Summary
Протокол разъясняет две различные методики децеллюляризации, применяемые к нативным легочным тканям крупного рогатого скота, обеспечивая всестороннее описание их соответствующих характеристик.
Abstract
Использование гидрогелей, полученных из внеклеточного матрикса (ECM), в тканевой инженерии становится все более популярным, поскольку они могут имитировать естественную среду клеток in vitro. Тем не менее, поддержание нативного биохимического состава ВКМ, достижение механической стабильности и понимание влияния процесса децеллюляризации на механические свойства гидрогелей ВКМ являются сложной задачей. Описан трубопровод для децеллюляризации легочной ткани крупного рогатого скота с использованием двух различных протоколов, последующая характеристика эффективности децеллюляризации, изготовление восстановленных децеллюляризованных гидрогелей ВКМ легких и оценка их механических и цитосовместимых свойств. Децеллюляризацию легкого крупного рогатого скота проводили физическим (циклы замораживания-оттаивания) или химическим (на основе моющих средств) методом. Окрашивание гематоксилином и эозином проводили для подтверждения децеллюляризации и удержания основных компонентов ВКМ. Для оценки содержания остаточного коллагена и сульфатного гликозаминогликана (sGAG) в децеллюляризованных образцах использовали методы окрашивания Sirius red и Alcian Blue соответственно. Механические свойства децеллюляризованных гидрогелей ВКМ легких характеризовались колебательной реологией. Полученные результаты свидетельствуют о том, что децеллюляризованные гидрогели для легких крупного рогатого скота могут стать надежной органотипической альтернативой коммерческим продуктам ECM, сохраняя большинство нативных компонентов ECM. Кроме того, эти результаты показывают, что выбранный метод децеллюляризации существенно влияет на кинетику гелеобразования, а также на жесткость и вязкоупругие свойства получаемых гидрогелей.
Introduction
Традиционные монослойные условия культивирования не обеспечивают точного представления нативного тканевого микроокружения и не имеют возможности обеспечить трехмерный (3D) каркас с информативными лигандами, которые обеспечивают взаимодействие между клеткой и матрицей и клеткой между клетками1. Состав и механические свойства внеклеточного матрикса (ВКМ) сильно тканеспецифичны, зависят от времени и претерпевают изменения при патологических состояниях. Поэтому существует потребность в биомиметических 3D-моделях тканей, которые позволяют настраивать такие характеристики, модулировать клеточное поведение и достигать желаемой функциональности тканей. Нативные биоматериалы, полученные из ECM, привлекают большое внимание в тканевой инженерии благодаря возможности прямого использования тканеспецифичных ECM 1,2,3,4,5. Носители на основе ECM используются во многих приложениях, начиная от регенерации тканей и заканчивая разработкой моделей заболеваний. Они используются в качестве инъекционных или имплантируемых каркасов биоматериалов 4,5, в приложениях для скрининга лекарств 6,7, при разработке материалов, индуцирующих рост клеток 8,9,10, в качестве биочернил 11,12,13, в микрофлюидике14 и в моделях раковых тканей 15,16,17,18,19.
Децеллюляризация тканей и органов является популярным подходом к созданию каркасов, имитирующих тканеспецифичные ВКМ. Восстановление децеллюляризованных тканей и органов в гидрогели позволяет встраивать клетки в биомиметические 3D модели тканей20. Методы децеллюляризации в основном направлены на устранение клеточных компонентов с сохранением состава ECM. Для децеллюляризации тканей обычно применяются физические методы, такие как циклы замораживания-оттаивания или химические процессы, такие как обработка Triton-X-100. Кроме того, лечение ДНКазой предпочтительно для удаления остаточной ДНК, чтобы свести к минимуму иммунологические реакции при внедрении клеток. Для оптимизации процедур децеллюляризации крайне важно добиться максимального удаления клеток и минимального нарушения ECM21. Помимо этих аспектов, характеристика биохимических и механических свойств восстановленных скаффолдов, включая вязкоупругость и жесткость, имеет решающее значение для улучшения инженерных 3D-моделей тканей, полученных из нативных матриц20.
