Knockdown av FAM83A for å verifisere sin rolle i cellevekst av livmorhalskreft og cisplatinfølsomhet

Summary

Her viser vi prosedyrene for FAM83A knockdown; analysene for å oppdage dens effekter på spredning, migrasjon og invasjon av livmorhalskreftceller; og sensibilisering av disse cellene til cisplatin. Denne studien gir et lovende målgen for livmorhalskreft og en referanse for videre legemiddelforskning.

Abstract

Utforskningen av tumormålgener har avgjørende betydning for forebygging og behandling av livmorhalskreft. I denne studien skisserer vi trinnene som er involvert i identifiseringen av et tumormålgen FAM83A i livmorhalskreft. Først ble Cancer Genome Atlas-datasettet ansatt for å validere uttrykket og den prognostiske betydningen av FAM83A hos kvinner. Et lite forstyrrende RNA (siRNA) ble brukt til nedslag av FAM83A-genet i HeLa- og C33a-celler . Deretter ble 5-etynyl-2′-deoksyuridin (EdU) farging utført for å bestemme effektene på tumorcellens proliferasjonsevne. Sårheling og porøse membraninnsatsanalyser ble utført for å evaluere tumorcellemigrasjon og invasjonsevner.

Vestlig blotting ble brukt til å kvantifisere apoptoserelaterte proteinnivåer. JC-1-farging ble brukt til å evaluere mitokondrielle funksjonsendringer. Videre ble cisplatinintervensjon (diamindikloroplatinum, DDP) brukt for å vurdere det terapeutiske potensialet til målgenet. Flowcytometri og kolonidannelsesanalyser ble utført for å validere genets anticanceregenskaper ytterligere. Som et resultat ble FAM83A knockdown vist å hemme spredning, migrasjon og invasjon av livmorhalskreftceller og sensibilisere disse cellene til cisplatin. Disse omfattende metodene validerer samlet FAM83A som et tumorassosiert målgen, og holder løfte som et potensielt terapeutisk mål i forebygging og behandling av livmorhalskreft.

Introduction

Livmorhalskreft er en global bekymring, da det er en av de ledende typene gynekologisk malignitet over hele verden og er den viktigste årsaken til kreftrelatert dødelighet hos kvinner¹. Radikal kirurgi og kjemoradioterapi er forbundet med høye kurrater i primærstadiet. Imidlertid er behandlingsresultater for pasienter på avansert stadium av livmorhalskreft som utvikler metastatisk sykdom svært ugunstige². Derfor er det avgjørende å forstå de biologiske mekanismene som ligger til grunn for migrasjon og invasjon av livmorhalskreftceller og identifisere potensielle terapeutiske mål for forebygging og behandling av denne sykdommen.

Identifisering av målgener involvert i kreftprogresjon og å finne måter å hemme deres uttrykk eller handling på, presenterer lovende behandlingsalternativer. I denne studien identifiserte vi FAM83 som et kreftfremkallende gen og undersøkte videre dets hemmende effekter på C33a– og HeLa-celler. FAM83 familie onkogener (FAM83A-H) er mye rapportert i humane kreftformer ^3,4. Nylig ble FAM83A rapportert å være oppregulert i lunge⁵, bryst⁶, eggstokk⁷ og bukspyttkjertel⁸ kreftformer, noe som indikerer at FAM83A spiller en viktig rolle i kreftprogresjon ved å fremme spredning, invasjon, stamcellelignende egenskaper og stoffresistens i tumorcellene. Det er viktig at FAM83A ble identifisert som et av de nye kandidatgenene assosiert med cervikal lesjonsprogresjon og karsinogenese⁹. Til tross for bekreftelsen av forhøyet FAM83A-uttrykk i humane livmorhalskreftceller, forblir den spesifikke virkningen og underliggende mekanismer av FAM83A i livmorhalskreft uklar.

I denne studien skisserer vi protokollene som er involvert i identifiseringen av FAM83A som et tumormålgen i livmorhalskreft og bruker et lite forstyrrende RNA (siRNA) for knockdown av FAM83A-genet i HeLa- og C33a-celler . 5-Etynyl-2′-deoksyuridin (EdU) farging ble utført for å bestemme effektene på tumorcelleproliferasjon, mens sårheling og porøse membraninnsatsanalyser bidro til å evaluere tumorcellemigrasjon og invasjonsevner.

