Bruk av induserbare osteoblastiske avstamningsspesifikke Stat3 Knockout-mus for å studere alveolær beinremodellering under kjeveortopedisk tannbevegelse

Summary

Denne studien gir en protokoll for bruk av induserbare osteoblast avstamningsspesifikke Stat3 knockoutmus for å studere beinremodellering under kjeveortopedisk kraft og beskriver metoder for å analysere alveolær beinremodellering under kjeveortopedisk tannbevegelse, og dermed kaste lys over skjelettmekanisk biologi.

Abstract

Det alveolære beinet, med høy omsetningshastighet, er det mest aktivt remodellerende beinet i kroppen. Ortodontisk tannbevegelse (OTM) er en vanlig kunstig prosess med alveolær beinremodellering som respons på mekanisk kraft, men den underliggende mekanismen forblir unnvikende. Tidligere studier har ikke vært i stand til å avsløre den nøyaktige mekanismen for beinremodellering i tid og rom på grunn av dyremodellrelaterte restriksjoner. Signaltransduseren og aktivatoren av transkripsjon 3 (STAT3) er viktig i benmetabolisme, men dens rolle i osteoblaster under OTM er uklar. For å gi in vivo bevis på at STAT3 deltar i OTM på bestemte tidspunkter og spesielt celler under OTM, genererte vi en tamoxifen-induserbar osteoblast avstamningsspesifikk Stat3 knockout musemodell, anvendt kjeveortopedisk kraft og analyserte alveolar beinfenotypen.

Mikrocomputertomografi (Micro-CT) og stereomikroskopi ble brukt for å få tilgang til OTM-avstand. Histologisk analyse valgte området som ligger innenfor tre røtter av den første molaren (M1) i tverrsnittet av det maksillære beinet som interesseområdet (ROI) for å evaluere den metabolske aktiviteten til osteoblaster og osteoklaster, noe som indikerer effekten av kjeveortopedisk kraft på alveolær bein. Kort sagt, vi gir en protokoll for bruk av inducible osteoblast lineage-spesifikke Stat3 knockout mus for å studere bein remodeling under ortodontisk kraft og beskrive metoder for å analysere alveolar bein remodeling under OTM, og dermed kaste nytt lys på skjelett mekanisk biologi.

Introduction

Det er allment kjent at bein er under konstant rekonstruksjon gjennom livet, som svar på mekaniske krefter i henhold til Wolffs lov ^1,2. Passende mekanisk stimulering, som tyngdekraft og daglig mosjon, opprettholder benmasse og styrke og forhindrer bentap ved å stimulere både osteoblaster og osteoklaster. Osteoklaster, ansvarlig for benresorpsjon 3,4,5,6,7, og osteoblaster, ansvarlig for beindannelse 8,9,10^, opprettholder benhomeostase og fungerer sammen i den biologiske prosessen med beinremodellering. I kontrast, i fravær av laststimuli, som hos astronauter under langvarig mikrogravitasjon, lider bein 10% tap av beinmineraltetthet, og øker dermed risikoen for osteoporose^11,12. Videre har ikke-invasive og praktiske mekaniske terapier, inkludert kjeveortopedi og distraksjonsosteogenese, dukket opp som behandlinger for beinsykdommer^13,14. Alle disse har vist at mekanisk kraft spiller en kritisk rolle for å opprettholde beinkvalitet og kvantitet. Nylige studier analyserte generelt beinremodellering som svar på mekanisk belastning ved hjelp av tidkrevende modeller som løpehjul og haleopphengstester, som vanligvis tok 4 uker eller mer for å simulere kraftbelastning eller lossing^15,16. Derfor er det etterspørsel etter en praktisk og effektiv dyremodell for å studere beinremodellering drevet av kraftbelastning.

Det alveolære beinet er det mest aktive når det gjelder beinremodellering, med høy omsetningshastighet¹⁷. Ortodontisk tannbevegelse (OTM), en vanlig behandling for maloklusjon, er en kunstig prosess med alveolær beinremodellering som respons på mekanisk kraft. Imidlertid er OTM, som induserer rask beinremodellering¹⁸, også en tidsbesparende måte å studere effekten av mekanisk kraft på beinremodellering sammenlignet med andre modeller med en lang eksperimentell periode. Derfor er OTM en ideell modell for å studere beinremodellering under mekaniske stimuli. Det er bemerkelsesverdig at mekanismen for alveolær beinremodellering ofte er tidsfølsom, og det er nødvendig å observere endringene i alveolær beinremodellering på bestemte tidspunkter etter modellering. Med de to fordelene med tidsmessig og romlig kontroll av DNA-rekombinasjon og vevsspesifisitet, er en induserbar betinget gen-knockout-musemodell et passende valg for OTM-studier.

