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Biochemistry

Analisando a função mitocondrial em um mutanteB9-nulo de Drosophila melanogaster PINK1 usando respirometria de alta resolução

Published: November 10, 2023
doi:
10.3791/65664
, ,
1Laboratory of Experimental Biochemistry and Toxicology, Department of Biochemistry and Molecular Biology, Center of Natural and Exact Sciences,Federal University of Santa Maria, 2Graduate Program in Biological Sciences: Toxicological Biochemistry,Federal University of Santa Maria

Summary

Apresentamos aqui um protocolo de respirometria de alta resolução para análise bioenergética em mutantes PINK1B9-null. O método utiliza o protocolo Substrate-Uncoupler-Inhibitor-Titration (SUIT).

Abstract

Doenças neurodegenerativas, incluindo a doença de Parkinson (DP), e distúrbios celulares, como o câncer, são alguns dos distúrbios que interrompem o metabolismo energético com comprometimento das funções mitocondriais. As mitocôndrias são organelas que controlam tanto o metabolismo energético quanto os processos celulares envolvidos na sobrevivência e morte celular. Por esta razão, abordagens para avaliar a função mitocondrial podem oferecer informações importantes sobre as condições celulares em processos patológicos e fisiológicos. Nesse sentido, protocolos de respirometria de alta resolução (HRR) permitem avaliar toda a função da cadeia respiratória mitocondrial ou a atividade de complexos mitocondriais específicos. Além disso, o estudo da fisiologia mitocondrial e da bioenergética requer modelos geneticamente e experimentalmente tratáveis, como Drosophila melanogaster.

Esse modelo apresenta várias vantagens, como sua semelhança com a fisiologia humana, seu rápido ciclo de vida, fácil manutenção, custo-benefício, alta capacidade de rendimento e um número minimizado de preocupações éticas. Esses atributos coletivamente o estabelecem como uma ferramenta inestimável para dissecar processos celulares complexos. O presente trabalho explica como analisar a função mitocondrial utilizando o mutante Drosophila melanogaster PINK1 B9-null. O gene pink1 é responsável por codificar a putativa quinase 1 induzida por PTEN, através de um processo reconhecido como mitofagia, que é crucial para a remoção de mitocôndrias disfuncionais da rede mitocondrial. Mutações nesse gene têm sido associadas a uma forma familiar autossômica recessiva de início precoce da DP. Esse modelo pode ser utilizado para estudar as disfunções mitocondriais envolvidas na fisiopatologia da DP.

Introduction

As mitocôndrias são organelas celulares que controlam funções importantes, incluindo regulação apoptótica, homeostase do cálcio e participação em vias biossintéticas. Por possuírem material genético autônomo, são capazes de contribuir para os processos de manutenção e reparo celular. Sua estrutura abriga a cadeia de transporte de elétrons e a fosforilação oxidativa, ambas cruciais para a energia celular 1,2,3. Em particular, o controle energético é obtido através da produção de adenosina trifosfato (ATP) via fosforilação oxidativa (OXPHOS)2. A interrupção do metabolismo energético com comprometimento das funções mitocondriais ocorre tanto na sobrevivência quanto na mortecelular4,5, frequentemente associada a uma ampla gama de patologias humanas, como o câncer, e doenças neurodegenerativas, como a Doença de Parkinson (DP)3,6.

A DP é uma doença crônica, progressiva e neurológica. A causa primária dessa doença é a morte das células cerebrais, principalmente da substância negra, responsáveis pela produção do neurotransmissor dopamina, que controla o movimento 6,7,8. A primeira observação que ligava o parkinsonismo à disfunção mitocondrial foi feita em 1988, em modelos experimentais utilizando toxinas inibidoras da cadeia respiratória do Complexo I9.

