Summary
在这里，我们提出了一种使用三维（3D）打印支架在小鼠或年轻大鼠中进行高效和快速电针（EA）的方案。该技术允许在多只动物身上同时操作，节省时间并提高实验效率。
Abstract
电针（EA）被广泛用于治疗各种健康状况。然而，EA治疗的潜在机制尚不清楚，阻碍了其推广。机理研究需要小鼠或大鼠模型来解决这个问题。然而，这些动物不服从实验过程，这很耗时。为了解决这些问题，我们设计了3D打印的小动物身体散装固定器，以提高EA动物实验的效率。该视频详细介绍了如何使用固定器对小鼠或年轻大鼠进行批量 EA。对于穴位的选择，选取顶点颞部（MS6头部）和天枢点（ST25腹部）的前斜线，验证俯卧位和仰卧位固定装置的效果。使用3D打印的小动物支架可以同时固定和治疗多个啮齿动物，从而减少实验所需的时间和资源。这种技术可以通过3D打印不同尺寸的动物模型应用于其他动物模型，并有可能用于各种固定条件。该设备有利于促进EA的实验科学研究。
Introduction
电针疗法是一种独特的方法，将针灸针插入头皮并连接到电机以刺激特定穴位 1。与手动刺激不同，EA 通过稳定特定频率和波形来更好地控制刺激，以实现最佳治疗效果2。据调查，中国81.2%的医疗机构使用EA或手针灸治疗脑瘫、神经痛、面瘫等疾病。尽管很受欢迎，但EA的具体疗效机制仍然未知，这阻碍了其在神经系统疾病康复治疗中的推广和应用1,2,3。需要进一步的研究来充分了解EA的有效性机制，并促进其在神经系统疾病康复治疗中的应用。
随着针灸在世界范围内的影响力不断扩大，许多研究已经研究了对啮齿动物模型（例如大鼠或小鼠模型）进行 EA 的机制 1,2,3。在EA的啮齿动物实验中经常会遇到几个问题。首先是如何在没有麻醉的情况下固定啮齿动物，因为对清醒受试者进行的针灸更能反映临床实践。此外，一些实验要求动物保持清醒以观察治疗效果2,3。另一个挑战是准确定位小鼠或大鼠的穴位，这些穴位与人类的穴位相对应。目前，许多学者正在研究实验啮齿动物穴位的精确定位4,5。在该协议中，选择了MS6和ST25，它们已通过人体解剖定位的转换在啮齿动物中明确定义。MS6 通常用于治疗某些脑部疾病，例如帕金森病6。ST25 通常用于治疗胃肠道问题，例如腹泻7.选择这两个穴位主要是为了展示如何在仰卧位和俯卧位上有效地固定啮齿动物。此外，这些穴位已被广泛研究，并为研究目的提供了重要的见解 6,7。
以前固定一只大鼠进行实验的方法不仅耗时，而且很难由一个人处理 8.此外，由于动物的不合作，在实践中成功率相对较低。因此，迫切需要创建一个易于建立的具有稳定特性的动物模型，以提高实验效率。在这篇文章中，介绍了一种用于小动物的3D打印支架，可以很容易地固定多只啮齿动物，导致运动受限。本文的目的是对一批年轻大鼠或小鼠进行EA治疗，重点研究小鼠批量限制、识别和刺激MS6和ST25穴位的策略。
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Protocol
本研究的实验符合动物伦理学的“3R”原则，并已获得陆军医科大学实验动物福利和民族委员会（AMUWEC20234543）的批准。
1.啮齿动物身体固定装置的制备
- 基于中国实用新型专利9设计一种小动物支架。
- 通过3D打印技术生产设备。
- 准备一根 2 m 长的绳子，分成 6 根绳子。将这 6 根绳索穿过固定器上的孔。利用弹簧加载扣固定绳索末端，便于调整环尺寸。