Konvensjonelt har OTM-mediert alveolær beinremodellering blitt delt inn i spenningssoner som involverer beindannelse og trykksoner som involverer benresorpsjon 19,20,21, som er mer detaljert^, men vanskelig å regulere. Videre rapporterte Yuri et al. at tiden for beindannelse i OTM var forskjellig på spennings- og kompresjonssidene²². I tillegg hadde en tidligere studie vist at den første jekselen kunne initiere bred remodellering av det maksillære alveolære beinet under kjeveortopedisk kraft, som ikke var begrenset til spennings- og trykksonene²³. Derfor valgte vi området som ligger innenfor tre røtter av M1 i tverrsnittet av det maksillære beinet som interesseområde (ROI) og beskrev metoder for å vurdere aktiviteten til osteoblaster og osteoklaster i samme område for å evaluere alveolær beinremodellering under OTM.

Som en kjernefysisk transkripsjonsfaktor har signaltransduser og aktivator av transkripsjon 3 (STAT3) vist seg å være kritisk i beinhomeostase^24,25. Tidligere studier har rapportert lav beinmineraltetthet og tilbakevendende patologiske brudd i Stat3-muterte mus^26,27. Vår tidligere studie viste at delesjon av Stat3 i Osx ⁺ osteoblaster forårsaket kraniofacial misdannelse og osteoporose, samt spontane beinbrudd²⁸. Nylig ga vi in vivo-bevis med en induserbar osteoblastspesifikk Stat3-delesjonsmusemodell (Col1α2^CreERT2; Stat3 fl^/fl, heretter kalt Stat3^{Col1α2ERT2) at STAT3} er avgjørende for å formidle effekten av kjeveortopedisk kraft som driver remodellering av alveolær bein²⁹. I denne studien gir vi metoder og protokoller for bruk av induserbare osteoblastavstamningsspesifikke Stat3 knockoutmus for å studere beinremodellering under kjeveortopedisk kraft og beskrive metoder for å analysere alveolær beinremodellering under OTM, og dermed kaste lys over skjelettmekanisk biologi.

Protocol

Alle metoder som involverer dyr som er beskrevet her, ble godkjent av etikkomiteen ved Shanghai Ninth People’s Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (nr. 82101048). 1. Etablering av induserbare osteoblast avstamningsspesifikke Stat3 knockout mus MERK: Stat3 fl/ fl mus ble oppnådd kommersielt; Col1α2CreERT2-stammenvar en gave (se materialfortegnelsen for alle detal…

Representative Results

Ved hjelp av denne protokollen etablerte vi en induserbar osteoblast avstamningsspesifikk Stat3 knockout mus (Stat3Col1α2ERT2) modell for å undersøke effekten av STAT3-delesjon på ortodontisk kraftdrevet alveolær beinremodellering (figur 1A, B). STAT3-delesjon i osteoblaster ble bekreftet ved immunfluorescensfarging av alveolær ben (figur 1C). Stereomikroskopi indikerte at OTM-avstan…

Discussion

Siden maloklusjon er blant de vanligste orale lidelsene som svekker pust, mastication, snakk og til og med utseende, øker etterspørselen etter kjeveortopedi dag for dag med forekomsten som stiger fra 70% til 93% ifølge en tidligere epidemiologisk undersøkelse^31,32. Hvordan akselerere alveolær beinremodellering for å øke effektiviteten av kjeveortopedisk behandling trygt, har blitt et hett tema på dette feltet; Derfor er det nødvendig å avklare mekanisme…

Materials

1x PBS	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	P1020
4% paraformaldehyde	Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd.	G1101
Alizarin red	Sigma-Aldrich	A5533
Anti-CTSK antibody	Santa Cruz	sc-48353
Anti-OPN antibody	R&D Systems, Minneapolis, MN, USA	AF808
Calcein	Sigma-Aldrich	C0875
Closed-coil springs	Innovative Material and Devices, Shanghai, China	CS1006B
Col1α2CreERT2 mice			A gift from Bin Zhou, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences.
Dexmedetomidine hydrochloride	Orionintie Corporation, Orion Pharma Espoo site
EDTA	Beyotime Biotechanology	ST069
Embedding tanks	Citotest Labware Manufacturing Co., Ltd	80106-1100-16
Ethanol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	100092183
ImageJ software	NIH, Bethesda, MD, USA
Mounting medium with DAPI	Beyotime Biotechanology	P0131
Mouse dissection platform	Shanghai Huake Experimental Devices and Materials Co., Ltd.	HK105
Paraffin	Sangon biotech Co., Ltd.	A601889
Primers for genotyping			Stat3 F-TTGACCTGTGCTCCTACAAAAA; Stat3 R-CCCTAGATTAGGCCAGCACA; Cre F-CGATGCAACGAGTGATGAGG; Cre R-CGCATA ACCAGTGAAACAGC
Protease K	Sigma-Aldrich	539480
Self-curing restorative resin	3M ESPE, St. Paul, MN, USA	712-035
Stat3fl/fl mice	GemPharmatech Co., Ltd	D000527
Tamoxifen	Sigma-Aldrich	T5648
TRAP staining kit	Sigma-Aldrich	387A
Tris-HCl	Beyotime Biotechanology	ST780
Universal tissue fixative	Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd.	G1105
Xylene	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	10023418
Zoletil	VIRBAC