Органоспецифическая ВКМ в легочной тканевой инженерии позволяет имитировать легочное микроокружение для моделирования процессов развития, гомеостатики или патологии in vitro и тестирования терапевтических средств в физиомиметических условиях 20,22,23. Предыдущие исследования продемонстрировали децеллюляризацию легочной ткани у нескольких видов, таких как крысы, свиньи и люди, но эти методы еще предстоит адаптировать к менее часто используемым видам, таким как крупный рогатый скот. Лучшее понимание параметров процесса децеллюляризации и того, как они влияют на полученные восстановленные каркасы ECM в отношении биохимического состава и механических свойств, позволит лучше настроить такие аспекты и проложить путь к более надежным тканевым моделям в норме и при заболеваниях. В этом исследовании децеллюляризация легких крупного рогатого скота двумя различными методами, циклами замораживания-оттаивания и обработкой Triton-X-100, подробно описана и сопровождается биохимическим и механическим анализом гидрогелей децеллюляризованных легких ECM (dECM). Полученные данные показывают, что оба метода обеспечивают эффективную децеллюляризацию и удержание лигандов ECM. Примечательно, что выбор метода существенно изменяет результирующую жесткость и вязкоупругость восстановленных гидрогелей. Гидрогели, полученные из бычьего dECM, демонстрируют заметные биохимические аналогии с внеклеточным матриксом легких человека и обладают надежными характеристиками термического гелеобразования20. Как было описано ранее, оба метода подходят для 3D-культивирования клеток рака легких, здоровых эпителиальных клеток бронхов и органоидов легких, полученных от пациентов20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Свежие нативные легкие от молодых (1-2 года) доноров крупного рогатого скота были получены с местной скотобойни и доставлены в герметичном пластиковом контейнере на льду в лабораторию. Жертвоприношение животных проводится для общего потребления мяса (легкие выбрасываются как отходы) и не связано с исследованием или в связи с ним. Мы подтверждаем, что скотобойня соответствует национальным законам и правилам о жертвоприношениях животных. Кроме того, мы подтверждаем, что использовали только отходы, и исследовательский проект не повлиял на количество принесенных в жертву животных.
1. Забор органов и подготовка тканей
- Свежеполученные ткани легких крупного рогатого скота хранят при температуре -80 °C до начала эксперимента.
- В день эксперимента подождите, пока замороженные легочные ткани оттают при комнатной температуре.
- Рассеките ткани стерильными скальпелями и ножницами для удаления трахеи и хрящевых дыхательных путей, а затем измельчите на мелкие кусочки (5мм3).
- Тщательно промыть сверхчистой водой, содержащей 2% пенициллина/стрептомицина (P/S) не менее 3 раз.
2. Децеллюляризация тканей
ПРИМЕЧАНИЕ: Нативные ткани легких крупного рогатого скота децеллюляризовали с использованием двух различных протоколов.
- Метод замораживания-оттаивания
- Подготовьте образцы тканей в соответствии с шагом 1. Измельченные ткани погрузить в 2% раствор йода в стерильную дистиллированную воду (dH2O) на 1 мин. Выполните две последовательные стирки в стерильном dH2O.
- Переложите измельченные кусочки ткани в пробирку объемом 50 мл до уровня 15 мл и выполните пять ручных циклов замораживания-оттаивания с помощью портативного контейнера с жидким азотом. Наполните пробирки доверху стерильным dH2O и заморозьте пробирки на 2 минуты в жидком азоте. Через 2 мин немедленно перенесите их на водяную баню с температурой 37 °C на 10 мин. Это составляет 1 цикл замораживания-оттаивания.
- Инкубируют образцы с 30 мл раствора ДНКазы (10 ЕД/мл) в буфере 10 мМ MgCl2 (рН 7,5) в течение 1 ч при 37 °C при постоянном встряхивании при 100 об/мин.
- Продолжайте интенсивную стирку со стерильным dH2O в течение 3 дней при постоянном встряхивании при 100 об/мин, с пополнением раствора каждые 24 часа.