Atualmente, existem vários métodos para avaliar a disfunção mitocondrial 10,11,12,1 3; no entanto, comparada às abordagens convencionais, a respirometria de alta resolução (FCR) apresenta sensibilidade e vantagens superiores 13,14. Por exemplo, protocolos de FCR permitem avaliar toda a função da cadeia respiratória mitocondrial ou a atividade de complexos mitocondriais específicos14,15. As disfunções mitocondriais podem ser avaliadas em células intactas, mitocôndrias isoladas ou mesmo ex vivo 10,11,13,14.

As disfunções mitocondriais estão intimamente associadas a muitos processos patológicos e fisiológicos. Portanto, é importante estudar a fisiologia mitocondrial e a bioenergética usando sistemas modelo geneticamente e experimentalmente tratáveis. Nesse sentido, a pesquisa sobre Drosophila melanogaster, a mosca-da-fruta, tem várias vantagens. Esse modelo compartilha características e processos celulares fundamentais com humanos, incluindo o uso de DNA como material genético, organelas comuns e vias moleculares conservadas envolvidas no desenvolvimento, imunidade e sinalização celular. Além disso, as moscas-das-frutas apresentam ciclo de vida rápido, fácil manutenção, baixo custo, alto rendimento e menos preocupações éticas, constituindo-se em uma ferramenta valiosa para dissecar processos celulares complexos 16,17,18,19,20.

Além disso, um homólogo do gene putativo quinase 1 (pink1) induzido por PTEN é expresso em D. melanogaster. Desempenha um papel crucial na remoção de mitocôndrias danificadas através do processo de mitofagia8. Em humanos, mutações nesse gene predispõem a uma forma familiar autossômica recessiva de DP associada à disfunção mitocondrial 8,21,22,23. Consequentemente, a mosca-da-fruta é um poderoso modelo animal para estudos sobre a fisiopatologia da DP e triagem de candidatos a fármacos com foco na disfunção mitocondrial e bioenergética. Portanto, o presente trabalho explica como analisar a função mitocondrial em um modelo de DP de D. melanogaster utilizando a técnica de HRR no OROBOROS com o protocolo Substrate-Uncoupler-Inhibitor-Titration (SUIT).

Protocol

Foram utilizadas as cepas w1118 (branca) e w[*] Pink1[B9]/FM7i, P{w[+mC]=ActGFP}JMR3 (referida como Pink1B9) (FlyBase ID: FBgn0029891) do centro de estoque Bloomington Drosophila (número de identificação: 34749). Neste estudo, mutantes machos de D. melanogasterPINK1 B9-null são comparados com machos de D. melanogaster da cepa w1118, que é usada como grupo controle (background genético). Outros parâmetros devem ser analisados c…

Representative Results

Aqui, nós que o fluxo de O2 nos estados OXPHOS CI (P = 0,0341) e OXPHOS CI&II (P = 0,0392) é reduzido em moscas nulas PINK1B9 quando comparado com moscas controle (Figura 4). Esse resultado também foi observado em achados anteriores do nosso grupo 29,30. CI e CII são componentes-chave do sistema de transporte de elétrons (ETS), no qual o CI é responsá…

Discussion

A HRR é uma técnica poderosa para estudar a respiração mitocondrial e o metabolismo energético em D. melanogaster e outros organismos. Ele fornece uma avaliação detalhada e quantitativa da função mitocondrial, permitindo que os pesquisadores obtenham informações sobre a bioenergética das células. O protocolo aqui apresentado descreve a avaliação da função da cadeia respiratória mitocondrial e da atividade de complexos mitocondriais específicos utilizando o protocolo SUIT em D. melanogaster…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores agradecem à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pesquisa Pessoal de Nível Superior (CAPES EPIDEMIAS 09 #88887.505377/2020). P.M. (#88887.512821/2020-00) e T.D. (#88887.512883/2020-00) são bolsistas de pesquisa.

