تحليل وظيفة الميتوكوندريا في ذبابة الفاكهة الميلانوجاستر PINK1B9-null الطافرة باستخدام قياس التنفس عالي الدقة
Summary
نقدم هنا بروتوكول قياس التنفس عالي الدقة لتحليل الطاقة الحيوية في ذباب الفاكهة الطافر PINK1B9-null. تستخدم الطريقة بروتوكول الركيزة – فك التوصيل – المثبط – المعايرة (SUIT).
Abstract
الأمراض التنكسية العصبية ، بما في ذلك مرض باركنسون (PD) ، والاضطرابات الخلوية مثل السرطان هي بعض الاضطرابات التي تعطل استقلاب الطاقة مع ضعف وظائف الميتوكوندريا. الميتوكوندريا عضيات تتحكم في كل من استقلاب الطاقة والعمليات الخلوية المشاركة في بقاء الخلايا وموتها. لهذا السبب ، يمكن أن تقدم طرق تقييم وظيفة الميتوكوندريا رؤى مهمة حول الحالات الخلوية في العمليات المرضية والفسيولوجية. في هذا الصدد ، تسمح بروتوكولات قياس التنفس عالية الدقة (HRR) بتقييم وظيفة السلسلة التنفسية للميتوكوندريا بأكملها أو نشاط مجمعات الميتوكوندريا المحددة. علاوة على ذلك ، تتطلب دراسة فسيولوجيا الميتوكوندريا وعلم الطاقة الحيوية نماذج قابلة للتتبع وراثيا وتجريبيا مثل ذبابة الفاكهة الميلانوجاستر.
يقدم هذا النموذج العديد من المزايا ، مثل تشابهه مع علم وظائف الأعضاء البشرية ، ودورة حياته السريعة ، وسهولة الصيانة ، والفعالية من حيث التكلفة ، وقدرات الإنتاجية العالية ، وتقليل عدد المخاوف الأخلاقية. هذه السمات تؤسسها بشكل جماعي كأداة لا تقدر بثمن لتشريح العمليات الخلوية المعقدة. يشرح العمل الحالي كيفية تحليل وظيفة الميتوكوندريا باستخدام ذبابة الفاكهة الميلانوجاستر PINK1B9-null الطافرة. الجين pink1 مسؤول عن تشفير كيناز 1 المفترض الناجم عن PTEN ، من خلال عملية تعرف باسم mitophagy ، وهو أمر بالغ الأهمية لإزالة الميتوكوندريا المختلة وظيفيا من شبكة الميتوكوندريا. ارتبطت الطفرات في هذا الجين بشكل وراثي جسدي متنحي مبكر من مرض باركنسون. يمكن استخدام هذا النموذج لدراسة خلل الميتوكوندريا المتضمن في الفيزيولوجيا المرضية لمرض باركنسون.
Introduction
الميتوكوندريا عضيات خلوية تتحكم في وظائف مهمة، بما في ذلك التنظيم المبرمج، وتوازن الكالسيوم، والمشاركة في مسارات التخليق الحيوي. من خلال امتلاك مادة وراثية مستقلة ، فهي قادرة على المساهمة في عمليات الصيانة والإصلاح الخلوية. يحتوي هيكلها على سلسلة نقل الإلكترون والفسفرة التأكسدية ، وكلاهما ضروري للطاقة الخلوية1،2،3. على وجه الخصوص ، يتم تحقيق التحكم في الطاقة من خلال إنتاج أدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) عن طريق الفسفرة التأكسدية (OXPHOS) 2. يحدث اضطراب استقلاب الطاقة مع ضعف وظائف الميتوكوندريا في كل من بقاء الخلية وموتها 4,5 ، وغالبا ما يرتبط بمجموعة واسعة من الأمراض البشرية ، مثل السرطان ، والأمراض التنكسية العصبية مثل مرض باركنسون (PD)3,6.
