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Behavior

Akupunkturbehandlung in einem Mausmodell der chronischen Hypoxie-induzierten kognitiven Dysfunktion

Published: December 8, 2023 doi: 10.3791/65784
Automatic Translation
*1, *2,3, 4, 5,6, 3,5, 4,7, 2,3, 8, 5,6
1Heilongjiang University of Chinese Medicine, 2Hebei Provincial Key Laboratory of Luobing, 3Key Laboratory of State Administration of TCM (Cardio-Cerebral Vessel Collateral Disease), 4Hebei University of Chinese Medicine, 5Shijiazhuang Compound Traditional Chinese Medicine Technology Innovation Center, 6National Key Laboratory of Luobing Research and Innovative Chinese Medicine, 7Shijiazhuang Yiling Pharmaceutical Co., Ltd, 8The Second Affiliated Hospital of Heilongjiang University of Chinese Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Durchführung einer milden Anästhesie- und Akupunkturbehandlung an einem chronischen Hypoxie-Mausmodell und die Durchführung von Verhaltenstests zur Beurteilung der kognitiven Veränderungen nach der Behandlung.

Abstract

Die Behandlung von zentralnervösen Erkrankungen hat den medizinischen Bereich immer wieder vor große Herausforderungen gestellt. Akupunktur, eine nicht-pharmakologische Praxis, die in der traditionellen chinesischen Medizin verwurzelt ist, beinhaltet das Einführen feiner Nadeln in präzise Punkte des Körpers und wird häufig zur Behandlung verschiedener Erkrankungen eingesetzt. In jüngster Zeit hat sich die Akupunktur als vielversprechende therapeutische Intervention für eine Reihe von neurologischen Erkrankungen herausgestellt, darunter Angstzustände und Atemwegserkrankungen. Das Potenzial der Akupunktur bei der Behandlung von kognitiven Dysfunktionen, die durch chronische Hypoxie induziert werden, wurde jedoch noch nicht erforscht. In diesem Artikel wird ein umfassendes Protokoll für die Etablierung eines Mausmodells für chronische Hypoxie-induzierte kognitive Beeinträchtigungen, die Verabreichung einer milden Anästhesie, die Durchführung einer Akupunkturbehandlung und die Bewertung von Verhaltensänderungen und Gedächtnisfähigkeiten mithilfe von Freilandtests und Wasserlabyrinthen vorgestellt. Das Schritt-für-Schritt-Protokoll enthält detaillierte Anweisungen zur genauen Lokalisierung und Positionierung von Akupunkturpunkten und Nadeln zur kognitiven Verbesserung. Durch die Anwendung dieses Protokolls können Forscher systematische Studien durchführen, um das therapeutische Potenzial der Akupunktur bei kognitiver Dysfunktion gründlich zu bewerten.

Introduction

Die Weltbevölkerung steht derzeit vor einem kritischen Alterungsproblem, das zu einem raschen Anstieg der Prävalenz kognitiver Störungen führt. Die weltweite Inzidenz kognitiver Beeinträchtigungen liegt bei etwa 53,97 pro 1000 Personenjahre1. Chronische zerebrale Hypoxie, die durch vaskuläre Funktionsstörungen oder Durchblutungs-/Atemwegserkrankungen verursacht wird, bleibt einer der Hauptrisikofaktoren für altersbedingte Demenz2. Frühere Studien haben gezeigt, dass zerebrale Hypoxie die Amyloid-β-Ablagerung durch Modifikation der BACE1-Expression erhöhen kann3. Darüber hinaus wurde Hypoxie mit Gliazelldysregulation und Neuroinflammation in Verbindung gebracht 4,5. Trotz des wachsenden Ausmaßes dieses Problems fehlen derzeit wirksame westliche Medikamente zur Verhinderung eines chronischen Hypoxie-induzierten kognitiven Verfalls. Die nicht-pharmakologische traditionelle chinesische Medizin, insbesondere die Akupunktur, wird seit Tausenden von Jahren zur Behandlung kognitiver Störungen eingesetzt und hat vielversprechende Ergebnisse bei der Linderung neurodegenerativer Erkrankungen gezeigt 6,7. Die Baihui-, Shenting- und Zusanli-Akupunkturpunkte sind wirksame Punkte zur Behandlung kognitiver Dysfunktion 8,9. Klinische Studien haben gezeigt, dass die Elektroakupunkturtherapie die Montreal Cognitive Assessment (MoCA) und die Mini-Mental State Examination (MMSE) bei Patienten mit vaskulärer kognitiver Beeinträchtigung signifikant verbessert und die kognitive Dysfunktion wirksam verbessert8. Obwohl Studien darauf hindeuten, dass Akupunktur die Gedächtnisfähigkeit von Ratten mit arterieller Ligatur signifikant verbessern kann - ein akutes zerebrales Hypoxie-Modell10, ein akutes zerebrales Hypoxie-Modell, gibt es keinen Bericht über die Auswirkungen der Akupunktur in einem Nagetiermodell mit chronischen Hypoxie-induzierten kognitiven Störungen. Die mangelnde Erforschung des Mechanismus hat seine klinische Anwendung erheblich behindert.

