שימוש בעכברי נוקאאוט ספציפיים לשושלת אוסטאובלסטית אינדוקציה 3 כדי לחקור עיצוב מחדש של עצם הנאדית במהלך תנועת שיניים אורתודונטית
Summary
מחקר זה מספק פרוטוקול לשימוש בעכברי נוקאאוט Stat3 ספציפיים לשושלת אוסטאובלסטים כדי לחקור עיצוב מחדש של עצם תחת כוח אורתודונטי ומתאר שיטות לניתוח עיצוב מחדש של עצם הנאדית במהלך תנועת שיניים אורתודונטית, ובכך שופך אור על הביולוגיה המכנית של השלד.
Abstract
עצם הנאדית, עם שיעור תחלופה גבוה, היא העצם המשפצת ביותר בגוף. תנועת שיניים אורתודונטית (OTM) היא תהליך מלאכותי נפוץ של עיצוב מחדש של עצם הנאדית בתגובה לכוח מכני, אך המנגנון הבסיסי נותר חמקמק. מחקרים קודמים לא הצליחו לחשוף את המנגנון המדויק של עיצוב מחדש של עצם בכל זמן ומרחב בשל מגבלות הקשורות למודלים של בעלי חיים. מתמר האותות והמפעיל של שעתוק 3 (STAT3) חשוב בחילוף החומרים בעצמות, אך תפקידו באוסטאובלסטים במהלך OTM אינו ברור. כדי לספק ראיות in vivo לכך ש-STAT3 משתתף ב-OTM בנקודות זמן ספציפיות ובתאים מסוימים במהלך OTM, יצרנו מודל עכבר נוקאאוט Stat3 ספציפי לשושלת אוסטאובלסטים המושרה בטמוקסיפן, הפעלנו כוח אורתודונטי וניתחנו את פנוטיפ העצם הנאדית.
טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת (Micro-CT) ומיקרוסקופ סטריאו שימשו לגישה למרחק OTM. ניתוח היסטולוגי בחר את האזור הממוקם בתוך שלושה שורשים של הטוחנת הראשונה (M1) בחתך הרוחב של העצם המקסילרית כאזור העניין (ROI) כדי להעריך את הפעילות המטבולית של אוסטאובלסטים ואוסטאוקלסטים, מה שמצביע על השפעת הכוח האורתודונטי על עצם הנאדיות. בקיצור, אנו מספקים פרוטוקול לשימוש בעכברי נוקאאוט Stat3 ספציפיים לשושלת אוסטאובלסטים כדי לחקור עיצוב מחדש של עצם תחת כוח אורתודונטי ומתארים שיטות לניתוח עיצוב מחדש של עצם מכתשית במהלך OTM, ובכך שופכים אור חדש על ביולוגיה מכנית השלד.
Introduction
ידוע בדרך כלל כי העצם נמצאת בשחזור מתמיד לאורך כל החיים, בתגובה לכוחות מכניים על פי חוק וולף 1,2. גירוי מכני מתאים, כגון כוח הכבידה ופעילות גופנית יומיומית, שומר על מסת העצם וחוזקה ומונע אובדן עצם על ידי גירוי הן אוסטאובלסטים והן אוסטאוקלסטים. אוסטאוקלסטים, האחראים על ספיגת עצם 3,4,5,6,7, ואוסטאובלסטים, האחראים על היווצרות עצם 8,9,10, שומרים על הומאוסטזיס העצם ומתפקדים במשותף בתהליך הביולוגי של עיצוב מחדש של העצם. לעומת זאת, בהיעדר גירויי העמסה, כמו אצל אסטרונאוטים תחת מיקרו-כבידה ארוכת טווח, העצמות סובלות מאובדן צפיפות מינרלים של 10%, מה שמגדיל את הסיכון לאוסטאופורוזיס11,12. יתר על כן, טיפולים מכניים לא פולשניים ונוחים, כולל יישור שיניים ואוסטאוגנזה של הסחת דעת, התגלו כטיפולים למחלות עצם13,14. כל אלה הראו כי כוח מכני משחק תפקיד קריטי בשמירה על איכות העצם וכמותה. מחקרים אחרונים ניתחו בדרך כלל עיצוב מחדש של עצם בתגובה להעמסה מכנית באמצעות מודלים גוזלי זמן כגון בדיקות מתלים של גלגל ריצה וזנב, אשר בדרך כלל לקח 4 שבועות או יותר כדי לדמות העמסת כוח או פריקה15,16. לכן, יש ביקוש למודל נוח ויעיל של בעלי חיים לחקר עיצוב מחדש של עצם המונע על ידי העמסת כוח.
