Knockdown av FAM83A för att verifiera dess roll i livmoderhalscancercelltillväxt och cisplatinkänslighet
Summary
Här visar vi procedurerna för FAM83A knockdown; Analyser för att upptäcka dess effekter på proliferation, migration och invasion av livmoderhalscancerceller. och sensibilisering av dessa celler för cisplatin. Denna studie ger en lovande målgen för livmoderhalscancer och en referens för vidare läkemedelsforskning.
Abstract
Utforskningen av tumörmålgener är av största vikt för förebyggande och behandling av livmoderhalscancer. I denna studie beskriver vi de steg som är involverade i identifieringen av en tumörmålgen FAM83A i livmoderhalscancer. Först användes Cancer Genome Atlas-datasetet för att validera uttrycket och den prognostiska betydelsen av FAM83A hos kvinnor. Ett litet interfererande RNA (siRNA) användes för att slå ut FAM83A-genen i HeLa- och C33a-celler . Därefter utfördes 5-etynyl-2′-deoxiuridin (EdU) färgning för att bestämma effekterna på tumörcellernas spridningsförmåga. Sårläkning och analyser av porösa membraninsatser utfördes för att utvärdera tumörcellers migrations- och invasionsförmåga.
Western blotting användes för att kvantifiera apoptosrelaterade proteinnivåer. JC-1-färgning användes för att utvärdera mitokondriella funktionsförändringar. Dessutom användes cisplatinintervention (diamindiklorplatina, DDP) för att bedöma målgenens terapeutiska potential. Flödescytometri och kolonibildningsanalyser utfördes för att ytterligare validera genens anticanceregenskaper. Som ett resultat av detta visade sig FAM83A-knockdown hämma proliferation, migration och invasion av livmoderhalscancerceller och sensibilisera dessa celler för cisplatin. Dessa omfattande metoder validerar tillsammans FAM83A som en tumörassocierad målgen, vilket är lovande som ett potentiellt terapeutiskt mål för förebyggande och behandling av livmoderhalscancer.
Introduction
Livmoderhalscancer är ett globalt problem eftersom det är en av de ledande typerna av gynekologisk malignitet i världen och är den främsta orsaken till cancerrelaterad dödlighet hos kvinnor1. Radikal kirurgi och kemoradioterapi är förknippade med hög läkningsgrad i det primära skedet. Behandlingsresultaten för patienter i det framskridna stadiet av livmoderhalscancer som utvecklar metastaserad sjukdom är dock mycket ogynnsamma2. Därför är det viktigt att ytterligare förstå de biologiska mekanismerna bakom migration och invasion av livmoderhalscancerceller och identifiera potentiella terapeutiska mål för förebyggande och behandling av denna sjukdom.
Att identifiera målgener som är involverade i cancerprogression och hitta sätt att hämma deras uttryck eller verkan är lovande behandlingsalternativ. I denna studie identifierade vi FAM83 som en cancerframkallande gen och undersökte vidare dess hämmande effekter på C33a– och HeLa-celler. FAM83-familjens onkogener (FAM83A-H) rapporteras i stor utsträckning i cancer hos människa 3,4. Nyligen rapporterades FAM83A vara uppreglerad i lungcancer5, bröst6, äggstockar7 och bukspottkörtel8, vilket indikerar att FAM83A spelar en viktig roll i cancerprogression genom att främja proliferation, invasion, stamcellsliknande egenskaper och läkemedelsresistens i tumörcellerna. FAM83A identifierades som en av de nya kandidatgenerna som är associerade med progression av cervikala lesioner och carcinogenes9. Trots bekräftelsen av förhöjt FAM83A-uttryck i humana livmoderhalscancerceller, är den specifika effekten och de underliggande mekanismerna för FAM83A vid livmoderhalscancer fortfarande oklara.
I denna studie beskriver vi de protokoll som är involverade i identifieringen av FAM83A som en tumörmålgen vid livmoderhalscancer och använder ett litet interfererande RNA (siRNA) för knockdown av FAM83A-genen i HeLa- och C33a-celler . 5-Ethynyl-2′-deoxiuridin (EdU) färgning utfördes för att bestämma effekterna på tumörcellsproliferation, medan sårläkning och porösa membraninsatsanalyser hjälpte till att utvärdera tumörcellmigration och invasionsförmåga.
Western blotting utfördes för att bestämma nivåerna av apoptosrelaterade proteiner, och JC-1-färgning användes för att utvärdera mitokondriella funktionsförändringar. Således rapporterade vi att FAM83A spelar en avgörande roll i cellproliferation, metastasering och invasion vid livmoderhalscancer. Genom PI3K/AKT-pathway-associerad mitokondriell dysfunktion och apoptos gjorde FAM83A knockdown livmoderhalscancerceller känsliga för cisplatin (diamindiklorplatina, DDP). Denna studie ger ett nytt mål för livmoderhalscancer och möjligen andra cancerformer och en referens för utveckling av strategier för att övervinna cancercellers resistens mot vissa kemoterapeutiska läkemedel.
Protocol
Representative Results
Discussion
Att undersöka tumörens målgener är av yttersta vikt för både prevention och behandling av livmoderhalscancer. Att förstå de specifika gener som spelar en viktig roll i utvecklingen och progressionen av livmoderhalscancer ger värdefull insikt i de underliggande molekylära mekanismerna för sjukdomen. Dessutom kan identifieringen av dessa målgener leda till utveckling av nya terapeutiska strategier och riktade terapier. I denna studie beskriver vi användningen av TCGA-datasetanalys för att identifiera FAM8…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av Jingzhou Science and Technology Bureau Foundation (nr 2020HC06).
