met 0,25% ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) buffer.
- Maak 10x CMF-buffer (NaCl (1,37 M) 80 g, KCl (0,04 M) 3 g, NaH2PO4 (0,004 M) 0,5 g, KH2PO4 (2 M) 0,25 g, NaHCO3 (0,12 M) 10 g, glucose (0,1 M) 20 g in 1.000 ml gedestilleerd water. Pas de pH aan naar 7,3. Om 100 ml 2x CMF met 0,25% EDTA-buffer te maken, moet de EDTA eerst worden opgelost in 80 ml gedestilleerd water en vervolgens 20 ml 10x CMF-buffer toevoegen om 2x CMF te maken met 0,25% EDTA-werkoplossing.
- Ontleed de dorsale huiden van kippenembryo's in stadium 30-32 in HBSS zoals hierboven beschreven (sectie 1.2) en broed ze uit in 2x CMF-zoutoplossing met 0,25% EDTA op ijs gedurende 15-20 minuten.
- Scheid het epitheel en het mesenchym voorzichtig met behulp van een pincet van de horlogemaker. Breng het gescheiden epitheel en mesenchym over in een schone schaal met HBSS.
- Recombineer het epitheel met het mesenchym door het mesenchym eerst op een petrischaaltje met HBSS te plaatsen en vervolgens het epitheel op het mesenchym te plaatsen. Plaats het epitheel langs dezelfde voorste-achterste as als het mesenchym of draai het epitheel 90o van de voorste-achterste as van het mesenchym om te bepalen welke component de verschillende aspecten van de morfogenese van de huid reguleert.
- Breng de gerecombineerde huiden over naar kweekinzetstukken in 6-wells kweekschalen voor groei en verwijder overtollige HBSS rond de gerecombineerde huid.
- Plaats 2 ml DMEM-kweekmedium met 10% FBS in het putje buiten de inzet. Plaats een dunne laag DMEM in de insteekkamer om de explantatie semi-nat te houden en een lucht-vloeistofinterface te bieden.
- Incubeer de huidrecombinanten bij 37 °C in een mengsel van 5% CO2 en 95% lucht. Vervang het medium elke 2 dagen. Documenteer fenotypische veranderingen in de eerste huidfasen van de huidontwikkeling met behulp van time-lapse-fotografie met een camera die op een ontleedmicroscoop is gemonteerd.
OPMERKING: Deze procedure is gepubliceerd11.
3. Reconstitutie van kippenvel (figuur 3)
- Bevruchte kippeneieren uitbroeden in een bevochtigde broedmachine bij 38 °C en de embryo's in scène zetten volgens Hamburger en Hamilton14 (paragraaf 1.1).
- Ontleed stadium 30-33 kippenembryo dorsale huiden in HBSS. Incubeer de schillen in 2x CMF-zoutoplossing met 0,25% EDTA op ijs gedurende 15-20 minuten zoals hierboven beschreven (sectie 2.3).
- Scheid het epitheel en het mesenchym voorzichtig met behulp van een pincet van de horlogemaker. Breng het gescheiden epitheel en mesenchym over naar HBSS op ijs.
OPMERKING: Pas op dat u de basale laag van het epitheel niet beschadigt bij het scheiden van het epitheel van het mesenchym. - Verzamel het afgescheiden mesenchym in een centrifugebuis van 15 ml en incubeer met 0,1% collagenase/trypsine-oplossing gemaakt in PBS in een waterbad van 37 °C gedurende 10-15 minuten.
- Dissocieer het huidmesenchym met een Pasteur-pipet om een eencellige suspensie te maken. Voeg DMEM met 10% FBS toe om de vertering te stoppen.
- Pelleteer en centrifugeer de cellen bij 233 × g gedurende 5 minuten. De cellen worden geresuspendeerd met kweekmedium in een concentratie van 2 × 107 cellen/ml.