- Выполните лиофилизацию и криомление следующим образом20: Заморозьте влажные образцы dECM при -80 °C в течение 24 часов. Перенесите замороженные образцы в лиофилизатор и работайте в режиме сушки под вакуумом в течение 3-4 дней до полного высыхания. По завершении сублимационной сушки произвести измельчение образцов в виде мелкодисперсного порошка с помощью измельчительного аппарата и сухого льда.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это состояние мелкодисперсного порошка считается необходимым из-за его улучшенной растворимости на последующих стадиях процесса разложения.
- Метод Тритон-Х-100
- Подготовьте образцы тканей в соответствии с шагом 1. Обрабатывайте легочные ткани 1% препаратом Triton-X-100 в течение 3 дней при осторожном вращении при температуре 4 °C. Замена раствора каждые 24 часа.
- Инкубируют образцы с раствором ДНКазы (10 ед/мл) в буфере 10 мМ MgCl2 (рН 7,5) в течение 1 ч при 37 °C при постоянном встряхивании.
- Продолжайте интенсивное промывание стерильным dH2O в течение 3 дней при осторожном вращении, с пополнением раствора каждые 24 часа.
- Выполните лиофилизацию с последующим криоизмельчением, как описано в шаге 2.1.
3. Переваривание пепсина
- Дигестируют порошкообразные образцы dECM в концентрации 15 мг/мл (w/v) в растворе пепсина (1 мг/мл пепсина в 0,01 M HCl, pH 2). Проводите процесс разложения образца при комнатной температуре при постоянном помешивании в течение 48 ч и часто поддерживайте рН раствора для эффективного разложения.
- Переложите дигестиви в пробирку и центрифугу при 5000 x g в течение 10 минут.
- Соберите надосадочную жидкость, нейтрализуйте и буферизуйте ее до физиологических условий (pH 7, 1x фосфатный солевой буфер (PBS)) путем добавления 5M NaOH и 10x PBS.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется использовать концентрированные щелочные растворы для регулирования рН кислого пищеварения, так как этот подход позволяет избежать нежелательного расширения объема, которое может отрицательно повлиять на гелеобразование на последующих этапах. - Храните предварительно гелевые дигестивали при температуре −20 °C для дальнейших исследований.
4. Гистологическое окрашивание
- Зафиксируйте небольшую порцию (5мм3) образца децеллюляризованной ткани в 1 мл 3,7% раствора формальдегида при температуре 4 °C в течение ночи.
- Инкубируют ткани в пробирках, содержащих 1 мл 30% раствора сахарозы, в ПБС в течение 12 ч при 4 °С на устойчивой породе.
- Чтобы поместить ткани в компаунд с оптимальной температурой резки (OCT), налейте 1 мл OCT в криоформу, поместите ткань в середину криоформы, затем налейте 2 мл OCT поверх ткани.
- Поместите криоформы, содержащие ткани, на сухой лед и мгновенно заморозьте, используя жидкий азот. Образцы готовы, когда ОКТ становится полностью белой, что обычно занимает 3 минуты. Храните ткани, внедренные ОКТ, при температуре -20 °C до использования.
- Получите срезы размером 10 мкм в криостате при -25 °C на предметном стекле с поли-L-лизиновым покрытием и переведите предметное стекло в комнатную температуру, чтобы дать возможность срезу ткани расплавиться на предметном стекле. Храните предметные стекла при температуре -20 °C до использования.
- Для того, чтобы подтвердить отсутствие ядер после децеллюляризации, выполните окрашивание гематоксилином и эозином (H&E), как описано ниже.
- Инкубируйте предметные стекла при комнатной температуре в течение 10 мин. Погрузите предметные стекла в ПБС и окрасьте их готовым к использованию 50 мл раствора гематоксилина в банке для окрашивания на 3 мин, после чего 3 мин промыть водопроводной водой.
- Погрузите предметные стекла в 95% этиловый спирт и окрасьте 50 мл 0,5% спиртового раствора эозина в банке для окрашивания на 45 с.
- Выполните окрашивание Sirius в красный цвет, чтобы показать сохранение содержимого коллагена после децеллюляризации.