PD هو اضطراب مزمن وتقدمي وعصبي. السبب الرئيسي لهذا المرض هو موت خلايا المخ ، وخاصة في المادة السوداء ، المسؤولة عن إنتاج الناقل العصبي الدوبامين ، الذي يتحكم في الحركة6،7،8. تم إجراء أول ملاحظة تربط الشلل الرعاش بخلل الميتوكوندريا في عام 1988 ، في نماذج تجريبية باستخدام السموم التي تمنع السلسلة التنفسية ComplexI 9.
حاليا ، هناك عدة طرق لتقييم ضعف الميتوكوندريا10،11،12،13 ؛ ومع ذلك ، بالمقارنة مع الأساليب التقليدية ، فإن قياس التنفس عالي الدقة (HRR) يقدم حساسية ومزايا فائقة13,14. على سبيل المثال ، تسمح بروتوكولات HRR بتقييم وظيفة السلسلة التنفسية للميتوكوندريا بأكملها أو نشاط مجمعات الميتوكوندريا المحددة14,15. يمكن تقييم اختلالات الميتوكوندريا في الخلايا السليمة أو الميتوكوندريا المعزولة أو حتى خارج الجسم الحي10،11،13،14.
ترتبط اختلالات الميتوكوندريا ارتباطا وثيقا بالعديد من العمليات المرضية والفسيولوجية. لذلك من المهم دراسة فسيولوجيا الميتوكوندريا والطاقة الحيوية باستخدام أنظمة نموذجية قابلة للتتبع وراثيا وتجريبيا. في هذا الصدد ، فإن البحث عن ذبابة الفاكهة ، ذبابة الفاكهة ، له العديد من المزايا. يشترك هذا النموذج في الخصائص والعمليات الخلوية الأساسية مع البشر ، بما في ذلك استخدام الحمض النووي كمادة وراثية ، وعضيات مشتركة ، ومسارات جزيئية محفوظة تشارك في التطور والمناعة وإشارات الخلية. بالإضافة إلى ذلك ، تتمتع ذباب الفاكهة بدورة حياة سريعة ، وسهولة الصيانة ، وتكلفة منخفضة ، وإنتاجية عالية ، ومخاوف أخلاقية أقل ، مما يشكل أداة لا تقدر بثمن لتشريح العمليات الخلوية المعقدة16،17،18،19،20.
علاوة على ذلك ، يتم التعبير عن متماثل جين كيناز 1 (الوردي 1) الناجم عن PTEN في D. melanogaster. يلعب دورا حاسما في إزالة الميتوكوندريا التالفة من خلال عملية الميتوفاجي8. في البشر ، تهيئ الطفرات في هذا الجين الأفراد لشكل عائلي جسمي متنحي من مرض باركنسون المرتبط بخلل الميتوكوندريا8،21،22،23. وبالتالي ، فإن ذبابة الفاكهة هي نموذج حيواني قوي للدراسات حول الفيزيولوجيا المرضية لمرض باركنسون وفحص الأدوية المرشحة التي تركز على خلل الميتوكوندريا والطاقة الحيوية. لذلك ، يشرح العمل الحالي كيفية تحليل وظيفة الميتوكوندريا في نموذج PD من D. melanogaster باستخدام تقنية HRR في OROBOROS مع بروتوكول Substrate-Uncoupler-Inhibitor-Titration (SUIT).
Protocol
Representative Results
Discussion
HRR هي تقنية قوية لدراسة تنفس الميتوكوندريا واستقلاب الطاقة في D. melanogaster والكائنات الحية الأخرى. يوفر تقييما مفصلا وكميا لوظيفة الميتوكوندريا ، مما يسمح للباحثين باكتساب نظرة ثاقبة على الطاقة الحيوية للخلايا. يصف البروتوكول المقدم هنا تقييم وظيفة السلسلة التنفسية للميتوكوندريا ونشا?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يعترف المؤلفون بالوكالة البرازيلية Coordenação de Aperfeiçoamento de Pesquisa Pessoal de Nível Superior (CAPES EPIDEMIAS 09 # 88887.505377/2020). P.M. (# 88887.512821 / 2020-00) و T.D. (# 88887.512883 / 2020-00) هم من المستفيدين من الزمالة البحثية.