OPMERKING: Bij deze stap kunnen de mesenchymale cellen ook gedurende 2-3 uur op ijs worden geresuspendeerd in virusbevattend medium voor gentransductie. - Plaats een celcultuurinzetstuk in een kuiltje van een schaaltje met 6 putjes. Druppel 10 μL van 2 × 107 cellen/ml mesenchymale cellen op het weefselkweekinsert. Plaats 2 ml DMEM-kweekmedium met 10% FBS in het putje buiten de inzet. Incubeer de uitgeklede mesenchymale cellen bij 37 °C met behulp van een 5% CO2 en 95% luchtincubator gedurende 1 uur om de cellen op het insertmembraan te laten nestelen.
- Breng het intacte epitheel over op de geplateerde mesenchymale druppel met de basale cellaag van het epitheel naar de mesenchymale cellen gericht met behulp van een pipet van 1 ml.
OPMERKING: Bij het overbrengen van epitheel naar de mesenchymale druppel mogen de mesenchymale cellen niet worden verstoord. - Druk het intacte epitheel plat over het mesenchym om de gereconstitueerde huid te laten explanteren. Laat een dunne laag van het medium op het inzetstuk liggen om de gereconstitueerde huid semi-nat te houden om een lucht-vloeistofinterface te creëren. Incubeer de gereconstitueerde huid bij 37 °C in een 5% CO2 en 95% luchtincubator. Vervang het medium elke 2 dagen.
OPMERKING: Deze procedure is gepubliceerd13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Huid explantatie culturen
De ontwikkeling van veerknoppen uit ex vivo huidorgaanculturen kan direct onder de microscoop worden waargenomen. Met behulp van het huidexplantatiecultuurmodel van de dorsale huid van kippen stadium 30 zijn de placodes zichtbaar langs de middellijn. Het morfogenetische front plant zich dan geleidelijk lateraal voort in de richting van de huidperiferie met de vorming van nieuwe veerprimordia. Deze verenprimordia zullen zich na 2 dagen in cultuur ontwikkelen tot korte veerknoppen en na 4 dagen in cultuur tot lange veerknoppen (Figuur 1).
Recombinatieculturen van de huid
Voor huidrecombinatie, wanneer epitheel en mesenchym worden gerecombineerd, verdwijnen de oorspronkelijke placodes. Nieuwe placodes verschijnen kort na recombinatie en ontwikkelen zich na respectievelijk 2 en 4 dagen in cultuur tot korte veerknoppen en lange veerknoppen. Als het epitheel 90° wordt gedraaid ten opzichte van het mesenchym, wordt de oriëntatie van de langwerpige knoppen bepaald door het epitheel (Figuur 2).
Culturen voor huidreconstitutie
Voor huidreconstitutie lijken de ex vivo orgaanculturen in eerste instantie homogeen, en vervolgens vormen zich na 1 dag in cultuur tegelijkertijd dermale condensaties met gelijkmatige afstand. Opgemerkt moet worden dat het aantal veerknoppen afhankelijk is van het aantal mesenchymale cellen. Lagere mesenchymale aantallen zorgden ervoor dat er minder knoppen van vergelijkbare grootte ontstonden om11 te vormen. Korte verenknoppen vormen zich na 2-3 dagen in cultuur en lange veerknoppen vormen zich na 4-5 dagen in cultuur (Figuur 3).
Figuur 4 toont samenvattende diagrammen van ex vivo huidorgaancultuur, huidrecombinatie-orgaancultuur en huidreconstitutie-orgaancultuur.