Frühere Forschungen haben gezeigt, dass Ratten, die über einen Zeitraum von 8 Wochen einer hypoxischen Umgebung ausgesetzt werden, den oxidativen Stress und die Entzündung im Gehirn signifikant erhöhen können, was zu einem Rückgang der Gedächtnisfunktion führt11. Die vorliegende Studie zielt darauf ab, den Einfluss der Akupunktur auf Nagetiermodelle zu untersuchen, um unser Verständnis zu verbessern. Es ist jedoch erwähnenswert, dass während der Akupunkturbehandlung bei Nagetieren typischerweise eine Anästhesie erforderlich ist, da es bei wiederholter Stimulation zu Unruhe kommen kann. Eine längere Anästhesie kann die kognitive Funktion bei Mäusen erheblich beeinträchtigen, da die meisten Anästhetika die neuronale Aktivität unterdrücken und die Informationsverarbeitung behindern können, was zu Verhaltensdefiziten führt12. Mehrere Studien haben gezeigt, dass die Verabreichung von 2,5 % Sevofluran über eine Dauer von 6 Stunden das räumliche Gedächtnis, die Lernfähigkeit und die Aufmerksamkeit bei Mäusen erheblich beeinträchtigen kann13. Darüber hinaus deuten Hinweise darauf hin, dass hohe Anästhesiedosen bei Mäusen zum neuronalen Tod oder zu Nervenschäden führen können14. Daher ist es unerlässlich, einen geeigneten Ansatz zu finden, um die Gesamtmenge der verwendeten Anästhesie zu minimieren. In dieser Studie stellen wir eine wirksame Akupunkturmethode zur Behandlung von Mäusen mit kognitiven Beeinträchtigungen vor, zusammen mit Verhaltenstests zur Beurteilung ihrer Gedächtnisfähigkeiten. Wichtig ist, dass wir eine modifizierte Anästhesietechnik vor der Behandlung vorstellen, die die Gesamtdosis der während des Experiments verabreichten Anästhesie effektiv reduzieren kann.

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Protocol

Die Tierversuche wurden mit Genehmigung des Komitees für Tierversuche und Ethik des Hebei Yiling Medical Research Institute (Genehmigungsnummer: N2022148) durchgeführt. Männliche C57BL/6J-Mäuse mit einem Gewicht von 18-22 g (siehe Materialtabelle) wurden im neuen Arzneimittelbewertungszentrum des Hebei Yiling Medical Research Institute untergebracht. Sie wurden mit normalem Futter und sauberem Wasser versorgt und täglich 12 Stunden künstlichem Licht ausgesetzt. Die Räume hielten einen kontrollierten Temperaturbereich von 20-26 °C und eine relative Luftfeuchtigkeit von 40%-70% aufrecht.

