ऑर्थोडॉन्टिक टूथ मूवमेंट के दौरान वायुकोशीय हड्डी रीमॉडेलिंग का अध्ययन करने के लिए इंड्यूसेबल ओस्टियोब्लास्टिक वंश-विशिष्ट स्टेट 3 नॉकआउट चूहों का उपयोग करना
Summary
यह अध्ययन ऑर्थोडोंटिक बल के तहत हड्डी रीमॉडेलिंग का अध्ययन करने के लिए इंड्यूसेबल ओस्टियोब्लास्ट वंश-विशिष्ट स्टेट 3 नॉकआउट चूहों का उपयोग करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करता है और ऑर्थोडोंटिक दांत आंदोलन के दौरान वायुकोशीय हड्डी रीमॉडेलिंग का विश्लेषण करने के तरीकों का वर्णन करता है, इस प्रकार कंकाल यांत्रिक जीव विज्ञान पर प्रकाश डालता है।
Abstract
उच्च टर्नओवर दर के साथ वायुकोशीय हड्डी, शरीर में सबसे सक्रिय रूप से रीमॉडेलिंग हड्डी है। ऑर्थोडॉन्टिक टूथ मूवमेंट (ओटीएम) यांत्रिक बल के जवाब में वायुकोशीय हड्डी रीमॉडेलिंग की एक सामान्य कृत्रिम प्रक्रिया है, लेकिन अंतर्निहित तंत्र मायावी रहता है। पिछले अध्ययन पशु मॉडल से संबंधित प्रतिबंधों के कारण किसी भी समय और स्थान में हड्डी रीमॉडेलिंग के सटीक तंत्र को प्रकट करने में असमर्थ रहे हैं। सिग्नल ट्रांसड्यूसर और ट्रांसक्रिप्शन 3 (एसटीएटी 3) के उत्प्रेरक हड्डी के चयापचय में महत्वपूर्ण है, लेकिन ओटीएम के दौरान ओस्टियोब्लास्ट में इसकी भूमिका स्पष्ट नहीं है। विवो साक्ष्य प्रदान करने के लिए कि एसटीएटी 3 विशिष्ट समय बिंदुओं पर ओटीएम में भाग लेता है और ओटीएम के दौरान विशेष कोशिकाओं में, हमने एक टैमोक्सीफेन-इंड्यूसेबल ओस्टियोब्लास्ट वंश-विशिष्ट स्टेट 3 नॉकआउट माउस मॉडल उत्पन्न किया, ऑर्थोडॉन्टिक बल लागू किया, और वायुकोशीय हड्डी फेनोटाइप का विश्लेषण किया।
ओटीएम दूरी तक पहुंचने के लिए माइक्रो-कंप्यूटेड टोमोग्राफी (माइक्रो-सीटी) और स्टीरियो माइक्रोस्कोपी का उपयोग किया गया था। हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण ने ओस्टियोब्लास्ट और ओस्टियोक्लास्ट की चयापचय गतिविधि का मूल्यांकन करने के लिए मैक्सिलरी हड्डी के क्रॉस-सेक्शन में पहले दाढ़ (एम 1) की तीन जड़ों के भीतर स्थित क्षेत्र को रुचि के क्षेत्र (आरओआई) के रूप में चुना, जो वायुकोशीय हड्डी पर ऑर्थोडोंटिक बल के प्रभाव को दर्शाता है। संक्षेप में, हम ऑर्थोडोंटिक बल के तहत हड्डी रीमॉडेलिंग का अध्ययन करने और ओटीएम के दौरान वायुकोशीय हड्डी रीमॉडेलिंग का विश्लेषण करने के तरीकों का वर्णन करने के लिए इंड्यूसेबल ओस्टियोब्लास्ट वंश-विशिष्ट स्टेट 3 नॉकआउट चूहों का उपयोग करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं, इस प्रकार कंकाल यांत्रिक जीव विज्ञान पर नया प्रकाश डालते हैं।
Introduction