注意：固定器可以由任何配备基于设计图纸的 3D 打印技术的公司制造。该器件的设计图如 图1所示。本研究中使用的固定器是由 3D 打印机通过一种称为熔融沉积建模 （FDM） 的打印方法生产的，也称为熔融长丝制造 （FFF）10。这种增材制造方法通过选择性地将熔化形式的材料沉积在预定路径中，逐层打印设计的零件。该工艺使用长丝形式的热塑性聚合物来创造最终的物理结构。本研究中使用的固定装置可以同时固定三只动物，需要六根绳索，每只动物需要一对绳索：一根用于颈部，一根用于躯干。
2.啮齿动物的制备
- 购买3只Sprague-Dawley大鼠（10-40g，7-45日龄）和3只C57 BL / C小鼠（5-40g）。
- 在昼夜循环12小时，环境温度为21-23°C，湿度为45%-60%的房间内饲养动物。定期对饲养环境进行消毒通风，让动物自由进食、饮水。
3. 将啮齿动物固定在固定器上（俯卧位）
- 将啮齿动物的头部放在固定器前面的U形孔中，使啮齿动物处于俯卧位。将啮齿动物的身体穿过两个绳环。
- 将绳索系在啮齿动物的脖子和腹部，确保它不会逃脱，但不要太紧，以免引起呼吸窘迫和死亡。
- 关键步骤是将颈部固定到位。在啮齿动物的脖子和绳子之间留出 2-5 毫米的间隙。确保绳子不会太紧而无法勒死动物或太松而无法逃脱。
- 在设备中以相同的方式修复其他啮齿动物。
- 重复上述固定步骤（3.1-3.2）3天，以尽量减少固定过程引起的潜在应激反应。连续 3 天重复固定程序，每次持续 5 分钟。
注意：为确保啮齿动物在固定过程中不会过度紧张，我们连续 3 天重复该过程。每次治疗每天持续 5 分钟，为小鼠或大鼠提供充足的时间来适应该程序并最大限度地减少任何潜在的不适。 - 从第 4 天开始 Strat EA。
- 为防止疾病传播，请将无菌棉签或棉球浸入 75% 的酒精中，并在每次使用前后彻底擦拭支架以清洁和消毒。处理啮齿动物时，请使用手套和其他防护设备，以避免潜在的健康风险。
4. 在小鼠或年轻大鼠中执行 EA （MS6）
- 选择 0.25 mm x 13 mm 一次性无菌针灸针。
- 按解剖位置找到穴位，并确认穴位处的插入深度。
注意： MS6 位于头部的外侧。头部的这个区域穿过神聪（Ex-hn1）和玄里（GB6）之间的连接，也称为前顶叶（Du21）。MS6对应于头皮上大脑皮层中央前回的表达。Ex-hn1 位于头部前后中线中点后 0.5 cm 处。GB6位于耳朵前部的中点和眼睛的末端角。滑车上上神经、眶上神经、枕神经和耳颞神经分布在其中。MS6主要用于治疗中风和脑病，如运动障碍。 - 在3只啮齿动物中，从前申冲（Exhn1）到玄礼（GB6）沿皮下，分别在3/5深度处将双侧无菌针头拧入MS6。
- 将连接电缆的一侧连接到 EA 仪器。
- 将包含正负EA夹的连接电缆的另一侧连接到左右MS6上的针灸针柄。
- 打开 EA 仪器。
- 旋转按钮（功能/选择开关）设置频率和功能模式。
- 将 频率 设置为 10 Hz，然后选择 连续波 模式。
- 旋转相应的按钮（调整强度）以设置强度。每个调整强度按钮控制其下方连接的电线的啮齿动物的电流强度。将电流强度调整到啮齿动物可接受的范围，通常为 1-2 mA，持续 5 分钟。
注意： 在手术过程中监测啮齿动物的呼吸和行为非常重要，以确保它们不会感到任何痛苦或不适。如果大鼠似乎在挣扎或疼痛，则应立即停止该程序。
5. 将啮齿动物固定在固定器上（仰卧位）