1. Etablierung eines chronischen Hypoxie-Mausmodells (Abbildung 1)

  1. Bereiten Sie vor Beginn des Versuchs Tierkäfige unter normalem atmosphärischem Druck und Käfige mit einer kontinuierlichen sauerstoffarmen Umgebung vor. Schaffen Sie eine kontinuierliche sauerstoffarme Umgebung, indem Sie ein automatisiertes Gassteuerungssystem verwenden, um die Kammer mit einer Mischung aus reinem Sauerstoff und Stickstoff zu spülen.
    HINWEIS: Dieses System ist so programmiert, dass es den elektromagnetischen Ventilschalter steuert und so eine präzise Gaszufuhr sowohl in Bezug auf die Zeit als auch auf die Konzentration gewährleistet.
  2. Teilen Sie Mäuse nach dem Zufallsprinzip in drei Gruppen ein: eine Kontrollgruppe (Con), eine Modellgruppe (CH) und eine Elektroakupunkturgruppe (EA + CH). Platzieren Sie Kontroll- und Modell-/Elektroakupunkturmäuse separat in den beiden Käfigen, mit 10 Mäusen pro Käfig. Halten Sie den Lichtzyklus bei 12 h/12 h (hell/dunkel).
    HINWEIS: In der Kontrollgruppe wird keine Behandlung oder Hypoxie induziert (Con). Die Modellgruppe (CH) besteht aus Mäusen mit chronischer Hypoxie. Die Elektroakupunktur-Gruppe (EA + CH) umfasst Hypoxie-induzierte Mäuse, die mit Elektroakupunktur behandelt werden.
  3. Um eine chronische Hypoxie zu entwickeln, legen Sie die Parameter der sauerstoffarmen Kammer fest, indem Sie ein digitales Sauerstoffmessgerät verwenden, um die Gasdurchflussrate zu regulieren und eine Sauerstoffkonzentration von 10 % aufrechtzuerhalten. Setzen Sie die Tiere um 9:00 Uhr in die sauerstoffarme Kammer und entfernen Sie sie um 17:00 Uhr, was zu insgesamt 8 Stunden ununterbrochener Exposition gegenüber niedrigem Sauerstoffgehalt pro Tag für 3 Monate führt.
    Anmerkungen: Bei der Einrichtung der Stickstoffgaszufuhr zur Verringerung der Sauerstoffkonzentration wird empfohlen, langsam vorzugehen, um eine übermäßige Einführung von Stickstoffgas auf einmal zu verhindern, da dies zum Tod von Tieren führt.
  4. Bewerten Sie das Modell der chronischen Hypoxie-induzierten kognitiven Dysfunktion mit histologischen Untersuchungen und Verhaltenstests: dem Freilandtest15 und dem Wasserlabyrinthtest16.

2. Anästhesie (Abbildung 2)

  1. Bereiten Sie das Kleintieranästhesiegerät (siehe Materialtabelle) und das Heizkissen mit konstanter Temperatur vor.
    HINWEIS: Während der Anästhesie sind die Tiere anfällig für Unterkühlung, was die Notwendigkeit unterstreicht, ein Heizkissen mit konstanter Temperatur zur Isolierung zu verwenden.
  2. Legen Sie die Maus in die Anästhesie-Induktionsbox und induzieren Sie sie schnell mit 2%-2,5% Isofluran in Sauerstoff (siehe Materialtabelle) für ca. 1 min.
    HINWEIS: Diese kurzfristige Vorbehandlung ist ein entscheidender Schritt, um sicherzustellen, dass Mäuse über einen längeren Zeitraum unter niedriger Konzentration gedeihen können.
  3. Sobald ihre Erregbarkeit nachgelassen hat, kneifen Sie den Zeh der Maus, um ihren Reflex zu überprüfen. Übertragen Sie dann die Maus auf das Heizkissen mit konstanter Temperatur (37 °C).
  4. Stellen Sie die Anästhesieflussrate auf ca. 0,5% Konzentration ein. Schließen Sie das Anästhesiegerät an Mund und Nase der Maus an. Fahren Sie mit der Elektroakupunkturbehandlung fort und stellen Sie gleichzeitig die Aufrechterhaltung der Anästhesie sicher.
    HINWEIS: Die Wirkung der Anästhesie wurde bestätigt, als die Mäuse aufhörten zu blinken. Die Wirkung der Anästhesie kann mindestens 30 Minuten anhalten.

