В этом исследовании представлен протокол использования мышей с нокаутом Stat3 , специфичных для индуцируемой линии остеобластов, для изучения ремоделирования кости под действием ортодонтической силы и описаны методы анализа ремоделирования альвеолярной кости во время ортодонтического перемещения зубов, что проливает свет на механическую биологию скелета.
Альвеолярная кость с высокой скоростью обновления является наиболее активно ремоделирующей костью в организме. Ортодонтическое перемещение зубов (OTM) является распространенным искусственным процессом ремоделирования альвеолярной кости в ответ на механическую силу, но основной механизм остается неуловимым. Предыдущие исследования не смогли выявить точный механизм ремоделирования костной ткани в любое время и пространстве из-за ограничений, связанных с животными моделями. Сигнальный преобразователь и активатор транскрипции 3 (STAT3) важен в метаболизме костной ткани, но его роль в остеобластах во время ОТМ неясна. Чтобы предоставить in vivo доказательства того, что STAT3 участвует в OTM в определенные моменты времени и в определенных клетках во время OTM, мы создали тамоксифен-индуцируемую модель остеобластов Stat3 на мышах, применили ортодонтическую силу и проанализировали фенотип альвеолярной кости.
Для доступа к расстоянию ОТМ использовали микрокомпьютерную томографию (Micro-CT) и стереомикроскопию. Гистологический анализ выбрал область, расположенную в пределах трех корней первого моляра (M1) в поперечном сечении верхнечелюстной кости, в качестве области интереса (ROI) для оценки метаболической активности остеобластов и остеокластов, указывающей на влияние ортодонтической силы на альвеолярную кость. Вкратце, мы предлагаем протокол использования индуцируемых остеобласт-специфичных нокаут-мышей Stat3 для изучения ремоделирования костной ткани под действием ортодонтической силы и описываем методы анализа ремоделирования альвеолярной кости во время ОТМ, тем самым проливая новый свет на скелетную механическую биологию.
Общеизвестно, что кость подвергается постоянной реконструкции на протяжении всей жизни, реагируя на механические силы в соответствии с законом Вольфа 1,2. Соответствующая механическая стимуляция, такая как гравитация и ежедневные физические упражнения, поддерживает костную массу и прочность и предотвращает потерю костной массы, стимулируя как остеобласты, так и остеокласты. Остеокласты, ответственные за резорбцию костной ткани 3,4,5,6,7, и остеобласты, ответственные за формирование костной ткани 8,9,10, поддерживают гомеостаз костной ткани и совместно функционируют в биологическом процессе ремоделирования костной ткани. Напротив, при отсутствии нагрузочных стимулов, как у астронавтов в условиях длительной микрогравитации, кости страдают от потери минеральной плотности костной ткани на 10%, что увеличивает риск развития остеопороза11,12. Кроме того, неинвазивные и удобные методы лечения, включая ортодонтию и дистракционный остеогенез, появились в качестве методов лечения заболеваний костей13,14. Все это показало, что механическая сила играет решающую роль в поддержании качества и количества костной ткани. В недавних исследованиях, как правило, анализировалось ремоделирование костей в ответ на механическую нагрузку с использованием трудоемких моделей, таких как испытания ходового колеса и хвостовой подвески, которые обычно занимали 4 недели или более для имитации силовой нагрузки или разгрузки15,16. Поэтому существует спрос на удобную и эффективную животную модель для изучения ремоделирования костей под действием силовой нагрузки.
Альвеолярная кость является наиболее активной с точки зрения ремоделирования кости, с высокой частотой обновления17. Ортодонтическое перемещение зубов (OTM), распространенный метод лечения неправильного прикуса, представляет собой искусственный процесс ремоделирования альвеолярной кости в ответ на механическую силу. Тем не менее, OTM, который индуцирует быстрое ремоделирование кости18, также является экономящим время способом изучения влияния механической силы на ремоделирование кости по сравнению с другими моделями с длительным экспериментальным периодом. Таким образом, ОТМ является идеальной моделью для изучения ремоделирования костной ткани при механических раздражителях. Примечательно, что механизм ремоделирования альвеолярной кости часто чувствителен ко времени, и необходимо наблюдать изменения в ремоделировании альвеолярной кости в определенные моменты времени после моделирования. Обладая двойными преимуществами временного и пространственного контроля рекомбинации ДНК и тканевой специфичности, индуцируемая условная модель нокаута гена мыши является подходящим выбором для исследований OTM.
Условно, OTM-опосредованное ремоделирование альвеолярной кости было разделено на зоны натяжения, связанные с формированием костной ткани, и зоны давления, включающие резорбцию костной ткани 19,20,21, которая является более детальной, но трудно регулируемой. Кроме того, Yuri et al. сообщили, что время формирования костной ткани при ОТМ различалось на стороне растяжения и компрессии22. Кроме того, предыдущее исследование продемонстрировало, что первый моляр может инициировать широкое ремоделирование верхнечелюстной альвеолярной кости под действием ортодонтической силы, которая не ограничена зонами растяжения и давления23. Таким образом, в качестве области интереса (ROI) мы выбрали область, расположенную в пределах трех корней М1 в поперечном сечении верхнечелюстной кости, и описали методы оценки активности остеобластов и остеокластов в той же области для оценки ремоделирования альвеолярной кости при ОТМ.