- 将啮齿动物的头部放在固定器前面的U形孔中，使啮齿动物处于俯卧位。将啮齿动物的身体穿过两个绳环。
- 将绳子系在啮齿动物的脖子和腹部，确保它不会逃脱，但不要太紧以至于导致呼吸窘迫和死亡。
注意：固定过程中要注意的要点与步骤3.2相同。 - 以同样的方式修复其他啮齿动物。
- 与步骤3.4一样，重复上述固定步骤3天，以减少啮齿动物的应激反应。
- 从第 4 天开始 Strat EA。
注意： 按照步骤 3.6 中所述进行消毒。
6. 执行 EA （ST25）
- 选择 0.25 mm x 13 mm 一次性无菌针灸针。
- 按解剖位置找到穴位，并确认穴位处的插入深度。
注意： ST25 位于脐部水平。在啮齿动物中定位这个点需要首先测量啮齿动物爪子的长度。ST25 位于肚脐旁边爪子长度的 2/3。例如，如果测量的啮齿动物爪子为 0.6 cm，则 ST25 位于脐部左右 0.4 cm。 - 在3只啮齿动物上，分别以4-8mm的深度缓慢扭曲并穿透无菌针头进入ST25双侧。
- 将连接电缆的一侧连接到 EA 仪器。
- 将包含正负EA夹的连接电缆的另一侧连接到左右ST25的针灸针柄。
- 打开 EA 仪器。
- 旋转按钮（功能/选择开关）设置频率和功能模式。
- 将 频率 设置为 10 Hz，然后选择 连续波模式。
- 旋转相应的按钮（调整强度）以设置强度。每个调整强度按钮控制其下方连接的电线的老鼠的电流强度。将电流强度调整到啮齿动物可接受的范围，通常为 1-2 mA，持续 5 分钟。
注：观察结果与步骤4.6相同。
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Representative Results
我们设计的动物身体固定器的平面图如图1所示。此外，还提交了该固定器的 3D 图形模型，以提供设计的全面视图（补充文件 1）。这是一种允许 3 只啮齿动物固定并同时执行 EA 的设备。大鼠和小鼠在清醒状态下被限制在固定器内，俯卧位和仰卧位都可以牢固地固定，而不会对啮齿动物造成伤害（图2和图3）。在固定器的帮助下，MS6 和 ST25 穴位成功定位并在啮齿动物中针刺（图 4 和图 5）。
为了控制变量并验证这种固定方法的有效性，一名实验者在一项比较研究中连续三次试验固定了 3 只大鼠（视频 1）或 3 只小鼠（表 1）。结果表明，使用该工具将 3 只大鼠固定在俯卧位和仰卧位的平均时间分别为 77.1 秒± 7.8 秒和 74.9 秒± 8.6 秒（平均值±标准差）。对于3只小鼠，使用该固定器在俯卧位和仰卧位的平均固定时间分别为72.0 s±10.5 s和62.3 ± 4.2 s（平均值±标准差）。两组大鼠和小鼠都成功地固定在装置上，并且在5分钟的EA治疗期间没有逃逸（图2 和 图3）。在1-2 mA EA强度下，小鼠和大鼠感到舒适，没有剧烈挣扎。小鼠和大鼠呼吸稳定，动物无猝死。治疗后，小鼠和大鼠保持健康并存活。
图 1.批量啮齿动物固定器平面图。 （1）啮齿动物支架装置，分为三部分。（2,3）支柱：用于固定小鼠或幼鼠的四肢。（4）洞穴：用于固定头部。（5）孔：用于固定幼鼠的颈部。（6）孔：用于固定阀体。 请点击这里查看此图的较大版本.
图2：将年轻大鼠固定在俯卧位和仰卧位。 （A-C） MS6 穴位的 EA 治疗。（D-F）ST25 穴位的 EA 治疗。请点击这里查看此图的较大版本.