3. Elektroakupunktur-Behandlung

  1. Um die kognitive Dysfunktion effektiv zu verbessern, wählen Sie spezifische Akupunkturpunkte wie Baihui (GV20), Shenting (GV24) und bilaterales Zusanli (ST36) aus, basierend auf der Theorie und klinischen Erfahrung der traditionellen chinesischen Medizin (Abbildung 3). Verabreichen Sie die Elektroakupunkturbehandlung 2 Wochen vor Abschluss des Modellierungsprozesses.
    1. Suchen Sie den GV20-Akupunkturpunkt auf der Mittellinie der Stirn, in der Mitte einer Linie, die die Ohrspitzen verbindet7. Die Einstichtiefe der Akupunkturnadel muss 2 mm betragen.
    2. Platzieren Sie den GV24-Akupunkturpunkt 1,3 mm direkt über dem Mittelpunkt der Mausaugen auf der Mittellinie der Stirn17. Die Einstichtiefe der Akupunkturnadel muss 2 mm betragen.
    3. Lokalisieren Sie den ST36-Akupunkturpunkt an der Außenseite des Kniegelenks, etwa 2 mm unterhalb des Wadenbeinkopfes18,19. Die Einstichtiefe der Akupunkturnadel muss 3-4 mm betragen.
  2. Bereiten Sie Einweg-Akupunkturnadeln (siehe Materialtabelle) und ein Elektroakupunkturgerät (siehe Materialtabelle) für den Eingriff vor (Abbildung 4).
  3. Legen Sie die Maus in Bauchlage unter leichter Narkose mit 0,5 % Isofluran und stellen Sie sicher, dass ihre Köpfe und Gliedmaßen ruhig sind. Halten Sie eine Edelstahlnadel (Durchmesser: 0,18 mm; Länge: 7 mm) mit der rechten Hand mit Daumen, Zeigefinger und Mittelfinger.
  4. Führen Sie die Akupunktur an den Akupunkturpunkten GV20 und GV24 transversal für 2 mm Tiefe durch und heben Sie die Haut am Kopf der Maus mit der linken Hand an. Punktieren Sie den ST36-Akupunkturpunkt vertikal für 3-4 mm Tiefe, indem Sie den Wadenkopf an der seitlichen Seite des Kniegelenks der Maus berühren und mit dem linken Daumen auf die Haut drücken.
    HINWEIS: Bei den Akupunkturpunkten am Kopf ist es ratsam, die Nadeln in der Reihenfolge von GV24 gefolgt von GV20 einzuführen. Diese Anordnung erleichtert den Betriebskomfort. Akupunkturpunkte sind diskrete anatomische Orte und keine stationären Punkte. Folglich haben geringfügige Abweichungen im Winkel des Nadeleinstichs keinen Einfluss auf die therapeutische Wirksamkeit, wie dies bei Patienten mit Elektroakupunktur im klinischen Umfeld der Fall ist.
  5. Schließen Sie das elektronische Akupunkturgerät an die Nadeln an, wobei GV20 und der linke ST36 mit einem Elektrodensatz und GV24 und der rechte ST36 mit einem anderen verbunden sind (Abbildung 4). Wählen Sie den Dauerstrichmodus mit einer elektrischen Stromstärke von 2 mA und einer Frequenz von 2 Hz20,21. Bestätigen Sie die ideale Behandlung, indem Sie lokales leichtes Zittern an den Akupunkturpunkten und eine ruhige Toleranz der Maus beobachten.
    1. Schließen Sie beim Anschließen des elektrischen Akupunkturinstruments das proximale Ende der Nadel an. Dies trägt dazu bei, den Aufprall durch das Gewicht der Verbindungsleitung zu minimieren und somit ein Ablösen der Nadel zu verhindern. Sichern Sie bei Bedarf die horizontal eingeführte Nadel und die Verbindungsleitung mit Klebeband.
  6. Verabreichen Sie die tägliche Behandlung für 30 Minuten jeden Tag an 6 aufeinanderfolgenden Tagen, mit einem einzigen Ruhetag zwischen jedem Behandlungszyklus.

4. Offener Feldtest (Abbildung 5)

HINWEIS: Der Freilandtest ist eine konventionelle Methode zur Beurteilung des autonomen Verhaltens, des Erkundungsverhaltens, der kognitiven Fähigkeiten und des Angstverhaltens von Versuchstieren in neuartigen und unbekannten Umgebungen22. Es besteht aus einer Freifeld-Reaktionsbox und einem Aufzeichnungsgerät.

  1. Um den Test durchzuführen, bereiten Sie einen weißwandigen Würfel mit den Maßen 50 cm × 50 cm × 30 cm vor, wobei der Boden in 25 gleiche Quadrate mit den Maßen 10 cm × 10 cm unterteilt ist.
  2. Legen Sie die Maus zur Akklimatisierung in die Reaktionsbox für das offene Feld. Lassen Sie die Maus den Testraum erkunden und sich während der Eingewöhnungsphase mit der neuen Umgebung vertraut machen. Führen Sie den Freilandtest durch, nachdem Sie die Maus 1 h lang an die Versuchsumgebung gewöhnt haben.
    HINWEIS: Dies garantiert die Minimierung von Ängsten oder Stress, die durch Veränderungen in der Umgebung verursacht werden, und ermöglicht so präzisere Ergebnisse bei den nachfolgenden Verhaltensbewertungen.
  3. Platzieren Sie die Maus in der Mitte der Box und überwachen Sie sie 10 Minuten lang, nachdem Sie die Maus 2 Minuten lang an die Umgebung angepasst haben.
    1. Verwenden Sie ein Video-Tracking-System (siehe Materialtabelle), um die Bewegungsbahn der Maus, die zurückgelegte Gesamtstrecke, die im zentralen Bereich verbrachte Zeit, die Geschwindigkeit des Durchquerens des zentralen Bereichs und die Anzahl der Eintritte in den zentralen Bereich während des Tests aufzuzeichnen.
    2. Führen Sie die entsprechenden Vorgänge gemäß den Anweisungen im Produkthandbuch des Videoverfolgungssystems durch. Jede Maus wird einem einzelnen Test unterzogen und beginnt mit der Erkundung an derselben Stelle in der Box.
    3. Reinigen Sie die offene Feldbox nach jedem Test mit 75 % Ethanol, um falsche Ergebnisse durch Geruchsstörungen bei der Verwendung einer Maus zu vermeiden.