Materials
| ADP | Sigma-Aldrich | A5285 | Adenosine 5′-diphosphate sodium sal (CAS number 72696-48-1); ≥95%; molecular weight = 501.31 g/mol. |
| Ágar | Kasv | K25-1800 | For bacteriologal use |
| Antimycin-A | Sigma-Aldrich | A8674 | Antimycin A from Streptomyces sp. (CAS number 1397-94-0); molecular weight 540 g/mol; |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7030 | Bovine Serum Albumin (CAS number 9048-46-8); pH 7,0 ≥ 98% |
| Datlab software | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 20700 | Software for data acquisition and analysis |
| Digitonin | Sigma-Aldrich | D 5628 | CAS number 11024-24-1 |
| Distilled water | |||
| Drosophila melanogaster strain w[*] Pink1[B9]/FM7i, P{w[+mC]=ActGFP}JMR3 | Obtained from Bloomington Drosophila stock center | ||
| Drosophila melanogaster strain w1118 | Obtained from the Federal University of Santa Maria | ||
| EGTA | Sigma-Aldrich | E8145 | Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (CAS number 13638-13-3); ≥97%; molecular weight =468.28 g/mol |
| FCCP | Sigma-Aldrich | C2920 | Carbonyl cyanide 4- (trifluoromethoxy)phenylhydrazone (CAS number 370-86-5); ≥98% (TLC), powder |
| GraphPad Prism version 8.0.1. | Software for data acquisition and analysis | ||
| Hepes | Sigma-Aldrich | H4034 | 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (CAS number 7365-45-9); ≥99,5% (titration), cell cultured tested; molecular weight = 238.30 g/mol |
| High-resolution respirometer Oxygraph O2K | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 10022-02 | Startup O2K respirometer kit |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5379 | Monopotassium phosphate (CAS number 7778-77-0); Reagente Plus, molecular weigt = 136.09 g/mol |
| KOH | Sigma-Aldrich | 211473 | Potassium hydroxide (CAS number 1310-58-3); ACS reagent, ≥85%, pellets |
| Malate | Sigma-Aldrich | M1296 | Malonic acid (CAS number 141-82-2); 99%, molecular weight = 104.06 g/mol). A solution is pH adjusted to approximately 7.0. |
| Malic acid | Sigma-Aldrich | M1000 | (S)-(−)-2-Hydroxysuccinic acid (CAS number 97-67-6); ≥95% ; molecular weight = 134.09 g/mol |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (CAS number 4432-31-9); ≥99% (titration); molecular weight = 195.24 g/mol |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | Magnesium chloride (CAS number 7786-30-3); anhydrous, ≥98%, molecular weight = 95.21 g/mol |
| Microcentrifuge tubes | Eppendorf | ||
| O2K-Titration Set | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 20820-03 | Hamilton syringes with different volumes |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | O 4876 | Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes (CAS number 1404-19-9); ≥90% total oligomycins basis (HPLC) |
| Pistil to homogenization | |||
| Proline | Sigma-Aldrich | P0380 | L-Proline (CAS number 147-85-3); powder; 99%; molecular weight = 115.13 g/mol |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | Sodium pyruvate (CAS number 113-24-6), ≥99%; molecular weight = 110.04 g/mol |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | Rotetone (CAS number 83-79-4); ≥95%, molecular weight 394.42 g/ mol |
| Succinate | Sigma-Aldrich | S 2378 | Sodium succinate dibasic hexahydrate (CAS number 6106-21-4); ≥99% |
| Sucrose | Merck | 107,651,000 | Sucrose for microbiology use (CAS number 57-50-1) |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | CAS number 107-35-7 |
References
- Brand, M. D., Orr, A. L., Perevoshchikova, I. V., Quinlan, C. L. The role mitochondrial function and cellular bioenergetics in ageing and disease. Br J Dermatol. 169, 1-8 (2013).