图3：将小鼠固定在俯卧位和仰卧位。 （A-C） MS6 穴位的 EA 治疗。（D-F）ST25 穴位的 EA 治疗。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4：大脑区域的 MS6。 MS6位于头部外侧，位于神聪（Ex-hn1）和玄礼（GB6）之间的连接点，也称为顶前（Du21）区。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 5：ST25 双侧点为红色。 ST25位于脐部水平。在啮齿动物中定位该点需要首先测量啮齿动物爪子的长度。ST25 位于肚脐旁边爪子长度的 2/3。例如，如果啮齿动物的测量爪是 0.6 厘米，那么 ST25 是脐左右 0.4 厘米。请点击这里查看此图的较大版本.
| 试验 | 大 鼠 | 小 鼠 | ||
| 俯卧位 | 仰卧位 | 俯卧位 | 仰卧位 | |
| （时间以秒为单位） | （时间以秒为单位） | （时间以秒为单位） | （时间以秒为单位） | |
| 试验 1 | 75.5 | 65.1 | 60.2 | 62.3 |
| 试验 2 | 70.2 | 80.3 | 80.1 | 70.6 |
| 试验 3 | 85.5 | 79.5 | 75.7 | 65.9 |
| 平均时间（标准差平均±） | 77.1 ± 7.8 | 74.9 ± 8.6 | 72.0 ± 10.5 | 62.3 ± 4.2 |
表1：固定俯卧位和仰卧位的大鼠和小鼠所花费的时间。 数据（以秒为单位的时间）由一名实验者获得，他分别固定了 3 只大鼠和 3 只小鼠进行连续 3 次试验。通过计算 3 项试验所用时间的平均值和标准差来确定所需的平均时间。
补充文件1：3D打印沐浴啮齿动物固定器设计文件。 可以拖动此 3D 模型以实现设计的完整 360° 视图。 请点击此处下载此文件。
视频1：年轻SD大鼠俯卧位和仰卧位固定的电影，如 图2 图例中详细描述。 该视频演示了实验者将 3 只大鼠束缚在仰卧位和俯卧位。 请按此下载此影片。
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Discussion
电针 （EA） 是一种针灸形式，涉及在针灸针上使用电刺激11。该技术涉及使用特定强度和频率的微脉冲电流来刺激穴位并达到增强的治疗效果3.然而，EA的愈合机制是有限的，需要大量的基础研究来证明1,2,3。啮齿动物模型通常用于基本的 EA 研究 8,12,13，我们旨在为在大鼠和小鼠中进行这些实验提供一种快速有效的方法。
目前，EA实验面临许多挑战。主要挑战是在没有麻醉的情况下有效地固定啮齿动物。动物的稳定固定至关重要，对动物实验的结果有重大影响。否则，麻醉动物的生理功能与清醒动物不同，临床针灸治疗总是对清醒患者进行。因此，对清醒动物的实验研究对于临床目的更为实用。以前，用固定板固定是首选方法，但它很耗时，并且只允许单个啮齿动物14的操作。传统的固定器还需要绑住啮齿动物的四肢，这是一个耗时的过程，并且经常因紧固而导致疼痛。一些研究已经为小鼠实施了胶带，但它们轻松逃脱的能力带来了重大挑战，尤其是在针灸过程中8.当实验对象较多时，往往需要批量操作，以节省时间和精力2.因此，我们开发了一种3D打印的小动物身体间歇式固定器，与传统固定方法相比，它具有几个优点15：1）缩短了固定时间，大大提高了实验效率16;2）简单易用，不受主观因素影响15,16;3）对啮齿动物的危害较小;4）一旦固定，EA操作可以同时在几只年轻大鼠身上进行，节省时间并允许同时观察治疗结果。
使用3D打印技术进行EA的实验研究是针灸研究领域的宝贵扩展。该设备在3D打印时可以调整到任何尺寸，这有助于更有效地进行实验针灸。熔融沉积建模（FDM），也称为熔融长丝制造（FFF），一种增材制造方法10，用于3D打印固定器。该设备不仅适用于该实验，也适用于对啮齿动物进行 CT 或 MRI 等实验17,18。此外，它还可以应用于任何需要批量固定的情况，但 EA 研究除外。由于3D打印技术的普及，这种设备很容易获得。它可以通过当地的3D打印制造商制造。此外，该固定装置可以根据设计图纸进行修改和定制。在这项研究中，固定装置由三个部分组成，每个部分能够固定单个啮齿动物。如果需要包括额外的啮齿动物或其他动物，可以按比例缩放设备以容纳更大的数量。例如，它可以设计为可以固定 5 只老鼠的装置，甚至可以设计为兔子等其他动物的固定装置。