Materials
| Cells and Medium Formulation | |||
| C33a | American Type Culture Collection | ||
| Hela | American Type Culture Collection | ||
| Modified medium | 10% fetal bovine serum and + antibiotics (100 U/mL penicillin and 100 U/mL streptomycin) | ||
| Antibody Information | |||
| AKT | 4691, Cell Signaling Technology Inc. | ‘1:1,000 | |
| Bcl2 | 26593-1-AP, Proteintech Group, Inc | ‘1:1,000 | |
| Caspase 3 | 19677-1-AP, Proteintech Group, Inc | ‘1:2,000 | |
| cleaved-caspase3 | abs132005; Absin Bioscience Inc. | ‘1:1,000 | |
| Cytc | 10993-1-AP; Proteintech Group | ‘1:1,000 | |
| GAPDH | 10494-1-AP, Proteintech Group, Inc. | ‘1:8,000 | |
| mTOR | 2983, Cell Signaling Technology Inc. | ‘1:1,000 | |
| PI3K | 4292, Cell Signaling Technology Inc | ‘1:1,000 | |
| p-AKT | 4060, Cell Signaling Technology Inc. | ‘1:1,000 | |
| p-mTOR (Ser2448) | #5536, Cell Signaling Technology Inc. | ‘1:1,000 | |
| p-PI3K p85 subunit | 17366, Cell Signaling Technology Inc. | ‘1:1,000 | |
| Secondary antibodies | GB23303, Servicebio | ‘1:2,000 | |
| Materials | |||
| 6-well plate | Corning, NPY | ||
| Alexa Fluor 555 | Beyotime | ||
| BCA Protein assay kit | Beyotime, China | P0011 | |
| ChemiDoc XRS Imager System | BioRad | ||
| Enhanced chemiluminescence detection kit | Servicebio, Inc.,China | cat. no. G2014 | |
| Fluorescence microscope | Olympus Corporation, Tokyo, Japan | ||
| Hifair II 1st Strand cDNA Synthesis Super Mix | 11123ES60, Yeasen Biotech o., Ltd., China | ||
| Inverted microscope | Olympus, Tokyo, Japan; | ||
| Millicell transwell inserts | Millipore,Bedford, MA, USA | ||
| Mitochondrial membrane potential assay kit | Beyotime, China | ||
| PMSF | ST506, Beyotime Biotech, Jiangsu, China | #ST506 | |
| Real-time quantitative PCR instrument | Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific. China. | ||
| RIPA Lysis Buffer | Beyotime Biotech, Jiangsu, China | ||
| TRIzol reagent | Invitrogen | 15596026 | |
| TRIzol reagent | Takara Bio Inc., Otsu, Japan | ||
| Software | |||
| Image-Pro | plus 6.0 | ||
References
- Arbyn, M., et al. Estimates of incidence and mortality of cervical cancer in 2018: a worldwide analysis. Lancet Global Health. 8 (2), e191-e203 (2020).
- Cohen, P. A., Jhingran, A., Oaknin, A., Denny, L. Cervical cancer. Lancet. 393 (10167), 169-182 (2019).
- Cipriano, R., et al. Conserved oncogenic behavior of the fam83 family regulates mapk signaling in human cancer. Molecular Cancer Research. 12 (8), 1156-1165 (2014).
- Snijders, A. M., et al. FAM83 family oncogenes are broadly involved in human cancers: an integrative multi-omics approach. Molecular Oncology. 11 (2), 167-179 (2017).
- Gan, J., Meng, Q., Li, Y. Corrigendum: systematic analysis of expression profiles and prognostic significance for fam83 family in non-small-cell lung cancer. Frontiers In Molecular Biosciences. 8, 653454 (2021).
- Jin, Y., et al. Comprehensive analysis of the expression, prognostic significance, and function of fam83 family members in breast cancer. World Journal of Surgical Oncology. 20 (1), 172 (2022).
- Lin, S., et al. Identification of prognostic biomarkers among fam83 family genes in human ovarian cancer through bioinformatic analysis and experimental verification. Cancer Management and Research. 13, 8611-8627 (2021).
- Ma, Z., et al. Identification of prognostic and therapeutic biomarkers among fam83 family members for pancreatic ductal adenocarcinoma. Disease Markers. 2021, 6682697 (2021).
- Xu, J., et al. Genome-wide profiling of cervical RNA-binding proteins identifies human papillomavirus regulation of rnaseh2a expression by viral e7 and e2f1. mBio. 10 (1), e02687-e02618 (2019).
- Wong, R. S. Apoptosis in cancer: from pathogenesis to treatment. Journal Of Experimental & Clinical Cancer Research. 30 (1), 87 (2011).
- Bonora, M., Pinton, P. The mitochondrial permeability transition pore and cancer: molecular mechanisms involved in cell death. Frontiers In Oncology. 4, 302 (2014).
- Wang, N., Hou, M. S., Zhan, Y., Shen, X. B., Xue, H. Y. MALAT1 promotes cisplatin resistance in cervical cancer by activating the pi3k/akt pathway. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 22 (22), 7653-7659 (2018).
- Tsuruta, F., Masuyama, N., Gotoh, Y. The phosphatidylinositol 3-kinase (pi3k)-akt pathway suppresses bax translocation to mitochondria. Journal Of Biological Chemistry. 277 (16), 14040-14047 (2002).
- Guerra, F., Arbini, A. A., Moro, L. Mitochondria and cancer chemoresistance. Biochimica et Biophysica Acta – Bioenergetics. 1858 (8), 686-699 (2017).
- Pustylnikov, S., Costabile, F., Beghi, S., Facciabene, A. Targeting mitochondria in cancer: current concepts and immunotherapy approaches. Translational Research. 202, 35-51 (2018).