- Увлажните предметные стекла PBS и погрузите их в 50 мл 0,1% сириуса красного в насыщенном водном растворе пикриновой кислоты в банке для окрашивания на 1 ч.
- Промойте предметные стекла в 0,5% растворе уксусной кислоты в течение 5 секунд и обезвоживайте все предметные стекла, последовательно замачивая их в 70%, 95% и 100% этаноле в течение 1 минуты каждое.
- Чтобы проанализировать содержание sGAG в образцах тканей, выполните окрашивание альциановым синим, как описано ниже.
- Погружают предметные стекла в 50 мл 1% альцианового синего в 3% растворе уксусной кислоты (рН 2,5) в банку для окрашивания на 30 мин. Промойте предметные стекла проточной водой из-под крана в течение 2 минут.
- Обезвоживайте все предметные стекла, последовательно замочив их в 70%, 95% и 100% этаноле на 1 минуту каждое.
- Добавьте 0,1 мл монтажной среды поверх образцов и визуализируйте с помощью световой микроскопии с 10-кратным увеличением.
5. Определение механических характеристик
- Выполняйте измерения осцилляторных реологических свойств с помощью реометра с параллельной геометрией пластины.
- Налейте 250 мкл раствора предварительного геля, хранящегося на льду, на предварительно охлажденную (4 °C) нижнюю пластину, чтобы избежать быстрого гелеобразования.
- Опускайте параллельную пластину диаметром 20 мм до тех пор, пока раствор предварительного геля не образует диск с шириной зазора 1 мм между двумя пластинами.
- Немедленно приступайте к измерению. Измеряйте модули накопления и потерь с течением времени с фиксированной частотой и деформацией при нагревании нижней пластины до 37 °C в течение 30 минут, чтобы наблюдать за кинетикой гелеобразования. Используйте фиксированную частоту 0,5 Гц и 0,1% деформации.
- Выполните испытание на восстановление ползучести после того, как значение модуля накопления перестанет расти и достигнет плато.
- Прикладывают к гидрогелю напряжение сдвига 1 Па в течение 15 мин, измеряют деформацию, выгружают образец из напряжения и регистрируют изменение значения деформации в течение 15 мин.
- Нарисуйте график зависимости напряжения от времени, чтобы показать поведение, расслабляющее стресс. Повторите измерения для трех разных дайджестов dECM в качестве репликаций.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Децеллюляризация
Децеллюляризация легочной ткани крупного рогатого скота с получением гидрогелей dECM, воспроизводящих нативное микроокружение легких, была достигнута как физическими (замораживание-оттаивание), так и химическими (Triton-X-100) методами. После вскрытия кусочки тканей промывали в dH2O-содержащих антибиотиках для удаления патогенов, которые в дальнейшем могут повлиять на стерильность гидрогелей dECM. В общей сложности пять циклов чередования жидкого азота с водяной баней 37 °C были применены для метода замораживания-оттаивания для разрушения клеточных структур. При втором способе децеллюляризации нативные кусочки легочной ткани обрабатывали 1% раствором Тритона-Х-100 в течение 3 суток при постоянном перемешивании. В обоих методах разрезание легочной ткани на мелкие кусочки имеет решающее значение для диффузии растворов в области ядра, а также для физического разрушения ядерного содержимого. В качестве первого визуального показателя децеллюляризации розовый цвет ткани переходил в беловатый цвет с повторяющимися циклами при обоих методах. Также крайне важно удалить остаточную ДНК, что было достигнуто с помощью лечения ДНКазой в этом протоколе. Кроме того, после децеллюляризации обоими методами ткани интенсивно промывали в течение 3 дней вdH2Oс добавлением антибиотиков для сохранения стерильности тканей. Еще один момент, который следует учитывать, заключается в том, что во время нейтрализации и буферизации дигестов dECM в физиологических условиях все растворы были стерилизованы фильтром, опять же в целях стерильности, и хранились на льду, чтобы избежать преждевременного образования геля. Затем образование гидрогеля dECM в легких достигали с помощью термического гелеобразования на заключительном этапе (рис. 1).
