Summary

Analyse der Mitochondrienfunktion in einer Drosophila melanogaster PINK1 B9-Null-Mutante mittels hochauflösender Respirometrie

Published: November 10, 2023
doi:

Summary

In dieser Arbeit stellen wir ein hochauflösendes Respirometrie-Protokoll zur Analyse der Bioenergetik in PINK1 B9-Null-mutierten Fruchtfliegen vor. Die Methode verwendet das SUIT-Protokoll (Substrate-Uncoupler-Inhibitor-Titration).

Abstract

Neurodegenerative Erkrankungen, einschließlich der Parkinson-Krankheit (PD), und zelluläre Störungen wie Krebs sind einige der Erkrankungen, die den Energiestoffwechsel stören und die mitochondrialen Funktionen beeinträchtigen. Mitochondrien sind Organellen, die sowohl den Energiestoffwechsel als auch zelluläre Prozesse steuern, die am Überleben und Tod von Zellen beteiligt sind. Aus diesem Grund können Ansätze zur Bewertung der mitochondrialen Funktion wichtige Erkenntnisse über zelluläre Zustände in pathologischen und physiologischen Prozessen liefern. In diesem Zusammenhang ermöglichen hochauflösende Respirometrie-Protokolle (HRR) die Bewertung der gesamten mitochondrialen Atmungskettenfunktion oder der Aktivität spezifischer mitochondrialer Komplexe. Darüber hinaus erfordert die Untersuchung der mitochondrialen Physiologie und Bioenergetik genetisch und experimentell handhabbare Modelle wie Drosophila melanogaster.

Dieses Modell bietet mehrere Vorteile, wie z. B. seine Ähnlichkeit mit der menschlichen Physiologie, seinen schnellen Lebenszyklus, seine einfache Wartung, seine Kosteneffizienz, seine hohe Durchsatzleistung und eine minimierte Anzahl ethischer Bedenken. Diese Eigenschaften machen es zu einem unschätzbaren Werkzeug zur Analyse komplexer zellulärer Prozesse. In der vorliegenden Arbeit wird erläutert, wie die Funktion der Mitochondrien mit Hilfe der Drosophila melanogaster PINK1 B9-null-Mutante analysiert werden kann. Das pink1-Gen ist für die Kodierung der PTEN-induzierten putativen Kinase 1 verantwortlich, und zwar durch einen Prozess, der als Mitophagie bezeichnet wird und für die Entfernung dysfunktionaler Mitochondrien aus dem mitochondrialen Netzwerk entscheidend ist. Mutationen in diesem Gen wurden mit einer autosomal-rezessiven, früh einsetzenden familiären Form der Parkinson-Krankheit in Verbindung gebracht. Dieses Modell kann verwendet werden, um die mitochondriale Dysfunktion zu untersuchen, die an der Pathophysiologie der Parkinson-Krankheit beteiligt ist.

Introduction

Mitochondrien sind zelluläre Organellen, die wichtige Funktionen steuern, darunter die apoptotische Regulation, die Kalziumhomöostase und die Beteiligung an Biosynthesewegen. Durch den Besitz von autonomem Erbgut sind sie in der Lage, zu zellulären Erhaltungs- und Reparaturprozessen beizutragen. Ihre Struktur beherbergt die Elektronentransportkette und die oxidative Phosphorylierung, die beide für die zelluläre Energie entscheidend sind 1,2,3. Insbesondere wird die Energiekontrolle durch die Produktion von Adenosintriphosphat (ATP) durch oxidative Phosphorylierung (OXPHOS)2 erreicht. Eine Störung des Energiestoffwechsels mit Beeinträchtigung der mitochondrialen Funktionen tritt sowohl beim Überleben als auch beim Tod der Zellen auf 4,5 und ist häufig mit einer Vielzahl von menschlichen Pathologien wie Krebs und neurodegenerativen Erkrankungen wie der Parkinson-Krankheit (PD) verbunden3,6.

Parkinson ist eine chronische, fortschreitende und neurologische Erkrankung. Die Hauptursache für diese Krankheit ist das Absterben von Gehirnzellen, insbesondere in der Substantia nigra, die für die Produktion des Neurotransmitters Dopamin verantwortlich sind, der die Bewegung steuert 6,7,8. Die früheste Beobachtung, die Parkinsonismus mit mitochondrialer Dysfunktion in Verbindung brachte, wurde 1988 in experimentellen Modellen gemacht, in denen Toxine verwendet wurden, die den Atmungskettenkomplex I9 hemmen.