5. Wasserlabyrinth (Abbildung 5)

HINWEIS: Der Wasserlabyrinth-Test wird häufig als Instrument zur Verhaltensbewertung in Experimenten mit Mäusen eingesetzt, um ihre räumlichen Lern- und Gedächtnisfähigkeiten zu bewerten23.

  1. Bereiten Sie einen runden Wassertank mit einem Durchmesser von 120 cm und einer Tiefe von 30 cm vor. Teilen Sie den Tank in vier gleiche Quadranten: I, II, III und IV. Wenn Sie im Experiment schwarze Mäuse verwenden, verwenden Sie einen Weißwassertank. Verwenden Sie für weiße Mäuse einen Schwarzwassertank.
  2. Platzieren Sie Vorhänge um den runden Wassertank, um zu verhindern, dass die Maus die Forscher während des Tests sieht.
  3. Positionieren Sie verschiedene Markierungen auf der Oberseite des Wassertanks als visuelle Hinweise für die räumliche Orientierung. Stellen Sie sicher, dass diese Marker während des gesamten Experiments stationär bleiben, um die Konsistenz zu wahren.
  4. Positionieren Sie eine kreisförmige Plattform mit einem Durchmesser von 10 cm im Quadranten III des Wassertanks als Zielbereich. Stellen Sie sicher, dass die Plattform an jedem gewünschten Ort leicht bewegt und gesichert werden kann.
  5. Während des gesamten Experiments Wasser in den Tank einleiten, während ein Temperaturbereich von 22-24 °C eingehalten wird.
    1. Stellen Sie sicher, dass der Wasserstand konstant 1 cm über der Zielplattform bleibt. Geben Sie eine 20%ige Konzentration an ungiftigem Titandioxid in das Wasser, um einen deutlichen Kontrast zwischen den schwarzen Mäusen und dem weißen Hintergrund zu erzielen. Dieser Kontrast erleichtert es der Kamera, die Bewegungen der Maus und relevante Parameter aufzuzeichnen.
  6. Führen Sie einen 5-tägigen kontinuierlichen räumlichen Erkundungstest durch, indem Sie jede Maus nacheinander in die Quadranten I, II, III und IV einteilen.
    1. Positionieren Sie die Maus mit Blick auf die Wand. Bewegen Sie sich vom Labyrinth weg, um zu verhindern, dass die Maus die Position des Experimentators als Referenzpunkt verwendet. Notieren Sie die Zeit, die die Maus benötigt, um die Plattform zu finden.
    2. Wenn die Maus die Unterwasserplattform nicht innerhalb von 90 s findet, führen Sie die Maus zur Plattform und sorgen Sie für eine 30-sekündige Lernzeit. Notieren Sie zusätzlich die Latenzzeit als 90 s.
    3. Wenn die Maus die Unterwasserplattform innerhalb von 90 s findet, lassen Sie sie zum Lernen 10 s auf der Plattform bleiben, bevor Sie sie aus dem Wassertank nehmen.
    4. Trocknen Sie die Maus mit einem Handtuch ab und setzen Sie sie in ihren Käfig zurück.
    5. Drehen Sie die Platzierung jeder Maus in jedem Quadranten alle 20 Minuten. Notieren Sie die Schwimmstrecke, die Geschwindigkeit und die Zeit, die jede Maus benötigt, um die Plattform zu finden (die Latenzzeit), mithilfe des Video-Tracking-Systems (siehe Materialtabelle) und führen Sie die entsprechenden Vorgänge gemäß den Anweisungen im Produkthandbuch aus.
    6. Stellen Sie die Plattform an Tag 1 1 1 cm über der Wasseroberfläche auf. Stellen Sie die Plattform an den Tagen 2-5 in einer Tiefe von 1 cm unter der Wasseroberfläche auf.
  7. Entfernen Sie an Tag 6 die Plattform aus dem Zielquadranten und führen Sie einen räumlichen Erkundungstest durch.
    1. Platzieren Sie die Maus in Quadrant I, um 90 s lang frei zu erkunden. Der Computer zeichnet die Schwimmbahn der Maus, die im Zielquadranten verbrachte Zeit und die Anzahl der Überquerungen der Plattform auf.
      HINWEIS: Um experimentelle Fehler zu minimieren, die durch menschliche Faktoren verursacht werden, ist es wichtig, die Position des Referenzpunkts im Wasserlabyrinth-Experiment fest zu halten. Außerdem sollte sich der Experimentator sofort zurückziehen, nachdem er die Maus ins Wasser gelegt hat. Nach Abschluss des Experiments sollten die Mäuse mit einem Handtuch getrocknet und wieder in ihre Käfige gesetzt werden, um die Wärme zu erhalten.