यह आमतौर पर ज्ञात है कि वोल्फ के नियम 1,2 के अनुसार यांत्रिक बलों के जवाब में हड्डी पूरे जीवन में निरंतर पुनर्निर्माण के अधीन है। उचित यांत्रिक उत्तेजना, जैसे गुरुत्वाकर्षण और दैनिक व्यायाम, हड्डी के द्रव्यमान और ताकत को बनाए रखता है और ओस्टियोब्लास्ट और ओस्टियोक्लास्ट दोनों को उत्तेजित करके हड्डी के नुकसान को रोकता है। ओस्टियोक्लास्ट्स, हड्डी के पुनरुत्थान 3,4,5,6,7 के लिए जिम्मेदार हैं, और ओस्टियोब्लास्ट, हड्डी के गठन के लिए जिम्मेदार 8,9,10, हड्डी होमियोस्टैसिस को बनाए रखते हैं और हड्डी रीमॉडेलिंग की जैविक प्रक्रिया में संयुक्त रूप से कार्य करते हैं। इसके विपरीत, लोडिंग उत्तेजनाओं की अनुपस्थिति में, जैसा कि दीर्घकालिक माइक्रोग्रैविटी के तहत अंतरिक्ष यात्रियों में, हड्डियों को 10% अस्थि खनिज घनत्व हानि का सामना करना पड़ता है, इस प्रकार ऑस्टियोपोरोसिस 11,12 का खतरा बढ़ जाता है। इसके अलावा, ऑर्थोडोंटिक्स और व्याकुलता ऑस्टियोजेनेसिस सहित गैर-आक्रामक और सुविधाजनक यांत्रिक उपचार, हड्डी रोगों13,14 के उपचार के रूप में उभरे हैं। इन सभी से पता चला है कि यांत्रिक बल हड्डी की गुणवत्ता और मात्रा को बनाए रखने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। हाल के अध्ययनों ने आम तौर पर रनिंग व्हील और टेल सस्पेंशन टेस्ट जैसे समय लेने वाले मॉडल का उपयोग करके यांत्रिक लोडिंग के जवाब में हड्डी रीमॉडेलिंग का विश्लेषण किया, जिसमें आमतौर पर15,16 बल लोडिंग या अनलोडिंग का अनुकरण करने में 4 सप्ताह या उससे अधिक समय लगता था। इसलिए, बल लोडिंग द्वारा संचालित हड्डी रीमॉडेलिंग का अध्ययन करने के लिए एक सुविधाजनक और कुशल पशु मॉडल की मांग है।
अस्थि रीमॉडेलिंग के मामले में वायुकोशीय हड्डी सबसे सक्रिय है, जिसमें उच्च टर्नओवर दर17 है। ऑर्थोडॉन्टिक टूथ मूवमेंट (ओटीएम), मालोक्यूलेशन के लिए एक सामान्य उपचार, यांत्रिक बल के जवाब में वायुकोशीय हड्डी रीमॉडेलिंग की एक कृत्रिम प्रक्रिया है। हालांकि, ओटीएम, जो तेजी से हड्डी रीमॉडेलिंग18 को प्रेरित करता है, एक लंबी प्रयोगात्मक अवधि वाले अन्य मॉडलों की तुलना में हड्डी रीमॉडेलिंग पर यांत्रिक बल के प्रभावों का अध्ययन करने का एक समय-बचत तरीका भी है। इसलिए, ओटीएम यांत्रिक उत्तेजनाओं के तहत हड्डी रीमॉडेलिंग का अध्ययन करने के लिए एक आदर्श मॉडल है। यह उल्लेखनीय है कि वायुकोशीय हड्डी रीमॉडेलिंग का तंत्र अक्सर समय-संवेदनशील होता है, और मॉडलिंग के बाद कुछ समय बिंदुओं पर वायुकोशीय हड्डी रीमॉडेलिंग में परिवर्तन का निरीक्षण करना आवश्यक है। डीएनए पुनर्संयोजन और ऊतक विशिष्टता के लौकिक और स्थानिक नियंत्रण के दोहरे फायदे के साथ, एक इंड्यूसेबल सशर्त जीन नॉकआउट माउस मॉडल ओटीएम अध्ययन के लिए एक उपयुक्त विकल्प है।
