子宮頸がん細胞の増殖とシスプラチン感受性における FAM83Aの役割を検証するためのFAM83A のノックダウン
Summary
ここでは、 FAM83A ノックダウンの手順を示します。子宮頸がん細胞の増殖、遊走、および浸潤に対するその影響を検出するためのアッセイ。そして、これらの細胞のシスプラチンに対する感作。この研究は、子宮頸がんの有望な標的遺伝子であり、さらなる薬物研究の参考となります。
Abstract
腫瘍標的遺伝子の探索は、子宮頸がんの予防と治療にとって最も重要です。この研究では、子宮頸がんにおける腫瘍標的遺伝子FAM83Aの同定に関与する手順を概説します。まず、Cancer Genome Atlasデータセットを使用して、女性におけるFAM83Aの発現と予後の重要性を検証しました。低分子干渉RNA(siRNA)は、HeLaおよびC33a細胞におけるFAM83A遺伝子のノックダウンに使用されました。次に、5-エチニル-2′-デオキシウリジン(EdU)染色を行い、腫瘍細胞の増殖能への影響を調べました。創傷治癒および多孔質メンブレンインサートアッセイを実施して、腫瘍細胞の遊走および浸潤能力を評価しました。
ウェスタンブロッティングを使用して、アポトーシス関連タンパク質レベルを定量しました。JC-1染色は、ミトコンドリア機能の変化を評価するために採用されました。さらに、シスプラチン(ジアミンジクロロプラチナ、DDP)介入を使用して、標的遺伝子の治療可能性を評価しました。フローサイトメトリーおよびコロニー形成アッセイを実施して、遺伝子の抗がん特性をさらに検証しました。その結果、 FAM83A ノックダウンは、子宮頸がん細胞の増殖、遊走、浸潤を阻害し、これらの細胞をシスプラチンに感作することが示されました。これらの包括的な方法論は、 FAM83A が腫瘍関連標的遺伝子であることを総合的に検証し、子宮頸がんの予防および治療における潜在的な治療標的として有望視されています。
Introduction
子宮頸がんは、婦人科悪性腫瘍の世界的な主要なタイプの1つであり、女性のがん関連死亡率の主な原因であるため、世界的な懸念事項です1。根治的手術と化学放射線療法は、一次段階での高い治癒率と関連しています。しかし、子宮頸がんの進行期に転移性疾患を発症した患者の治療成績は非常に好ましくない2。したがって、子宮頸がん細胞の遊走と浸潤の根底にある生物学的メカニズムをさらに理解し、この疾患の予防と治療のための潜在的な治療標的を特定することが重要です。
がんの進行に関与する標的遺伝子を同定し、その発現や作用を阻害する方法を見つけることは、有望な治療法の選択肢となります。本研究では、FAM83を発がん遺伝子として同定し、C33a細胞とHeLa細胞に対する阻害作用をさらに調べました。FAM83ファミリーがん遺伝子(FAM83A-H)は、ヒトのがんにおいて広く報告されている3,4。最近、FAM83Aは、肺5、乳がん6、卵巣7、および膵臓8の癌でアップレギュレーションされることが報告されており、FAM83Aが腫瘍細胞の増殖、浸潤、幹細胞様形質、および薬剤耐性を促進することにより、癌の進行に重要な役割を果たしていることが示されています。重要なことに、FAM83Aは、子宮頸部病変の進行と発がんに関連する新規候補遺伝子の1つとして同定された9。ヒト子宮頸がん細胞におけるFAM83A発現の上昇が確認されたにもかかわらず、子宮頸がんにおけるFAM83Aの特異的影響および根底にあるメカニズムは不明のままである。
この研究では、子宮頸がんの腫瘍標的遺伝子としてのFAM83Aの同定に関与するプロトコルを概説し、HeLaおよびC33a細胞のFAM83A遺伝子のノックダウンに低分子干渉RNA(siRNA)を使用します。5-エチニル-2′-デオキシウリジン(EdU)染色は、腫瘍細胞の増殖に対する効果を決定するために実施され、創傷治癒および多孔質膜挿入アッセイは、腫瘍細胞の遊走および浸潤能力の評価に役立ちました。
アポトーシス関連タンパク質のレベルを測定するためにウェスタンブロッティングを行い、ミトコンドリア機能の変化を評価するためにJC-1染色を採用しました。このように、 FAM83A は子宮頸癌の細胞増殖、転移、浸潤に重要な役割を果たしていることを報告しました。PI3K/AKT経路に関連するミトコンドリアの機能障害とアポトーシスを介して、 FAM83A ノックダウンは子宮頸がん細胞をシスプラチン(ジアミンジクロロプラチナ、DDP)に感作しました。この研究は、子宮頸がんおよびおそらく他のがんの新しい標的と、特定の化学療法薬に対するがん細胞の耐性を克服するための戦略開発の参考資料を提供します。
Protocol
Representative Results
Discussion
子宮頸がんの予防と治療の両面において、腫瘍標的遺伝子の解明は極めて重要です。子宮頸がんの発生と進行に重要な役割を果たす特定の遺伝子を理解することは、子宮頸がんの根底にある分子メカニズムに関する貴重な洞察を提供します。さらに、これらの標的遺伝子を同定することで、新たな治療戦略や標的療法の開発につながる可能性があります。本研究では、TCGAデータセット解析を…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、荊州科学技術局基金会(no.2020HC06)の支援を受けました。