Figuur 1: Ex vivo huidorgaancultuur. De huid van kippenembryo's in stadium 32 wordt ontleed in HBSS en gedurende 2 en 4 dagen gekweekt in kweekinserts met 6 putjes (T0, op tijdstip 0). De veerprimordia ontwikkelen zich na 2 dagen in cultuur tot korte veerknoppen en na 4 dagen in cultuur tot lange veerknoppen. Dermale placodes worden aangegeven met de witte pijl. Merk op dat de knoppen in de middellijn rijper zijn dan die aan beide zijkanten. Deze methode is aangepast ten opzichte van Jiang en Chuong4. Schaal balk = 500 μm. Afkorting: HBSS = Hank's gebufferde zoutoplossing. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Ex vivo huidrecombinatie-orgaancultuur. De huid van kippenembryo's in stadium 32 wordt ontleed in HBSS en epitheel en mesenchymaal worden gescheiden in 2x CMF-buffer. Huidepitheel en mesenchym worden met of zonder rotatie gerecombineerd en gedurende 2 dagen en 4 dagen gekweekt. De nieuwe placodes ontwikkelen zich na 2 en 4 dagen in cultuur tot korte en lange veerknoppen. Als het epitheel 90° wordt gedraaid ten opzichte van het mesenchym, wordt de oriëntatie van de nieuwe knoppen bepaald door het epitheel12. Deze methode is aangepast van Chuong et al.11. Schaal balk = 500 μm. Afkorting: CMF = calcium-magnesiumvrij. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Ex vivo huidreconstitutie, orgaancultuur. De huid van kippenembryo's in stadium 32 wordt ontleed en epitheel en mesenchym worden gescheiden in 2x CMF-buffer. Het mesenchym wordt gedissocieerd in afzonderlijke cellen door 0,1% collagenase en trypsine en gepelleteerd met hoge celdichtheid op een kweekinzetstuk. De dermale celpellet wordt gereconstitueerd met een intact epitheel (T0, op tijdstip 0) en gekweekt gedurende 6 uur, 2 dagen en 5 dagen. De explantaten lijken eerst homogeen (6 uur) en dan vormen zich na 1 dag in cultuur tegelijkertijd dermale condensaties met gelijkmatige afstand. Korte verenknoppen vormen zich na 2-3 dagen in cultuur en lange veerknoppen vormen zich na 4-5 dagen in cultuur. Deze methode is aangepast van Jiang et al.13. Schaalbalk = 500 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Diagrammen van ex vivo huidorgaancultuurmodellen. De huid begint bij E6.5 als een enkele laag epitheel die mesenchymale cellen bedekt. Dit is afgebeeld aan de bovenkant van de drie explantatiemethoden. (A) Ex vivo huidorgaancultuur. De huid wordt intact geplateerd op een kweekinzetstuk in de lucht: media-interface bij 37 °C in een 5% CO2 en 95% luchtincubator. (B) Ex vivo huidrecombinatie-orgaancultuur. Het huidepitheel wordt gescheiden van het mesenchym en vervolgens opnieuw gecombineerd voordat het op het celcultuurinzetstuk in de lucht wordt geplaatst: media-interface bij 37 °C in een 5% CO2 - en 95% -luchtincubator. (C) Ex vivo huidreconstitutie, orgaancultuur. Huidepitheel wordt gescheiden van het mesenchym. Het mesenchym wordt vervolgens gedissocieerd in een eencellige suspensie en de mesenchymale cellen worden gepelleteerd in een centrifuge. De mesenchymale cellen worden vervolgens geresuspendeerd in een concentratie van 2 × 10,7 cellen/ml en 10 μL van de suspensie, op het kweekinzetstuk geplaatst en vervolgens bedekt met een intact stuk epidermis. De cultuur wordt in de lucht geïncubeerd: media-interface bij 37 °C in een 5% CO2 - en 95% -luchtincubator. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende figuur S1: Transductie van mesenchymcellen met GFP-expressie virus. Gedissocieerde mesenchymale cellen (2 × 107 cellen/ml) werden gedurende 3 uur op ijs geïncubeerd met >107 infectieuze eenheden/ml replicatiecompetent vogelsarcoomvirus dat groen fluorescerend eiwit (GFP) tot expressie bracht. De mesenchymale cellen werden vervolgens gebruikt om gereconstitueerde huidorgaanculturen te vormen, zoals beschreven in protocolsectie 3 hierboven, en 24 uur later gefotografeerd. De gegevens tonen aan dat ~40% van de mesenchymale cellen werden gelabeld met GFP. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Weefselrecombinatie biedt een test om de unieke bijdragen van het epitheel en mesenchym te onderzoeken. Bij kippen beginnen de veren zich te ontwikkelen op embryonale dag 7 (E7), terwijl de schubben beginnen bij E9. Wanneer E9-schaalmesenchym wordt gerecombineerd met E7-verenepitheel, vormt het gerecombineerde weefsel schubben en wanneer E7-veermesenchym wordt gerecombineerd met E9-schaalepitheelveren worden gevormd11. Deze studies hebben aangetoond dat het mesenchym de patroonvorming, afstand tussen de organen en de identiteit van het orgaan controleert. Natuurlijk moet het epitheel bekwaam zijn om de mesenchymale signalen op de juiste manier te kunnen ontvangen en interpreteren. Competentie bestaat slechts gedurende een kort tijdsinterval in het epitheel. In tegenstelling tot de bovenstaande resultaten, vormt verrassend genoeg wanneer het mondslijmvlies van de kip en het aborale E5-epitheel worden gerecombineerd met het E8-stammesenchym, het aborale epitheel veren; Het mondslijmvlies vormt echter meerdere tandachtige aanhangsels15. Dit toont aan dat terwijl het mesenchym van de huidromp het aborale epitheel aanstuurt om veren te maken, het orale epitheel niet het vermogen heeft om veren te maken en alleen tanden kan maken. Oraal epitheel in deze studie is mogelijk al toegewijd aan het vormen van tanden bij E5. In situ hybridisatie, RNAscope en immunokleuring kunnen worden gebruikt om moleculaire expressie in de gerecombineerde explantaten te bevestigen om de identiteit van gevormde weefsels te verifiëren. Met behulp van deze test kunnen verstoringen specifiek naar het epitheel of mesenchym worden gericht.
Weefselreconstitutie reset cellen in het mesenchym naar een niet-toegewijde toestand. De E7-E8-verenhuid is begonnen met het vormen van mesenchymale condensaties in het dorsale kanaal voordat de huid wordt gedissocieerd en het mesenchym wordt gedissocieerd tot enkele cellen. Door epitheel- of mesenchymale cellen in de primordiale knop- of interknopgebieden te labelen, kunnen de huidcellen binnen of buiten knoppen worden gevonden, ongeacht hun eerdere locatie. Bij een lage mesenchymale celdichtheid vormen de gereconstitueerde huidexplantaten weinig veerknoppen van normale grootte. Naarmate de mesenchymale celdichtheid toeneemt, neemt het aantal knoppen toe totdat een maximale verpakkingsdichtheid is bereikt13. Deze gegevens geven aan dat de cellen worden geherprogrammeerd door verlies van contact met hun oorspronkelijke buren en een nieuwe ronde van patroonvorming ondergaan. Deze culturen ontwikkelen ook condensaties en verenprimordia. Interessant is dat knoppen zich tegelijkertijd over de huid vormen, in tegenstelling tot de progressieve voortplanting van knopvorming die wordt gezien bij huidexplantaten en gerecombineerde huidexplantaten. Deze methode maakt het mogelijk om cellulaire en moleculaire interacties van de huid in een vroeg stadium te observeren en te manipuleren. Moleculaire expressie kan in cultuur worden beoordeeld met behulp van promotor-reporter-assays. Reconstitutie tussen transgene of knock-out lijnen kan helpen om de rol van moleculen in het huidpatroonproces verder te analyseren. Virale transductie wordt versterkt in de gedissocieerde mesenchymale cellen en kan vaak een verhoogde verstoring veroorzaken.