Криосекционирование и гистологическое окрашивание
Для оценки элиминации ядер и удержания молекул ВКМ после децеллюляризации проводили фиксацию и криосекцию нативной и децеллюляризованной тканей легких с последующим указанным гистологическим окрашиванием (рис. 2А). Окрашивание H&E продемонстрировало значительное снижение содержания ядер в децеллюляризованных образцах как методом замораживания-оттаивания, так и методом Triton-X-100 по сравнению с нативной тканью, что позволяет предположить, что децеллюляризация была достигнута как физическими, так и химическими методами (рис. 2B). Красное окрашивание по Сириусу показало, что сохраненный коллаген в децеллюляризованных тканях был сопоставим с нативной тканью, что указывает на то, что оба метода децеллюляризации оказывают минимальное влияние на содержание коллагена (рис. 2B). Кроме того, окрашивание алциановым синим показало, что содержание sGAG в децеллюляризованных тканях эффективно сохранялось по сравнению с нативными тканями (рис. 2B).
Определение механических характеристик
Реологические измерения децеллюляризованных легочных гидрогелей проводили с установкой параллельной пластины 20 мм для получения гидрогелевого диска толщиной 1 мм (рис. 3А). Частотная развертка использовалась для оптимизации значений деформации, используемых в измерениях. Средний модуль накопления (G') и модуль потерь (G'') гидрогелей, полученных методом замораживания-оттаивания, составили соответственно 204 Па и 28,4 Па, что было значительно жестче, чем у гидрогелей, полученных методом Triton-X-100 (рис. 3B-C). Интересно, что испытания на восстановление ползучести показали, что гидрогели, полученные методами замораживания-оттаивания и Triton-X-100, имеют различную реакцию на напряжение, что указывает на то, что гидрогели обладают различными вязкоупругими свойствами (рис. 3D).
Рисунок 1: Схематическое изображение процесса децеллюляризации. Ткань легких крупного рогатого скота препарировали на мелкие кусочки и тщательно промывали. Удаление клеточного содержимого достигалось двумя различными методами. Физический метод с повторяющимися циклами замораживания-оттаивания и химический метод с обработкой Triton-X-100. Лечение ДНКазой проводили обоими методами для удаления остаточной ДНК; После лиофилизации децеллюляризованных тканей проводили этапы криомирования, пепсинического расщепления, нейтрализации и гелеобразования. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Криосекция и окрашивание нативных и децеллюляризованных тканей легких крупного рогатого скота. (А) Нативные и децеллюляризованные кусочки легочной ткани крупного рогатого скота фиксировали 3,7% раствором формальдегида, погружали в 30%-ный раствор сахарозы в PBS, затем помещали в компаунд с оптимальной температурой резания (OCT) и замораживали. Для каждого образца срезы по 10 мкм были установлены на предметные стекла для продолжения окрашивания. (B) Репрезентативные изображения нативных и децеллюляризованных образцов методами замораживания-оттаивания или Triton-X-100. Были проведены окрашивание ядра гематоксилином и эозином (H&E), окрашивание коллагена красным Sirius и окрашивание алциановым синим для sGAG. Масштабная линейка: 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Измерение механических свойств децеллюляризованных легочных гидрогелей ECM. (A) Репрезентативное изображение термически сшитого децеллюляризованного гидрогеля легкого после механической характеристики. Колебательную реологию проводили с помощью реометра с параллельной геометрией пластины. Реологические свойства децеллюляризованных гидрогелей, (B) модуль накопления (G'), (C) модуль потерь (G''), (D) тест на восстановление ползучести для оценки поведения гидрогелей при релаксации напряжений. Столбцы погрешности представляют собой s.d. (*p < 0.05), n=3. Для статистического анализа использовали непарный t-критерий с поправкой Уэлча. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Гидрогели органного происхождения стали многообещающими моделями, которые повторяют нативную ткань ECM и имитируют органотипическую клеточную функцию. Несмотря на то, что децеллюляризованная ВКМ легких часто используется в тканевой инженерии, тщательная характеристика состава и механических свойств биоматериала поможет лучше понять, как взаимодействия между клеткой и ВКМ могут быть модулированы для моделирования биологических процессов во время гомеостаза или заболевания. В частности, оценка и контроль механических свойств восстановленных гидрогелей, таких как жесткость и вязкоупругость, имеет большое значение, поскольку они подразумеваются при регулировании ряда клеточных явлений. Поэтому крайне важно сравнить и оценить различные методы децеллюляризации для получения гидрогелей dECM с точки зрения биохимического состава и механических аспектов 20,23. Здесь децеллюляризация легких крупного рогатого скота была продемонстрирована с помощью двух различных подходов: циклов замораживания-оттаивания, которые в основном основывались на механическом разрушении и удалении содержимого ДНК, а также химического удаления ядерного содержимого с использованием обычного моющего средства Triton-X-100 (рис. 1). Для метода замораживания-оттаивания важно обеспечить, чтобы все образцы тканей были заморожены и надлежащим образом разморожены между жидким азотом и водяной баней по автоматизированному и повторяющемуся пути24. Для этого образцы тканей могут быть разделены на несколько пробирок и погружены в контейнер с азотом для замораживания, а затем на водяную баню для размораживания. Смена раствора Triton-X-100 каждые 24 ч имеет решающее значение для химического метода, позволяющего эффективно нарушать клеточное содержимое21. Лечение ДНКазой использовалось в обоих методах для дальнейшего усиления расщепления оставшейся ДНК, что могло снизить жизнеспособность инкапсулированных клеток. Оба метода успешно элиминировали клеточный материал во время децеллюляризации, при этом следовые количества ДНК оставались в обоих случаях20. Примечательно, что коммерчески доступные продукты внеклеточного матрикса также содержат небольшие количества остаточной ДНК без неблагоприятного влияния на цитосовместимость или иммунные реакции у хозяев после имплантации для их использования в тканевой инженерии и трансляционных исследованиях20,25.
ECM содержит множество белковых и полисахаридных макромолекул, таких как коллагены, эластины и протеогликаны, которые играют важнейшую регуляторную роль в клеточной сигнализации26. Таким образом, нативные скаффолды, полученные из ECM, должны демонстрировать удержание таких клеточных лигандов ECM. С этой целью были проведены окрашивание коллагеном и sGAG для сравнения состава ECM децеллюляризованных матриц с составом нативных тканей. Результаты показывают, что содержание коллагена и sGAG сохранялось в децеллюляризованных тканях с помощью методов замораживания-оттаивания и децеллюляризации Triton-X-100, что позволяет предположить, что они обеспечивают нативное микроокружение ECM в восстановленных скаффолдах20,26. Структурная организация составляющих ВКМ показала различия в зависимости от метода децеллюляризации, несмотря на незначительные различия в содержании ВКМ. Несмотря на то, что репрезентативные изображения показали большее сходство между децеллюляризацией легочной ткани на основе детергентов и окрашиванием нативной легочной ткани, оба протокола успешно сохранили нативные белки ECM в целом (рис. 2).
Механические свойства 3D-моделей тканей играют решающую роль в исследованиях клеточных культур, поскольку как рост, так и поведение клеток в значительной степени определяются механическими характеристиками нативного ECM 27,28,29,30. Различные методы децеллюляризации оказывают отчетливое влияние на процесс гелеобразования, а также на конечную жесткость и вязкоупругость гидрогелей dECM. Эти результаты показывают, что метод замораживания-оттаивания позволяет получить более прочные и жесткие гидрогели, чем метод Triton-X-100. Кроме того, в нашем предыдущем исследовании мы продемонстрировали, что жесткость гидрогелей dECM при замораживании-оттаивании может быть отрегулирована путем изменения концентрации лиганда и может быть снижена в соответствии с жесткостью гидрогелей dECM20, полученных из Triton-X-100. Вязкоупругость — это особенность нативных тканевых матриц, которая указывает на вязкое и упругое поведение в ответ на механическую деформацию. Недавние исследования выявили роль вязкоупругости ECM в пролиферации, морфологии и дифференцировке клеток29,30. Это исследование показывает, что гидрогели dECM легких являются стресс-расслабляющими материалами, подобными нативному фибрину, коллагену или восстановленной базальной мембране. Более того, результаты показывают, что гидрогели dECM, полученные методом Triton-X-100, восстанавливаются быстрее, чем гидрогели, полученные методом замораживания-оттаивания. Таким образом, выбор метода децеллюляризации сильно влияет на реакцию ползучести и кинетику релаксации получаемых dECM-гелей.