Materials

ADP Sigma-Aldrich A5285 Adenosine 5′-diphosphate sodium sal (CAS number 72696-48-1); ≥95%; molecular weight = 501.31 g/mol.
Ágar Kasv K25-1800 For bacteriologal use
Antimycin-A Sigma-Aldrich A8674 Antimycin A from Streptomyces sp. (CAS number 1397-94-0); molecular weight  540 g/mol;
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A7030 Bovine Serum Albumin (CAS number 9048-46-8); pH 7,0 ≥ 98%
Datlab software Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria 20700 Software for data acquisition and analysis
Digitonin Sigma-Aldrich D 5628 CAS number 11024-24-1
Distilled water
Drosophila melanogaster strain w[*] Pink1[B9]/FM7i, P{w[+mC]=ActGFP}JMR3 Obtained from Bloomington Drosophila stock center
Drosophila melanogaster strain w1118 Obtained  from the Federal University of Santa Maria
EGTA Sigma-Aldrich E8145 Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (CAS number 13638-13-3); ≥97%; molecular weight =468.28 g/mol
FCCP Sigma-Aldrich C2920 Carbonyl cyanide 4- (trifluoromethoxy)phenylhydrazone  (CAS number 370-86-5); ≥98% (TLC), powder 
GraphPad Prism version 8.0.1. Software for data acquisition and analysis
Hepes Sigma-Aldrich H4034 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (CAS number 7365-45-9); ≥99,5% (titration), cell cultured tested; molecular weight = 238.30 g/mol
High-resolution respirometer Oxygraph O2K Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria 10022-02 Startup O2K respirometer kit
KH2PO4 Sigma-Aldrich P5379 Monopotassium phosphate (CAS number 7778-77-0); Reagente Plus, molecular weigt = 136.09 g/mol
KOH Sigma-Aldrich 211473 Potassium hydroxide (CAS number 1310-58-3); ACS reagent, ≥85%, pellets
Malate Sigma-Aldrich M1296 Malonic acid (CAS number 141-82-2); 99%, molecular weight = 104.06 g/mol). A solution is pH adjusted to approximately 7.0.
Malic acid Sigma-Aldrich M1000 (S)-(−)-2-Hydroxysuccinic acid (CAS number 97-67-6); ≥95% ; molecular weight = 134.09 g/mol
MES Sigma-Aldrich M3671 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (CAS number 4432-31-9); ≥99% (titration); molecular weight = 195.24 g/mol
MgCl2 Sigma-Aldrich M8266 Magnesium chloride (CAS number 7786-30-3); anhydrous, ≥98%, molecular weight = 95.21 g/mol
Microcentrifuge tubes Eppendorf
O2K-Titration Set Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria 20820-03 Hamilton syringes with different volumes
Oligomycin Sigma-Aldrich O 4876 Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes (CAS number  1404-19-9); ≥90% total oligomycins basis (HPLC)
Pistil to homogenization
Proline Sigma-Aldrich P0380 L-Proline (CAS number 147-85-3); powder; 99%; molecular weight = 115.13 g/mol
Pyruvate Sigma-Aldrich P2256 Sodium pyruvate (CAS number 113-24-6), ≥99%; molecular weight = 110.04 g/mol
Rotenone Sigma-Aldrich R8875 Rotetone (CAS number 83-79-4); ≥95%, molecular weight 394.42 g/ mol
Succinate Sigma-Aldrich S 2378 Sodium succinate dibasic hexahydrate (CAS number 6106-21-4); ≥99%
Sucrose Merck 107,651,000 Sucrose for microbiology use (CAS number 57-50-1)
Taurine Sigma-Aldrich T0625 CAS number 107-35-7
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References

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Michelotti, P., Duarte, T., Dalla Corte, C. L. Analyzing Mitochondrial Function in a Drosophila melanogaster PINK1B9-Null Mutant Using High-resolution Respirometry. J. Vis. Exp. (201), e65664, doi:10.3791/65664 (2023).
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