Hoewel elk van deze experimentele benaderingen onderzoekers kan helpen bij het onderzoeken van cellulaire en moleculaire gebeurtenissen die plaatsvinden tijdens de morfogenese van de huid. We gebruiken elk van deze benaderingen vaak en kijken welke de beste inzichten geeft. Bevindingen kunnen dan verder worden onderzocht onder andere kweekomstandigheden of met behulp van intacte embryo's.
Beperkingen van deze benaderingen
Elk van deze drie testen levert zeer reproduceerbare resultaten op. Omdat deze tests echter in verschillende mate op dezelfde verstoring kunnen reageren, is het vaak de moeite waard om de omstandigheden te verstoren met behulp van alle drie de tests als er in eerste instantie geen veranderingen worden aangetroffen. Hoewel de huidexplantatiecultuur een goed model biedt voor vroege huidpatroonvorming en de ontwikkeling van huidaanhechtingen, kan de explantatie slechts ~1 week worden gekweekt. Dit sluit het gebruik ervan uit bij de latere ontwikkeling van huidaanhangsels, bijvoorbeeld het proces voor de vorming van dermale papillen en follikelmorfogenese, hoewel de procedures worden verbeterd om deze explantaten langer te kweken. Tot op heden zijn de cellen in de vroege tijden na het maken van gereconstitueerde huidexplantaten losjes gehecht aan hun substraten, waardoor analyses die verschillende wasbeurten gebruiken, zoals in situ hybridisatie, moeilijk zijn. Deze culturen binden hun substraten steviger na 24 uur, waarbij zich condensaties hebben gevormd door de hele cultuur.
Aviaire embryonale huid biedt een uitstekend model om de ontwikkeling van huidaanhechtingen te bestuderen. Huidexplantatieculturen hebben het voordeel dat ze de cultuuromstandigheden waarin de ex vivo huidorgaanculturen groeien, kunnen manipuleren. Het maakt ook langdurige time-lapse-beeldvorming van de ontwikkeling mogelijk om de voortplanting van knoppen van de middellijn naar de zijranden in de loop van de tijd te zien. Bovendien kan de cultuur worden gestart met behulp van verschillende embryonale stadia om verschillende gebeurtenissen in verenpatronen en groei te onderzoeken. Voor periodieke patroonvorming kan de huid vanaf E6 worden gekweekt en gedurende 4 dagen worden gekweekt. Voor morfogenese van veerfollikels kan de kweek worden gestart bij E8 en gedurende 4 dagen worden gekweekt. Het is moeilijk om de huid te ontleden in stadia voorafgaand aan E6. Bij explantatieculturen kunnen globale verstoringen worden gemaakt door groeifactoren of remmers toe te voegen aan het huidexplantatiecultuurmedium 8,16,17. Het plaatselijk verstoren van de huid kan worden bereikt door eiwitgecoate kralen op de huidexplantatie te plaatsen of door cellen viraal te transduceren om genexpressie te moduleren 8,16,17. Explantatieculturen vergemakkelijken de beeldvorming van collectief celgedrag zoals calciumactiviteiten6 en de toepassing van biofysische krachten zoals weefselspanning18 of elektrische stromen12. Deze methoden bieden grote mogelijkheden om nieuwe inzichten te geven in de factoren die periodieke orgaanpatronen reguleren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.
Acknowledgments
Dit werk wordt ondersteund door NIH NIAMS-subsidie R37 AR 060306, R01 AR 047364 en RO1 AR078050. Het werk wordt ook ondersteund door een samenwerkingsverband voor onderzoek tussen USC en China Medical University in Taiwan. We bedanken de USC BISC 480 Developmental Biology 2023-klas voor het succesvol testen van dit vogelhuidkweekprotocol tijdens verschillende laboratoriummodules.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well culture dish | Falcon | REF 353502 | Air-Liquid Interface (ALI) Cultures |
| Cell culture inset | Falcon | REF 353090. | 0.4 µm Transparent PET Membrane |
| Collagenase Type 1 | Worthington Biochemical | LS004196 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium | Corning | 10-013-CV | 4.5 g/L glucose |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher | 16140-071 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Hanks’s buffered saline solution | Gibco | 14170-112 | No calcium, no magnesium |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15-140-122 | |
| Pogassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5379 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Sodium chloride (Nacl) | EMD | CAS 7647-14-5 | |
| Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) | Sigma-Aldrich | S0751 | |
| Trypsin | Gibco | 27250-042 |
References
- Lucas, A. M., Stettenheim, P. R. Avian anatomy: Integument part I and part II. Agriculture Handbook. 362, Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture, Washington D.C.. (1972).