- Ramaccini, D., et al. Mitochondrial function and dysfunction in dilated cardiomyopathy. Front Cell Dev Biol. 8, 624216 (2021).
- Zhunina, O. A., et al. The role of mitochondrial dysfunction in vascular disease, tumorigenesis, and diabetes. Front Mol Biosci. 8, 671908 (2021).
- Prasun, P. Mitochondrial dysfunction in metabolic syndrome. Biochim Biophys Acta. 1866 (10), 165838 (2020).
- Bhatti, J. S., Bhatti, G. K., Reddy, P. H. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in metabolic disorders – A Step towards mitochondria based therapeutic strategies. Biochim Biophys Acta. 1863 (5), 1066-1077 (2017).
- Perier, C., Vila, M. Mitochondrial biology and Parkinson’s disease. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (2), 009332 (2012).
- DeMaagd, G., Philip, A. Parkinson’s disease and its management. Pharmacy and Therapeutics. 40 (8), 504-532 (2015).
- Miyazaki, N., et al. PINK1-dependent and Parkin-independent mitophagy is involved in reprogramming of glycometabolism in pancreatic cancer cells. Biochem Biophys Res Commun. 625, 167-173 (2022).
- Kopin, I. J., Markey, S. P. MPTP toxicity: implications for research in Parkinson’s disease. Annual Review of Neuroscience. 11, 81-96 (1988).
- Connolly, N. M. C., et al. Guidelines on experimental methods to assess mitochondrial dysfunction in cellular models of neurodegenerative diseases. Cell Death Differ. 25 (3), 542-572 (2018).
- Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochem J. 435, 297-312 (2011).
- Haynes, C. M., Fiorese, C. J., Lin, Y. -. F. Evaluating and responding to mitochondrial dysfunction: The UPRmt and beyond. Trends Cell Mol Biol. 23 (7), 311-318 (2013).
- Long, Q., Huang, L., Huang, K., Yang, Q. Assessing mitochondrial bioenergetics in isolated mitochondria from mouse heart tissues using oroboros 2k-oxygraph. Methods Mol Biol. 1966, 237-246 (2019).
- Scheiber, D., et al. High-resolution respirometry in human endomyocardial biopsies shows reduced ventricular oxidative capacity related to heart failure. Exp Mol Med. 51 (2), 1-10 (2019).
- Krumschnabel, G., Eigentler, A., Fasching, M., Gnaiger, E. Chapter nine – use of safranin for the assessment of mitochondrial membrane potential by high-resolution respirometry and fluorometry. Methods Enzymol. 542, 163-181 (2014).
- Demir, E. The potential use of Drosophila as an in vivo model organism for COVID-19-related research: a review. Turk J Biol. 45 (4), 559-569 (2021).
- Hales, K. G., Korey, C. A., Larracuente, A. M., Roberts, D. M. Genetics on the fly: a primer on the Drosophila model system. Genetics. 201 (3), 815-842 (2015).
- McBride, S. M. J., Holloway, S. L., Jongens, T. A. Using Drosophila as a tool to identify pharmacological therapies for fragile X syndrome. Drug Discov Today Technol Technologies. 10 (1), e129-e136 (2013).
- Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. Methods for studying metabolism in Drosophila. Methods (San Diego, Calif). 68 (1), 105-115 (2014).
- Bar, S., Prasad, M., Datta, R. Neuromuscular degeneration and locomotor deficit in a Drosophila model of mucopolysaccharidosis VII is attenuated by treatment with resveratrol). Dis Model Mech. 11 (11), (2018).