Описанные здесь методы децеллюляризации используют бычье легкое для восстановления биохимических и механических характеристик ВКМ легочной ткани. Мы точно охарактеризовали биохимический и физический состав ВКМ после процесса децеллюляризации. Основной проблемой в методах децеллюляризации является сохранение состава ЭКМ, что напрямую влияет на гелеобразующую способность гидрогелей dECM между партиями. Использование легочной ткани от одного и того же донора является важным параметром для преодоления вариабельности от партии к партии. Несмотря на то, что использовались здоровые нативные ткани, вариабельность между донорами неизбежна. В целом, методы замораживания-оттаивания и Triton-X-100 показывают многообещающий потенциал использования нативных гидрогелей dECM в моделировании заболеваний легких.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Все авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Эта работа была профинансирована Советом по научным и технологическим исследованиям Турции (TÜBİTAK) (грант No 118C238). Вся ответственность за публикацию/статью лежит на владельце публикации. Финансовая поддержка, полученная от TÜBİTAK, не означает, что содержание публикации одобрено TÜBİTAK в научном смысле. Авторы выражают признательность за пользование услугами и оборудованием Исследовательского центра трансляционной медицины Университета Коч (KUTTAM). Рисунки 1 и 2a были созданы с помощью Biorender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Absolute ethanol | ISOLAB | 64-17-5 | |
| Acetic acid | ISOLAB | 64-19-7 | |
| Alcian blue solution | Sigma-Aldrich | B8438 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| Discovery HR-2 rheometer | TA Instruments | ||
| Entellan mounting medium | Merck | 107960 | |
| Eosin solution | Bright-slide | 2.BS01-105-1000 | |
| Formaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 50-980-485 | |
| Hydrochloric acid | Merck | 100317 | |
| Iodine | Sigma-Aldrich | 3002 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | 7786-30-3 | |
| Mayer's haematoxylin staining solution | Merck | 2.BS01-103-1000 | |
| O.C.T compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Penicillin/Streptomycin | Biowest | L0018-100 | |
| Pepsin from porcine gastric mucosa | Sigma-Aldrich | P6887 | |
| Picric acid | Polysciences | 88-89-1 | |
| Sirius Red | Polysciences | 09400-25 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Triton-X-100 | Merck | 112298 |
References
- Zhu, X., et al. Ordered micropattern arrays fabricated by lung-derived dECM hydrogels for chemotherapeutic drug screening. Mater Today Bio. 15, 100274 (2022).
- Ulldemolins, A., et al. Lung extracellular matrix hydrogels-derived vesicles contribute to epithelial lung repair. Polymers. 14 (22), 4907 (2022).
- Biehl, A., et al. Towards a standardized multi-tissue decellularization protocol for the derivation of extracellular matrix materials. Biomater Sci. 11 (2), 641-654 (2023).
- Pak, J., Lee, J. H., Park, K. S., Jeong, B. C., Lee, S. H. Regeneration of cartilage in human knee osteoarthritis with autologous adipose tissue-derived stem cells and autologous extracellular matrix. Biores Open Access. 5 (1), 192-200 (2016).
- Spang, M. T., Christman, K. L.
- Schwartz, A. D., et al. A biomaterial screening approach reveals microenvironmental mechanisms of drug resistance. Integr Biol. 9 (12), 912-924 (2017).
- Monteiro, M. V., Gaspar, V. M., Ferreira, L. P., Mano, J. F. Hydrogel 3D in vitro tumor models for screening cell aggregation mediated drug response. Biomater Sci. 8 (7), 1855-1864 (2020).
- Nakamura, R., Nakamura, F., Fukunaga, S. Changes in the composition of the extracellular matrix accumulated by mesenchymal stem cells during in vitro expansion. Anim Sci J. 85 (6), 706-713 (2014).