עצם הנאדית היא הפעילה ביותר מבחינת שיפוץ עצם, עם שיעור תחלופה גבוה17. תנועת שיניים אורתודונטית (OTM), טיפול נפוץ לחסימה, היא תהליך מלאכותי של עיצוב מחדש של עצם הנאדית בתגובה לכוח מכני. עם זאת, OTM, אשר גורם לעיצוב מחדש מהיר של עצם18, הוא גם דרך חוסכת זמן לחקור את ההשפעות של כוח מכני על עיצוב מחדש של עצם בהשוואה למודלים אחרים עם תקופת ניסוי ארוכה. לכן, OTM הוא מודל אידיאלי ללמוד שיפוץ עצם תחת גירויים מכניים. ראוי לציין כי המנגנון של remodeling עצם alveolar הוא לעתים קרובות רגיש לזמן, ויש צורך לבחון את השינויים remodeling עצם alveolar בנקודות זמן מסוימות לאחר דוגמנות. עם היתרונות הכפולים של בקרה זמנית ומרחבית של רקומבינציה מחדש של DNA וספציפיות רקמות, מודל עכבר נוקאאוט גן מותנה המושרה הוא בחירה מתאימה למחקרי OTM.
באופן קונבנציונלי, עיצוב מחדש של עצם מכתשית בתיווך OTM חולק לאזורי מתח הכוללים היווצרות עצם ואזורי לחץ הכוללים ספיגת עצם 19,20,21, שהיא מפורטת יותר אך קשה לווסת. יתר על כן, יורי ואחרים דיווחו כי זמן היווצרות העצם ב- OTM היה שונה בצדדי המתח והדחיסה22. בנוסף, מחקר קודם הראה כי הטוחנת הראשונה יכולה ליזום שיפוץ רחב של עצם הנאדית המקסילרית תחת כוח אורתודונטי, אשר לא היה מוגבל לאזורי המתח והלחץ23. לכן, בחרנו את האזור הממוקם בתוך שלושה שורשים של M1 בחתך הרוחב של העצם המקסילרית כאזור העניין (ROI) ותיארנו שיטות להערכת הפעילות של אוסטאובלסטים ואוסטאוקלסטים באותו אזור כדי להעריך עיצוב מחדש של עצם מכתשית תחת OTM.
כגורם שעתוק גרעיני, מתמר אותות ומפעיל של שעתוק 3 (STAT3) הוכח כקריטי בהומאוסטזיסעצם 24,25. מחקרים קודמים דיווחו על צפיפות מינרלים נמוכה בעצם ושברים פתולוגיים חוזרים ונשנים בעכברים מוטנטיים Stat3 26,27. המחקר הקודם שלנו הראה כי מחיקת Stat3 באוסטאובלסטים Osx+ גרמה למום גולגולתי ואוסטאופורוזיס, כמו גם לשבר עצם ספונטני28. לאחרונה, סיפקנו ראיות in vivo עם מודל עכבר מחיקה ספציפי לאוסטאובלסטים Stat3 (Col1α2CreERT2; Stat3 fl/fl, להלן Stat3Col1α2ERT2) כי STAT3 הוא קריטי בתיווך ההשפעות של כוח אורתודונטי המניע עיצוב מחדש של עצם מכתשית29. במחקר זה, אנו מספקים שיטות ופרוטוקולים לשימוש בעכברי נוקאאוט Stat3 ספציפיים לשושלת אוסטאובלסטים כדי לחקור עיצוב מחדש של עצם תחת כוח אורתודונטי ומתארים שיטות לניתוח עיצוב מחדש של עצם מכתשית במהלך OTM, ובכך שופכים אור על הביולוגיה המכנית של השלד.