- Sengel, P. In Morphogenesis of Skin, l-277. , Cambridge Univ. Press. New York. (1976).
- Dhouailly, D., Wilehm Roux, Formation of cutaneous appendages in dermo-epidermal recombinations between reptiles, birds and mammals. Archives of Developmental Biology. 177 (4), 323-340 (1975).
- Jiang, T. -X., Chuong, C. -M. Mechanism of feather morphogenesis: I. Analyses with antibodies to Adhesion Molecules Tenascin, N-CAM and Integrin. Developmental Biology. 150 (1), 82-98 (1992).
- Li, A., et al. Shaping organs by a Wnt / Notch / non-muscle myosin module which orients feather bud elongation. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 110 (16), E1452-E1461 (2013).
- Li, A., et al. Calcium oscillations coordinate feather mesenchymal cell movement by SHH dependent modulation of gap junction networks. Nature Communications. 9 (1), 5377 (2018).
- Ting-Berreth, S. A., Chuong, C. M. Local delivery of TGF beta2 can restore epithelium dependent organization of mesenchymal condensation during skin appendage morphogenesis. Developmental Biology. 179 (2), 347-359 (1996).
- Widelitz, R. B., Jiang, T. -X., Noveen, A., Chen, C. -W. J., Chuong, C. -M. FGF induces new feather buds from developing avian skin. Journal of Investigation Dermatology. 107 (6), 797-803 (1996).
- Rawles, M. E. Tissue interactions in scale and feather development as studies in dermal-epidermal recombinations. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 11, 765-789 (1963).
- McAleese, S. R., Sawyer, R. H. Correcting the phenotype of the epidermis from chick embryos homozygous for the gene scaleless (sc/sc). Science. 214 (4524), 1033-1034 (1981).
- Chuong, C. M., Widelitz, R. B., Ting-Berreth, S., Jiang, T. X. Early events during avian skin appendage regeneration: dependence on epithelial-mesenchymal interaction and order of molecular reappearance. J Invest Dermatol. 107 (4), 639-646 (1996).
- Jiang, T. X., et al. Global feather orientations changed by electric current. iScience. 24 (6), 102671 (2021).
- Jiang, T. X., Jung, H. S., Widelitz, R. B., Chuong, C. M. Self-organization of periodic patterns by dissociated feather mesenchymal cells and the regulation of size, number and spacing of primordia. Development. 126 (22), 4997-5009 (1999).
- Hamburger, V., Hamilton, H. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 188, 49-92 (1951).
- Chen, Y. P., et al. Conservation of early odontogenic signaling pathway in Aves. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 97 (18), 10044-10049 (2000).
- Chuong, C. -M., Ting, S. A., Widelitz, R. B., Lee, Y. S. Mechanism of Skin Morphogenesis: II. Retinoic acid gradient modulates axis orientation and phenotypes of skin appendages. Development. 115 (3), 839-852 (1992).
- Noveen, A., Jiang, T. -X., Chuong, C. -M. Protein kinase A and protein kinase C modulators have reciprocal effects on mesenchymal condensation during skin appendage morphogenesis. Developmental Biology. 171 (2), 677-693 (1995).
- Wu, X. S., et al. Self-assembly of biological networks via adaptive patterning revealed by avian intradermal muscle network formation. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 116 (22), 10858-10867 (2019).