- Bual, R. P., Ijima, H. Intact extracellular matrix component promotes maintenance of liver-specific functions and larger aggregates formation of primary rat hepatocytes. Regen Ther. 11, 258-268 (2019).
- Jhala, D., Vasita, R. A review on extracellular matrix mimicking strategies for an artificial stem cell niche. Poly Rev. 55 (4), 561-595 (2015).
- Jeong, W., Kim, M. K., Kang, H. W. Effect of detergent type on the performance of liver decellularized extracellular matrix-based bio-inks. J Tissue Eng. 12, 2041731421997091 (2021).
- Lee, S. J., Lee, J. H., Park, J., Kim, W. D., Park, S. A. Fabrication of 3D printing scaffold with porcine skin decellularized bio-ink for soft tissue engineering. Materials. 13 (16), 3522 (2020).
- Won, J. Y., et al. A potential dermal substitute using decellularized dermis extracellular matrix derived bio-ink. Artif Cells Nanomed Biotechnol. 47 (1), 644-649 (2019).
- Lin, Z., et al. Bioactive decellularized extracellular matrix hydrogel microspheres fabricated using a temperature-controlling microfluidic system. ACS Biomater Sci Eng. 8 (4), 1644-1655 (2022).
- Kaushik, N., Kim, S., Suh, Y., Lee, S. J. Proinvasive extracellular matrix remodeling for tumor progression. Arch Pharm Res. 42 (1), 40-47 (2019).
- Lu, P., Weaver, V. M., Werb, Z. The extracellular matrix: a dynamic niche in cancer progression. J Cell Biol. 196 (4), 395-406 (2012).
- Poltavets, V., Kochetkova, M., Pitson, S. M., Samuel, M. S. The role of the extracellular matrix and its molecular and cellular regulators in cancer cell plasticity. Front Oncol. 8, 431 (2018).
- Takeda, M., et al. Development of a drug screening system using three-dimensional cardiac tissues containing multiple cell types. Sci Rep. 11 (1), 5654 (2021).
- Jensen, A. R. D., et al. Organ-specific, fibroblast-derived matrix as a tool for studying breast cancer metastasis. Cancers (Basel). 13 (13), 3331 (2021).
- Kuşoğlu, A., et al. Different decellularization methods in bovine lung tissue reveals distinct biochemical composition, stiffness, and viscoelasticity in reconstituted hydrogels. ACS Appl Bio Mater. 6 (2), 793-805 (2023).
- Fernández-Pérez, J., Ahearne, M. The impact of decellularization methods on extracellular matrix derived hydrogels. Sci Rep. 9 (1), 14933 (2019).
- Park, S., Kim, T. H., Kim, S. H., You, S., Jung, Y. Three-dimensional vascularized lung cancer-on-a-chip with lung extracellular matrix hydrogels for in vitro screening. Cancers (Basel). 13 (16), 3930 (2021).
- Uriarte, J. J., Uhl, F. E., Rolandsson Enes, S. E., Pouliot, R. A., Weiss, D. J. Lung bioengineering: advances and challenges in lung decellularization and recellularization. Curr Opin Organ Transplant. 23 (6), 673-678 (2018).
- Roth, S. P., et al. Automated freeze-thaw cycles for decellularization of tendon tissue - a pilot study. BMC Biotechnol. 17 (1), 13 (2017).
- Gilbert, T. W., Freund, J. M., Badylak, S. F. Quantification of DNA in biologic scaffold materials. J Surg Res. 152 (1), 135-139 (2009).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
- Cox, T. R.
- Vining, K. H., Mooney, D. J. Mechanical forces direct stem cell behaviour in development and regeneration. Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (12), 728-742 (2017).
- Chaudhuri, O., Cooper-White, J., Janmey, P. A., Mooney, D. J. Effects of extracellular matrix viscoelasticity on cellular behaviour. Nature. 584 (7822), 535-546 (2020).
- Chaudhuri, O., et al. Hydrogels with tunable stress relaxation regulate stem cell fate and activity. Nat Mater. 15 (3), 326-334 (2016).