Protocol
Representative Results
Discussion
מכיוון שחסימה היא בין הפרעות הפה הנפוצות ביותר הפוגעות בנשימה, במסטיקציה, בדיבור ואפילו במראה, הביקוש ליישור שיניים עולה מיום ליום כאשר התחלואה עולה מ-70% ל-93% על פי סקר אפידמיולוגי קודם31,32. כיצד להאיץ שיפוץ עצם מכתשית כדי להעלות את היעילות של טיפול אורתודונט?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מענקים מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (81870740, 82071083, 82271006, 82101048, 81800949); הקרן למדעי הטבע של שנחאי (21ZR1436900, 22ZR1436700); התוכנית של מוביל מחקר אקדמי / טכנולוגי בשנחאי (20XD1422300); תוכנית מחקר קליני של SHDC (SHDC2020CR4084); קרן המחקר הבין-תחומית של בית החולים העממי התשיעי בשנחאי, בית הספר לרפואה של אוניברסיטת ג’יאו טונג בשנגחאי (JYJC201902, JYJC202116); צוות מחקר החדשנות של אוניברסיטאות מקומיות ברמה גבוהה בשנחאי (SSMUZLCX20180501); קרן דיסציפלינה למחקר מס’ KQYJXK2020 מבית החולים העממי התשיעי, בית הספר לרפואה של אוניברסיטת ג’יאו טונג בשנחאי והמכללה לסטומטולוגיה, אוניברסיטת ג’יאו טונג בשנחאי; פרויקט חקר מקורי של בית החולים העממי התשיעי בשנחאי, בית הספר לרפואה של אוניברסיטת ג’יאו טונג בשנגחאי (JYYC003); פרויקט מאתיים כישרונות של בית הספר לרפואה של אוניברסיטת ג’יאו טונג בשנחאי; פרויקט המחקר השיתופי של המכון לביו-חומרים ורפואה רגנרטיבית בשנחאי בית הספר לרפואה של אוניברסיטת ג’יאו טונג (2022LHB02); פרויקט הביובנק של בית החולים העממי התשיעי בשנחאי, בית הספר לרפואה של אוניברסיטת ג’יאו טונג בשנגחאי (YBKB201909, YBKB202216).
Materials
| 1x PBS | Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd. | P1020 | |
| 4% paraformaldehyde | Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd. | G1101 | |
| Alizarin red | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| Anti-CTSK antibody | Santa Cruz | sc-48353 | |
| Anti-OPN antibody | R&D Systems, Minneapolis, MN, USA | AF808 | |
| Calcein | Sigma-Aldrich | C0875 | |
| Closed-coil springs | Innovative Material and Devices, Shanghai, China | CS1006B | |
| Col1α2CreERT2 mice | A gift from Bin Zhou, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences. | ||
| Dexmedetomidine hydrochloride | Orionintie Corporation, Orion Pharma Espoo site | ||
| EDTA | Beyotime Biotechanology | ST069 | |
| Embedding tanks | Citotest Labware Manufacturing Co., Ltd | 80106-1100-16 | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 100092183 | |
| ImageJ software | NIH, Bethesda, MD, USA | ||
| Mounting medium with DAPI | Beyotime Biotechanology | P0131 | |
| Mouse dissection platform | Shanghai Huake Experimental Devices and Materials Co., Ltd. | HK105 | |
| Paraffin | Sangon biotech Co., Ltd. | A601889 | |
| Primers for genotyping | Stat3 F-TTGACCTGTGCTCCTACAAAAA; Stat3 R-CCCTAGATTAGGCCAGCACA; Cre F-CGATGCAACGAGTGATGAGG; Cre R-CGCATA ACCAGTGAAACAGC | ||
| Protease K | Sigma-Aldrich | 539480 | |
| Self-curing restorative resin | 3M ESPE, St. Paul, MN, USA | 712-035 | |
| Stat3fl/fl mice | GemPharmatech Co., Ltd | D000527 | |
| Tamoxifen | Sigma-Aldrich | T5648 | |
| TRAP staining kit | Sigma-Aldrich | 387A | |
| Tris-HCl | Beyotime Biotechanology | ST780 | |
| Universal tissue fixative | Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd. | G1105 | |
| Xylene | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 10023418 | |
| Zoletil | VIRBAC |
References
- Frost, H. M. The Utah paradigm of skeletal physiology: an overview of its insights for bone, cartilage and collagenous tissue organs. Journal of Bone and Mineral Metabolism. 18 (6), 305-316 (2000).
- Frost, H. M. Wolff’s Law and bone’s structural adaptations to mechanical usage: an overview for clinicians. The Angle Orthodontist. 64 (3), 175-188 (1994).
- Gothlin, G., Ericsson, J. L. The osteoclast: review of ultrastructure, origin, and structure-function relationship. Clinical Orthopaedics and Related Research. (120), 201-231 (1976).
- Feng, X., Teitelbaum, S. L. Osteoclasts: New Insights. Bone Research. 1 (1), 11-26 (2013).
- Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. Osteoclast differentiation and activation. Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).
- Zhu, L. X., et al. Osteoclast-mediated bone resorption is controlled by a compensatory network of secreted and membrane-tethered metalloproteinases. Science Translational Medicine. 12 (529), eaaw6143 (2020).
- Dai, Q., et al. A RANKL-based osteoclast culture assay of mouse bone marrow to investigate the role of mTORC1 in osteoclast formation. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (133), 56468 (2018).
- Karsenty, G., Kronenberg, H. M., Settembre, C. Genetic control of bone formation. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 25, 629-648 (2009).
- Long, F. Building strong bones: molecular regulation of the osteoblast lineage. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 13 (1), 27-38 (2011).