Materials
| Cells and Medium Formulation | |||
| C33a | American Type Culture Collection | ||
| Hela | American Type Culture Collection | ||
| Modified medium | 10% fetal bovine serum and + antibiotics (100 U/mL penicillin and 100 U/mL streptomycin) | ||
| Antibody Information | |||
| AKT | 4691, Cell Signaling Technology Inc. | ‘1:1,000 | |
| Bcl2 | 26593-1-AP, Proteintech Group, Inc | ‘1:1,000 | |
| Caspase 3 | 19677-1-AP, Proteintech Group, Inc | ‘1:2,000 | |
| cleaved-caspase3 | abs132005; Absin Bioscience Inc. | ‘1:1,000 | |
| Cytc | 10993-1-AP; Proteintech Group | ‘1:1,000 | |
| GAPDH | 10494-1-AP, Proteintech Group, Inc. | ‘1:8,000 | |
| mTOR | 2983, Cell Signaling Technology Inc. | ‘1:1,000 | |
| PI3K | 4292, Cell Signaling Technology Inc | ‘1:1,000 | |
| p-AKT | 4060, Cell Signaling Technology Inc. | ‘1:1,000 | |
| p-mTOR (Ser2448) | #5536, Cell Signaling Technology Inc. | ‘1:1,000 | |
| p-PI3K p85 subunit | 17366, Cell Signaling Technology Inc. | ‘1:1,000 | |
| Secondary antibodies | GB23303, Servicebio | ‘1:2,000 | |
| Materials | |||
| 6-well plate | Corning, NPY | ||
| Alexa Fluor 555 | Beyotime | ||
| BCA Protein assay kit | Beyotime, China | P0011 | |
| ChemiDoc XRS Imager System | BioRad | ||
| Enhanced chemiluminescence detection kit | Servicebio, Inc.,China | cat. no. G2014 | |
| Fluorescence microscope | Olympus Corporation, Tokyo, Japan | ||
| Hifair II 1st Strand cDNA Synthesis Super Mix | 11123ES60, Yeasen Biotech o., Ltd., China | ||
| Inverted microscope | Olympus, Tokyo, Japan; | ||
| Millicell transwell inserts | Millipore,Bedford, MA, USA | ||
| Mitochondrial membrane potential assay kit | Beyotime, China | ||
| PMSF | ST506, Beyotime Biotech, Jiangsu, China | #ST506 | |
| Real-time quantitative PCR instrument | Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific. China. | ||
| RIPA Lysis Buffer | Beyotime Biotech, Jiangsu, China | ||
| TRIzol reagent | Invitrogen | 15596026 | |
| TRIzol reagent | Takara Bio Inc., Otsu, Japan | ||
| Software | |||
| Image-Pro | plus 6.0 | ||
References
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