- Imai, Y. PINK1-Parkin signaling in Parkinson’s disease: Lessons from Drosophila. Neurosci Res. 159, 40-46 (2020).
- Julienne, H., Buhl, E., Leslie, D. S., Hodge, J. J. L. Drosophila PINK1 and parkin loss-of-function mutants display a range of non-motor Parkinson’s disease phenotypes. Neurobiol Dis. 104, 15-23 (2017).
- Biswas, S., Bagchi, A. Analysis of the structural dynamics of the mutations in the kinase domain of PINK1 protein associated with Parkinson’s disease. Gene. 857, 147183 (2023).
- Koh, H., Chung, J. PINK1 and Parkin to control mitochondria remodeling. Anat Cell Biol. 43 (3), 179-184 (2010).
- Zhu, M., Li, X., Tian, X., Wu, C. Mask loss-of-function rescues mitochondrial impairment and muscle degeneration of Drosophila pink1 and parkin mutants. Hum Mol Genet. 24 (11), 3272-3285 (2015).
- Park, J., et al. Mitochondrial dysfunction in Drosophila PINK1 mutants is complemented by parkin. Nature. 441 (7097), 1157-1161 (2006).
- Dytham, C. . Choosing and using statistics: a biologist’s guide. , (2011).
- Bonora, M., et al. ATP synthesis and storage. Purinergic Signal. 8 (3), 343-357 (2012).
- Gonçalves, D. F., et al. Caffeine improves mitochondrial function in PINK1B9-null mutant Drosophila melanogaster. J Bioenerg Biomembr. 55 (1), 1-13 (2023).
- Gonçalves, D. F., et al. Mitochondrial function and cellular energy maintenance during aging in a Drosophila melanogaster model of Parkinson disease. Mitochondrion. 65, 166-175 (2022).
- Janowska, J. I., et al. Mitochondrial respiratory chain complex I dysfunction induced by N-methyl carbamate ex vivo can be alleviated with a cell-permeable succinate prodrug. Toxicol In Vitro. 65, 104794 (2020).
- Ngo, D. T. M., et al. Oxidative modifications of mitochondrial complex II are associated with insulin resistance of visceral fat in obesity. Physiol Endocrinol Metab. 316 (2), E168-E177 (2019).
- Stroud, D. A., et al. Accessory subunits are integral for assembly and function of human mitochondrial complex I. Nature. 538 (7623), 123-126 (2016).
- Senyilmaz, D., et al. Regulation of mitochondrial morphology and function by stearoylation of TFR1. Nature. 525 (7567), 124-128 (2015).
- Poddighe, S., et al. Mucuna pruriens (Velvet bean) rescues motor, olfactory, mitochondrial and synaptic impairment in PINK1B9 Drosophila melanogaster genetic model of Parkinson’s disease. PloS One. 9 (10), e110802 (2014).
- Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Methods Mol Biol (Clifton, N.J). 810, 25-58 (2012).
- Winer, L. S. P., Wu, M. Rapid analysis of glycolytic and oxidative substrate flux of cancer cells in a microplate. PloS One. 9 (10), e109916 (2014).
- Plitzko, B., Loesgen, S. Measurement of oxygen consumption rate (OCR) and extracellular acidification rate (ECAR) in culture cells for assessment of the energy metabolism. Bio Protoc. 8 (10), e2850 (2018).
- Wu, M., et al. Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells. Am J Physiol. Cell Physiol. 292 (1), C125-C136 (2007).
- Divakaruni, A. S., Jastroch, M. A practical guide for the analysis, standardization and interpretation of oxygen consumption measurements. Nat Metab. 4 (8), 978-994 (2022).
- Bingol, B., Sheng, M. Mechanisms of mitophagy: PINK1, Parkin, USP30 and beyond. Free Radic Biol Med. 100, 210-222 (2016).