Derzeit gibt es mehrere Methoden zur Bewertung der mitochondrialen Dysfunktion 10,11,12,1 3; Im Vergleich zu herkömmlichen Ansätzen bietet die hochauflösende Respirometrie (HRR) jedoch eine überlegene Sensitivität und Vorteile13,14. HRR-Protokolle ermöglichen beispielsweise die Bewertung der gesamten mitochondrialen Atmungskettenfunktion oder der Aktivität spezifischer mitochondrialer Komplexe 14,15. Mitochondriale Dysfunktionen können in intakten Zellen, isolierten Mitochondrien oder sogar ex vivo beurteilt werden 10,11,13,14.

Mitochondriale Dysfunktionen sind eng mit vielen pathologischen und physiologischen Prozessen verbunden. Daher ist es wichtig, die mitochondriale Physiologie und Bioenergetik mit Hilfe genetisch und experimentell behandelbarer Modellsysteme zu untersuchen. In dieser Hinsicht hat die Forschung an Drosophila melanogaster, der Fruchtfliege, mehrere Vorteile. Dieses Modell teilt grundlegende zelluläre Eigenschaften und Prozesse mit dem Menschen, einschließlich der Verwendung von DNA als genetischem Material, gemeinsamen Organellen und konservierten molekularen Signalwegen, die an der Entwicklung, der Immunität und der Zellsignalisierung beteiligt sind. Darüber hinaus haben Fruchtfliegen einen schnellen Lebenszyklus, eine einfache Wartung, niedrige Kosten, einen hohen Durchsatz und weniger ethische Bedenken, was sie zu einem unschätzbaren Werkzeug für die Analyse komplexer zellulärer Prozesse macht 16,17,18,19,20.

Darüber hinaus wird ein Homolog des PTEN-induzierten putativen Kinase-1-Gens (pink1) in D. melanogaster exprimiert. Es spielt eine entscheidende Rolle bei der Entfernung beschädigter Mitochondrien durch den Prozess der Mitophagie8. Beim Menschen prädisponieren Mutationen in diesem Gen Personen für eine autosomal-rezessive familiäre Form der Parkinson-Erkrankung, die mit einer mitochondrialen Dysfunktion assoziiertist 8,21,22,23. Folglich ist die Fruchtfliege ein leistungsfähiges Tiermodell für Studien zur Pathophysiologie von Parkinson und zum Screening von Wirkstoffkandidaten mit Schwerpunkt auf mitochondrialer Dysfunktion und Bioenergetik. Daher wird in der vorliegenden Arbeit erläutert, wie die mitochondriale Funktion in einem Modell der Parkinson-Krankheit von D. melanogaster unter Verwendung der HRR-Technik im OROBOROS mit dem Substrate-Uncoupler-Inhibitor-Titration (SUIT)-Protokoll analysiert werden kann.

Protocol

Wir verwendeten die Sorten w1118 (weiß) und w[*] Pink1[B9]/FM7i, P{w[+mC]=ActGFP}JMR3 (bezeichnet als Pink1B9) (FlyBase ID: FBgn0029891) aus dem Bloomington Drosophila Stock Center (ID-Nummer: 34749). In dieser Studie werden männliche D. melanogaster PINK1 B9-null-Mutanten mit männlichen D. melanogaster aus dem Stamm w1118 verglichen, der als Kontrollgruppe verwendet wird (genetischer Hintergrund). Andere Parameter müssen gleichz…

Representative Results

Hier zeigen wir, dass derO2-Fluss in den Zuständen OXPHOS CI (P = 0,0341) und OXPHOS CI&II (P = 0,0392) in PINK1B9 Nullfliegen im Vergleich zu Kontrollfliegen reduziert ist (Abbildung 4). Dieses Ergebnis wurde auch in früheren Befunden aus unserer Gruppe29,30 beobachtet. CI und CII sind Schlüsselkomponenten des Elektronentransportsystems (ETS), in dem CI …

Discussion

HRR ist eine leistungsstarke Technik zur Untersuchung der mitochondrialen Atmung und des Energiestoffwechsels in D. melanogaster und anderen Organismen. Es bietet eine detaillierte und quantitative Bewertung der mitochondrialen Funktion, die es den Forschern ermöglicht, Einblicke in die Bioenergetik der Zellen zu gewinnen. Das hier vorgestellte Protokoll beschreibt die Bewertung der Funktion der mitochondrialen Atmungskette und der Aktivität spezifischer mitochondrialer Komplexe unter Verwendung des SUIT-Proto…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren danken der brasilianischen Agentur Coordenação de Aperfeiçoamento de Pesquisa Pessoal de Nível Superior (CAPES EPIDEMIAS 09 #88887.505377/2020). P.M. (#88887.512821/2020-00) und T.D. (#88887.512883/2020-00) sind Stipendiaten.