परंपरागत रूप से, ओटीएम-मध्यस्थता वायुकोशीय हड्डी रीमॉडेलिंग को तनाव क्षेत्रों में विभाजित किया गया है जिसमें हड्डी का गठन और दबाव क्षेत्र शामिल हैं जिसमें हड्डी का पुनर्जीवन 19,20,21 शामिल है, जो अधिक विस्तृत है लेकिन विनियमित करना मुश्किल है। इसके अलावा, यूरी एट अल ने बताया कि ओटीएम में हड्डी के गठन का समय तनाव और संपीड़न पक्ष22 पर भिन्न था। इसके अलावा, एक पिछले अध्ययन से पता चला था कि पहला दाढ़ ऑर्थोडोंटिक बल के तहत मैक्सिलरी वायुकोशीय हड्डी के व्यापक रीमॉडेलिंग शुरू कर सकता है, जो तनाव और दबाव क्षेत्र23 तक सीमित नहीं था। इसलिए, हमने मैक्सिलरी हड्डी के क्रॉस-सेक्शन में एम 1 की तीन जड़ों के भीतर स्थित क्षेत्र को रुचि के क्षेत्र (आरओआई) के रूप में चुना और ओटीएम के तहत वायुकोशीय हड्डी रीमॉडेलिंग का मूल्यांकन करने के लिए उसी क्षेत्र में ओस्टियोब्लास्ट और ओस्टियोक्लास्ट की गतिविधि का आकलन करने के तरीकों का वर्णन किया।
एक परमाणु प्रतिलेखन कारक के रूप में, सिग्नल ट्रांसड्यूसर और ट्रांसक्रिप्शन 3 (एसटीएटी 3) के उत्प्रेरक को हड्डी होमियोस्टैसिस24,25 में महत्वपूर्ण साबित किया गया है। पिछले अध्ययनों ने स्टेट 3-उत्परिवर्ती चूहों26,27 में कम अस्थि खनिज घनत्व और आवर्तक पैथोलॉजिकल फ्रैक्चर की सूचना दी है। हमारे पिछले अध्ययन से पता चला है कि ओएसएक्स + ओस्टियोब्लास्ट में स्टेट 3 के विलोपन से क्रैनियोफेशियल विकृति और ऑस्टियोपोरोसिस, साथ ही सहज हड्डीफ्रैक्चर 28 हुआ। हाल ही में, हमने एक इंड्यूसेबल ओस्टियोब्लास्ट-विशिष्ट स्टेट 3 विलोपन माउस मॉडल (Col1a2 CreERT2; Col12CreERT2) के साथ विवो साक्ष्य प्रदान किया। स्टेट 3 एफएल/ एफएल, जिसे बाद में स्टेट 3 कोल 1 2ईआरटी 2 कहा जाता है) कि एसटीएटी 3 वायुकोशीय हड्डी रीमॉडेलिंग29 को चलाने वाले ऑर्थोडोंटिक बल के प्रभावों की मध्यस्थता में महत्वपूर्ण है। इस अध्ययन में, हम ऑर्थोडोंटिक बल के तहत हड्डी रीमॉडेलिंग का अध्ययन करने के लिए इंड्यूसेबल ओस्टियोब्लास्ट वंश-विशिष्ट स्टेट 3 नॉकआउट चूहों का उपयोग करने के लिए तरीके और प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं और ओटीएम के दौरान वायुकोशीय हड्डी रीमॉडेलिंग का विश्लेषण करने के तरीकों का वर्णन करते हैं, इस प्रकार कंकाल यांत्रिक जीव विज्ञान पर प्रकाश डालते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
चूंकि मालोक्यूलेशन सांस लेने, मस्ती, बोलने और यहां तक कि उपस्थिति को बाधित करने वाले सबसे आम मौखिक विकारों में से एक है, ऑर्थोडोंटिक्स की मांग दिन-प्रतिदिन बढ़ रही है, पिछले महामारी विज्ञान सर्वेक्षण<sup …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (81870740, 82071083, 82271006, 82101048, 81800949) के अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था; शंघाई के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (21ZR1436900, 22ZR1436700); शंघाई अकादमिक / प्रौद्योगिकी अनुसंधान नेता का कार्यक्रम (20XD1422300); एसएचडीसी की नैदानिक अनुसंधान योजना (SHDC2020CR4084); शंघाई नौवीं पीपुल्स हॉस्पिटल के क्रॉस-डिसिप्लिनरी रिसर्च फंड, शंघाई जिओ टोंग यूनिवर्सिटी स्कूल ऑफ मेडिसिन (JYJC201902, JYJC202116); शंघाई में उच्च स्तरीय स्थानीय विश्वविद्यालयों की नवाचार अनुसंधान टीम (SSMUZLCX20180501); अनुसंधान अनुशासन निधि सं. नौवीं पीपुल्स अस्पताल, शंघाई जिओ टोंग यूनिवर्सिटी स्कूल ऑफ मेडिसिन, और कॉलेज ऑफ स्टोमेटोलॉजी, शंघाई जिओ टोंग विश्वविद्यालय से KQYJXK2020; शंघाई नौवीं पीपुल्स अस्पताल की मूल अन्वेषण परियोजना, शंघाई जिओ टोंग यूनिवर्सिटी स्कूल ऑफ मेडिसिन (JYYC003); शंघाई जिओ टोंग यूनिवर्सिटी स्कूल ऑफ मेडिसिन की दो सौ प्रतिभा परियोजना; बायोमटेरियल्स और पुनर्योजी चिकित्सा संस्थान सहकारी अनुसंधान परियोजना शंघाई जिओ टोंग यूनिवर्सिटी स्कूल ऑफ मेडिसिन (2022 एलएचबी02); शंघाई नौवीं पीपुल्स हॉस्पिटल के बायोबैंक की परियोजना, शंघाई जिओ टोंग यूनिवर्सिटी स्कूल ऑफ मेडिसिन (YBKB201909, YBKB202216)।
Materials
| 1x PBS | Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd. | P1020 | |
| 4% paraformaldehyde | Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd. | G1101 | |
| Alizarin red | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| Anti-CTSK antibody | Santa Cruz | sc-48353 | |
| Anti-OPN antibody | R&D Systems, Minneapolis, MN, USA | AF808 | |
| Calcein | Sigma-Aldrich | C0875 | |
| Closed-coil springs | Innovative Material and Devices, Shanghai, China | CS1006B | |
| Col1α2CreERT2 mice | A gift from Bin Zhou, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences. | ||
| Dexmedetomidine hydrochloride | Orionintie Corporation, Orion Pharma Espoo site | ||
| EDTA | Beyotime Biotechanology | ST069 | |
| Embedding tanks | Citotest Labware Manufacturing Co., Ltd | 80106-1100-16 | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 100092183 | |
| ImageJ software | NIH, Bethesda, MD, USA | ||
| Mounting medium with DAPI | Beyotime Biotechanology | P0131 | |
| Mouse dissection platform | Shanghai Huake Experimental Devices and Materials Co., Ltd. | HK105 | |
| Paraffin | Sangon biotech Co., Ltd. | A601889 | |
| Primers for genotyping | Stat3 F-TTGACCTGTGCTCCTACAAAAA; Stat3 R-CCCTAGATTAGGCCAGCACA; Cre F-CGATGCAACGAGTGATGAGG; Cre R-CGCATA ACCAGTGAAACAGC | ||
| Protease K | Sigma-Aldrich | 539480 | |
| Self-curing restorative resin | 3M ESPE, St. Paul, MN, USA | 712-035 | |
| Stat3fl/fl mice | GemPharmatech Co., Ltd | D000527 | |
| Tamoxifen | Sigma-Aldrich | T5648 | |
| TRAP staining kit | Sigma-Aldrich | 387A | |
| Tris-HCl | Beyotime Biotechanology | ST780 | |
| Universal tissue fixative | Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd. | G1105 | |
| Xylene | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 10023418 | |
| Zoletil | VIRBAC |
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