另一个挑战是在啮齿动物身上找到与人类相对应的穴位。选择 MS6 和 ST25 穴位来检查俯卧位和仰卧位固定的效果。此外，许多学者已经研究了这两个穴位6,7,19。MS6最常用于脑部疾病研究，如帕金森病、脑卒中后功能障碍等6,13,19。MS6 可以通过调节先前研究中由 IL-12 介导的 JAK/STAT 信号通路来增强缺血性中风大鼠的神经功能13。ST25通常用于治疗胃肠道，如腹泻和肠易激综合征（IBS）7,12。先前的一项研究报告称，仅在 ST25 点施用 EA 显示出缓解内脏超敏反应的潜力，同时还能恢复 IBS 大鼠的正常慢波频率和结肠节律12。这两个穴位也能够适当地展示仰卧位和俯卧位对啮齿动物的影响。此外，这两个穴位具有显示6,7,19的意义。由于这两个穴位已被许多学者研究过，因此我们提供了如何在啮齿动物中定位这两个穴位的方案。它对正在进行 MS6 和 ST25 研究的动物实验很有帮助。然而，目前的研究有一些局限性。例如，针的位置和插入深度无法客观测量，并且可能会根据操作员的经验水平而有所不同。
我们的实验符合动物伦理学的“3R”原则，并已获得陆军医科大学实验动物福利和民族委员会的批准。该实验中最具挑战性和关键的一步是找到一种可靠有效的方法来安全地固定啮齿动物。这是因为在 5 分钟的 EA 刺激期间，任何啮齿动物逃跑或死亡的尝试都会导致实验失败。前洞的设计利用了啮齿动物对挖洞的偏好。将啮齿动物的头部放在洞穴内是为了提供心理安慰。此外，用于固定啮齿动物头部和身体的绳索应适度牢固，既不能过度松弛也不能过紧，以避免啮齿动物逃跑并防止呼吸窘迫。在电刺激之后，仔细监测啮齿动物的行为和反应。理想情况下，当施加 1-2 mA 的电流时，啮齿动物不会表现出积极的挣扎或发声来响应电击20。固定器还可用于将啮齿动物固定在仰卧位、俯卧位和其他类型的固定装置中。适用于多种实验需要，固定操作易于执行 21.然而，这导致了一个限制，即不同大小的动物需要量身定制的不同大小的固定设备。只有大小略有差异的动物才能使用相同的设备进行约束。该协议中使用的批量固定器有效可靠地固定在10-40g的重量范围内固定啮齿动物。对于超出此体重范围的动物，需要定制的批量固定器以满足其特定要求。
此外，用于啮齿动物批量 EA 操作的 3D 打印批量啮齿动物固定装置具有增强的安全性，因为它可以抵抗啮齿动物的划伤和咬伤。对啮齿动物的 EA 研究为这种治疗方式对人类的潜在益处提供了宝贵的见解 1,2,3,6,7,11,14。该设备有利于促进EA的实验科学研究。这种技术允许研究人员进行需要固定动物的动物实验。此外，它还提供了ST25和MS6的确切位置，可以作为未来研究这两个穴位的参考。最终，这种方法有望为EA研究带来有价值的动物模型。
本文中描述的3D打印间歇式小鼠固定器为在大鼠或小鼠中进行EA实验提供了一种简单有效的方法。它的设计考虑了动物的舒适性和安全性，以及快速有效固定的需要。该设备有可能节省进行动物实验的时间和精力，促进电针研究的进步，并最终为各种疾病提供更好的治疗。
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Disclosures
提交人声明不存在相互竞争的利益冲突。
Acknowledgments
感谢陆军医科大学第二附属医院神经外科的现场支持。资助：本研究由中国自然科学基金（82104696）资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D printing batch mice fixator | MESH INVENT | Custom made | The fixator produced by 3D printer. The printing method is called fused deposition modeling (FDM), also known as fused filament fabrication (FFF). |
| Electroacupuncture instrument | Hwato, Suzhou Medical Appliance Factory | SDZ-III | www.Hwato-med.com |
| Disposable sterile acupuncture needle | Suzhou Medical Appliance Factory | N/A | 0.25 mm x 13 mm |
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