Доказано, что ядерный транскрипционный фактор, преобразователь сигналов и активатор транскрипции 3 (STAT3) имеет решающее значение для костного гомеостаза24,25. Предыдущие исследования сообщали о низкой минеральной плотности костной ткани и рецидивирующих патологических переломах у мышей с мутацией Stat3 26,27. Наше предыдущее исследование показало, что делеция Stat3 в остеобластах Osx+ вызывает черепно-лицевые пороки развития и остеопороз, а также спонтанный перелом костей28. Недавно мы предоставили доказательства in vivo с индуцируемой остеобласт-специфичной моделью делеции Stat3 у мышей (Col1α2CreERT2; Stat3 fl/fl, далее именуемый Stat3Col1α2ERT2), что STAT3 имеет решающее значение в опосредовании эффектов ортодонтической силы, приводящей к ремоделированию альвеолярной кости29. В этом исследовании мы предлагаем методы и протоколы использования индуцируемых остеобласт-специфичных нокаут-мышей Stat3 для изучения ремоделирования костной ткани под действием ортодонтической силы и описываем методы анализа ремоделирования альвеолярной кости во время ОТМ, тем самым проливая свет на скелетную механическую биологию.
Поскольку неправильный прикус является одним из наиболее распространенных заболеваний полости рта, ухудшающих дыхание, жевание, речь и даже внешний вид, спрос на ортодонтию растет день ото дня, а заболеваемость растет с 70% до 93%, согласно предыдущему эпидемиологическому обследованию<sup…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была частично поддержана грантами Национального фонда естественных наук Китая (81870740, 82071083, 82271006, 82101048, 81800949); Шанхайский фонд естественных наук (21ZR1436900, 22ZR1436700); Программа Шанхайского лидера по академическим/технологическим исследованиям (20XD1422300); План клинических исследований SHDC (SHDC2020CR4084); Междисциплинарный исследовательский фонд Шанхайской девятой народной больницы, Медицинский факультет Шанхайского университета Цзяотун (JYJC201902, JYJC202116); Группа инновационных исследований местных университетов высокого уровня в Шанхае (SSMUZLCX20180501); Фонд научно-исследовательских дисциплин No KQYJXK2020 из Девятой народной больницы, Школы медицины Шанхайского университета Цзяотун и Колледжа стоматологии, Шанхайского университета Цзяотун; Первоначальный исследовательский проект Шанхайской девятой народной больницы, Медицинский факультет Шанхайского университета Цзяотун (JYYC003); Проект «Двести талантов» Школы медицины Шанхайского университета Цзяо Тун; Совместный исследовательский проект Института биоматериалов и регенеративной медицины Шанхайского университета Цзяо Тун (2022LHB02); Проект Биобанка Шанхайской девятой народной больницы Шанхайского медицинского факультета Университета Цзяо Тун (YBKB201909, YBKB202216).
1x PBS | Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd. | P1020 | |
4% paraformaldehyde | Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd. | G1101 | |
Alizarin red | Sigma-Aldrich | A5533 | |
Anti-CTSK antibody | Santa Cruz | sc-48353 | |
Anti-OPN antibody | R&D Systems, Minneapolis, MN, USA | AF808 | |
Calcein | Sigma-Aldrich | C0875 | |
Closed-coil springs | Innovative Material and Devices, Shanghai, China | CS1006B | |
Col1α2CreERT2 mice | A gift from Bin Zhou, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences. | ||
Dexmedetomidine hydrochloride | Orionintie Corporation, Orion Pharma Espoo site | ||
EDTA | Beyotime Biotechanology | ST069 | |
Embedding tanks | Citotest Labware Manufacturing Co., Ltd | 80106-1100-16 | |
Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 100092183 | |
ImageJ software | NIH, Bethesda, MD, USA | ||
Mounting medium with DAPI | Beyotime Biotechanology | P0131 | |
Mouse dissection platform | Shanghai Huake Experimental Devices and Materials Co., Ltd. | HK105 | |
Paraffin | Sangon biotech Co., Ltd. | A601889 | |
Primers for genotyping | Stat3 F-TTGACCTGTGCTCCTACAAAAA; Stat3 R-CCCTAGATTAGGCCAGCACA; Cre F-CGATGCAACGAGTGATGAGG; Cre R-CGCATA ACCAGTGAAACAGC | ||
Protease K | Sigma-Aldrich | 539480 | |
Self-curing restorative resin | 3M ESPE, St. Paul, MN, USA | 712-035 | |
Stat3fl/fl mice | GemPharmatech Co., Ltd | D000527 | |
Tamoxifen | Sigma-Aldrich | T5648 | |
TRAP staining kit | Sigma-Aldrich | 387A | |
Tris-HCl | Beyotime Biotechanology | ST780 | |
Universal tissue fixative | Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd. | G1105 | |
Xylene | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 10023418 | |
Zoletil | VIRBAC |