Materials

ADP Sigma-Aldrich A5285 Adenosine 5′-diphosphate sodium sal (CAS number 72696-48-1); ≥95%; molecular weight = 501.31 g/mol.
Ágar Kasv K25-1800 For bacteriologal use
Antimycin-A Sigma-Aldrich A8674 Antimycin A from Streptomyces sp. (CAS number 1397-94-0); molecular weight  540 g/mol;
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A7030 Bovine Serum Albumin (CAS number 9048-46-8); pH 7,0 ≥ 98%
Datlab software Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria 20700 Software for data acquisition and analysis
Digitonin Sigma-Aldrich D 5628 CAS number 11024-24-1
Distilled water
Drosophila melanogaster strain w[*] Pink1[B9]/FM7i, P{w[+mC]=ActGFP}JMR3 Obtained from Bloomington Drosophila stock center
Drosophila melanogaster strain w1118 Obtained  from the Federal University of Santa Maria
EGTA Sigma-Aldrich E8145 Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (CAS number 13638-13-3); ≥97%; molecular weight =468.28 g/mol
FCCP Sigma-Aldrich C2920 Carbonyl cyanide 4- (trifluoromethoxy)phenylhydrazone  (CAS number 370-86-5); ≥98% (TLC), powder 
GraphPad Prism version 8.0.1. Software for data acquisition and analysis
Hepes Sigma-Aldrich H4034 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (CAS number 7365-45-9); ≥99,5% (titration), cell cultured tested; molecular weight = 238.30 g/mol
High-resolution respirometer Oxygraph O2K Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria 10022-02 Startup O2K respirometer kit
KH2PO4 Sigma-Aldrich P5379 Monopotassium phosphate (CAS number 7778-77-0); Reagente Plus, molecular weigt = 136.09 g/mol
KOH Sigma-Aldrich 211473 Potassium hydroxide (CAS number 1310-58-3); ACS reagent, ≥85%, pellets
Malate Sigma-Aldrich M1296 Malonic acid (CAS number 141-82-2); 99%, molecular weight = 104.06 g/mol). A solution is pH adjusted to approximately 7.0.
Malic acid Sigma-Aldrich M1000 (S)-(−)-2-Hydroxysuccinic acid (CAS number 97-67-6); ≥95% ; molecular weight = 134.09 g/mol
MES Sigma-Aldrich M3671 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (CAS number 4432-31-9); ≥99% (titration); molecular weight = 195.24 g/mol
MgCl2 Sigma-Aldrich M8266 Magnesium chloride (CAS number 7786-30-3); anhydrous, ≥98%, molecular weight = 95.21 g/mol
Microcentrifuge tubes Eppendorf
O2K-Titration Set Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria 20820-03 Hamilton syringes with different volumes
Oligomycin Sigma-Aldrich O 4876 Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes (CAS number  1404-19-9); ≥90% total oligomycins basis (HPLC)
Pistil to homogenization
Proline Sigma-Aldrich P0380 L-Proline (CAS number 147-85-3); powder; 99%; molecular weight = 115.13 g/mol
Pyruvate Sigma-Aldrich P2256 Sodium pyruvate (CAS number 113-24-6), ≥99%; molecular weight = 110.04 g/mol
Rotenone Sigma-Aldrich R8875 Rotetone (CAS number 83-79-4); ≥95%, molecular weight 394.42 g/ mol
Succinate Sigma-Aldrich S 2378 Sodium succinate dibasic hexahydrate (CAS number 6106-21-4); ≥99%
Sucrose Merck 107,651,000 Sucrose for microbiology use (CAS number 57-50-1)
Taurine Sigma-Aldrich T0625 CAS number 107-35-7

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Cite This Article
Michelotti, P., Duarte, T., Dalla Corte, C. L. Analyzing Mitochondrial Function in a Drosophila melanogaster PINK1B9-Null Mutant Using High-resolution Respirometry. J. Vis. Exp. (201), e65664, doi:10.3791/65664 (2023).

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