- Harada, S., Rodan, G. A. Control of osteoblast function and regulation of bone mass. Nature. 423 (6937), 349-355 (2003).
- Lang, T., et al. Cortical and trabecular bone mineral loss from the spine and hip in long-duration spaceflight. Journal of Bone and Mineral Research. 19 (6), 1006-1012 (2004).
- Sibonga, J. D. Spaceflight-induced bone loss: is there an osteoporosis risk. Current Osteoporosis Reports. 11 (2), 92-98 (2013).
- Yang, Y., et al. Administration of allogeneic mesenchymal stem cells in lengthening phase accelerates early bone consolidation in rat distraction osteogenesis model. Stem Cell Research and Therapy. 11 (1), 129 (2020).
- Huang, C., Holfeld, J., Schaden, W., Orgill, D., Ogawa, R. Mechanotherapy: revisiting physical therapy and recruiting mechanobiology for a new era in medicine. Trends in Molecular Medicine. 19 (9), 555-564 (2013).
- Shu, H. S., et al. Tracing the skeletal progenitor transition during postnatal bone formation. Cell Stem Cell. 28 (12), 2122-2136 (2021).
- Wang, X., et al. miR-214 targets ATF4 to inhibit bone formation. Nature Medicine. 19 (1), 93-100 (2013).
- Huja, S. S., Fernandez, S. A., Hill, K. J., Li, Y. Remodeling dynamics in the alveolar process in skeletally mature dogs. The Anatomical Record. Part A, Discoveries in Molecular, Cellular, and Evolutionary Biology. 288 (12), 1243-1249 (2006).
- Jin, A., et al. FOXO3 mediates tooth movement by regulating force-induced osteogenesis. Journal of Dental Research. 101 (2), 196-205 (2022).
- Bumann, A., Carvalho, R. S., Schwarzer, C. L., Yen, E. H. Collagen synthesis from human PDL cells following orthodontic tooth movement. European Journal of Orthodontics. 19 (1), 29-37 (1997).
- Kitaura, H., et al. Effect of cytokines on osteoclast formation and bone resorption during mechanical force loading of the periodontal membrane. The Scientific World Journal. 2014, 617032 (2014).
- Lu, W., et al. Sclerostin injection enhances orthodontic tooth movement in rats. Archives of Oral Biology. 99, 43-50 (2019).
- Seki, Y., et al. Differentiation ability of Gli1(+) cells during orthodontic tooth movement. Bone. 166, 116609 (2023).
- Gong, X. Y., et al. Local orthodontic force initiates widespread remodelling of the maxillary alveolar bone. Australasian Orthodontic Journal. 36 (2), 175-183 (2020).
- Liu, Y., et al. STAT3 and its targeting inhibitors in osteosarcoma. Cell Proliferation. 54 (2), e12974 (2021).
- Guadagnin, E., Mazala, D., Chen, Y. W. STAT3 in skeletal muscle function and disorders. International Journal of Molecular Sciences. 19 (8), 2265 (2018).
- Saikia, B., et al. Clinical profile of hyper-IgE syndrome in India. Frontiers in Immunology. 12, 626593 (2021).
- van de Veen, W., et al. Impaired memory B-cell development and antibody maturation with a skewing toward IgE in patients with STAT3 hyper-IgE syndrome. Allergy. 74 (12), 2394-2405 (2019).
- Zhou, S. R., et al. STAT3 is critical for skeletal development and bone homeostasis by regulating osteogenesis. Nature Communications. 12 (1), 6891 (2021).
- Gong, X. Y., et al. Osteoblastic STAT3 is crucial for orthodontic force driving alveolar bone remodeling and tooth movement. Journal of Bone and Mineral Research. 38 (1), 214-227 (2023).
- Yang, Y., et al. Skeletal phenotype analysis of a conditional Stat3 deletion mouse model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (161), 61390 (2020).
- Egic, B. Prevalence of orthodontic malocclusion in schoolchildren in Slovenia. A prospective aepidemiological study. European Journal of Paediatric Dentistry. 23 (1), 39-43 (2022).
- Gois, E. G., et al. Incidence of malocclusion between primary and mixed dentitions among Brazilian children A 5-year longitudinal study. The Angle Orthodontist. 82 (3), 495-500 (2012).
- Yang, F., et al. Effects Of triptolide on tooth movement and root resorption in rats. Drug Design, Development and Therapy. 13, 3963-3975 (2019).
- Wang, C., Sun, H. Progress in gene knockout mice. Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao. 35 (5), 784-794 (2019).
- Cao, H., et al. Force-induced Adrb2 in periodontal ligament cells promotes tooth movement. Journal of Dental Research. 93 (11), 1163-1169 (2014).