Vestlig blotting ble utført for å bestemme nivåene av apoptoserelaterte proteiner, og JC-1-farging ble brukt til å evaluere mitokondrielle funksjonsendringer. Dermed rapporterte vi at FAM83A spiller en kritisk rolle i celleproliferasjon, metastase og invasjon i livmorhalskreft. Gjennom PI3K / AKT-pathway-assosiert mitokondriell dysfunksjon og apoptose, FAM83A knockdown sensibiliserte livmorhalskreftceller til cisplatin (diamindichloroplatinum, DDP). Denne studien gir et nytt mål for livmorhalskreft og muligens andre kreftformer og en referanse for utvikling av strategier for å overvinne motstanden av kreftceller til visse kjemoterapeutiske legemidler.

Protocol

Studien var helt i tråd med retningslinjene for publisering gitt av TCGA (https://cancergenome.nih.gov/publications/publicationguidelines). Se materialfortegnelsen for detaljer relatert til alle materialer, reagenser og instrumenter som brukes i denne protokollen. 1. Datakilde og bioinformatikkanalyse Få RNA-sekvenseringsdata fra databasen Cancer Genome Atlas (TCGA) (https://cancergenome.nih.gov) for klyngeanalyse. Bruk GEPIA (http://gepia.cancer-pku.cn/), et nettb…

Representative Results

TCGA-databaseanalyse og PCR-validering Fra TCGA-databaseanalysen gjennomførte vi en komparativ analyse av mRNA-ekspresjonsnivåer i 306 livmorhalskreftcelleprøver og 13 normale celleprøver for å undersøke differensialuttrykket av FAM83A. FAM83A var oppregulert ved livmorhalskreft, mens uttrykket i normalt livmorhalsvev var ubetydelig (figur 1A). For å få ytt…

Discussion

Undersøkelsen av tumormålgener er av største betydning for både forebygging og behandling av livmorhalskreft. Å forstå de spesifikke genene som spiller en viktig rolle i utvikling og progresjon av livmorhalskreft gir verdifull innsikt i de underliggende molekylære mekanismene til sykdommen. Videre kan identifisering av disse målgenene føre til utvikling av nye terapeutiske strategier og målrettede terapier. I denne studien beskriver vi bruken av TCGA-datasettanalyse for å identifisere FAM83A som et m?…

Materials

Cells and Medium Formulation
C33a	American Type Culture Collection
Hela	American Type Culture Collection
Modified medium			10% fetal bovine serum and + antibiotics (100 U/mL penicillin and 100 U/mL streptomycin)
Antibody Information
AKT	4691, Cell Signaling Technology Inc.		‘1:1,000
Bcl2	26593-1-AP, Proteintech Group, Inc		‘1:1,000
Caspase 3	19677-1-AP, Proteintech Group, Inc		‘1:2,000
cleaved-caspase3	abs132005; Absin Bioscience Inc.		‘1:1,000
Cytc	10993-1-AP; Proteintech Group		‘1:1,000
GAPDH	10494-1-AP, Proteintech Group, Inc.		‘1:8,000
mTOR	2983, Cell Signaling Technology Inc.		‘1:1,000
PI3K	4292, Cell Signaling Technology Inc		‘1:1,000
p-AKT	4060, Cell Signaling Technology Inc.		‘1:1,000
p-mTOR (Ser2448)	#5536, Cell Signaling Technology Inc.		‘1:1,000
p-PI3K p85 subunit	17366, Cell Signaling Technology Inc.		‘1:1,000
Secondary antibodies	GB23303, Servicebio		‘1:2,000
Materials
6-well plate	Corning, NPY
Alexa Fluor 555	Beyotime
BCA Protein assay kit	Beyotime, China		P0011
ChemiDoc XRS Imager System	BioRad
Enhanced chemiluminescence detection kit	Servicebio, Inc.,China		cat. no. G2014
Fluorescence microscope	Olympus Corporation, Tokyo, Japan
Hifair II 1st Strand cDNA Synthesis Super Mix	11123ES60, Yeasen Biotech o., Ltd., China
			Inverted microscope	Olympus, Tokyo, Japan;
Millicell transwell inserts	Millipore,Bedford, MA, USA
Mitochondrial membrane potential assay kit	Beyotime, China
PMSF	ST506, Beyotime Biotech, Jiangsu, China		#ST506
Real-time quantitative PCR instrument	Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific. China.
			RIPA Lysis Buffer	Beyotime Biotech, Jiangsu, China
TRIzol reagent	Invitrogen		15596026
TRIzol reagent	Takara Bio Inc., Otsu, Japan
Software
Image-Pro	plus 6.0