6. Hämatoxylin- und Eosin (HE)-Färbung (Abbildung 6)

HINWEIS: Die histologische Untersuchung der Hippocampusregion hilft bei der Beurteilung der Etablierung des Hypoxiemodells und der Bestimmung der Wirksamkeit der Akupunkturbehandlung.

  1. Nach dem Verhaltensexperiment wird die Maus mit einer intraperitonealen Injektion von 20 mg/kg Pentobarbital-Natrium betäubt und mit 10%iger Paraformaldehydlösung (siehe Materialtabelle) perfundiert, um eine vollständige Körperdurchblutung zu gewährleisten. Isolieren Sie das Hirngewebe und tauchen Sie es 3 Tage lang bei Raumtemperatur (RT) in 10%ige Paraformaldehydlösung, um eine Fixierung zu erreichen.
  2. Legen Sie die Gehirnproben in eine Einbettungsbox. Anschließend waschen Sie die verarbeiteten Gehirnproben 6 h lang unter fließendem Wasser.
  3. Verwenden Sie einen automatisierten Gewebeprozessor, um die Proben mit einer Reihe von Alkohollösungen mit steigenden Konzentrationen zu dehydrieren, nämlich 60 % Ethanol für 1 Stunde, 70 % Ethanol für 1 Stunde, 90 % Ethanol für 1 Stunde, 95 % Ethanol für 2 Stunden und schließlich 100 % Ethanol für 2 Stunden.
  4. Tauchen Sie die Gewebeproben 2 h lang in Xylol, um Transparenz zu erreichen. Anschließend werden die permeabilisierten Proben nach Abschluss des Dehydratisierungsprozesses 3 h lang in Paraffinwachs überführt, das auf 60 °C erhitzt wird. Betten Sie sie schließlich in einen automatischen Prozessor ein.
  5. Verwenden Sie einen Rotationsschneider, um 4-μm-Abschnitte zu erhalten. Anschließend werden die Schnitte für eine Dauer von 3-8 Minuten einer Hämatoxylin-Färbung unterzogen, gefolgt von einer Eosin-Färbung für 1-3 Minuten.
  6. Übertragen Sie die gefärbten Abschnitte nacheinander in separate Behälter mit reinem Alkohol und Xylol. Versiegeln und sichern Sie dann die gefärbten Abschnitte mit neutralem Gummi, um sie für die pathologische Untersuchung unter einem Lichtmikroskop vorzubereiten.
  7. Verwenden Sie einen Diascanner (siehe Materialtabelle), um die Schichten zu scannen. Verwenden Sie anschließend die Betrachtungssoftware, um die HE-Färbeergebnisse für die Hippocampusregion zu erhalten. Vergleichen Sie die Anordnung der Neuronen und die Kondensation der neuronalen Kerne.

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Representative Results

Charakterisierung von Mausbewegungstrajektorien im Freilandexperiment
Die Trajektorienkarte zeigt, dass Mäuse in der normalen Gruppe eine tiefe Neigung zur Erkundung in unbekannten Umgebungen zeigen. Ihre Aktivitätstrajektorien konzentrieren sich hauptsächlich auf die Ecken und decken das gesamte offene Feld ab (linkes Feld). Im Gegensatz dazu zeigt die Langzeit-Hypoxie-Modellgruppe von Mäusen einen deutlich verminderten Wunsch, neue Umgebungen zu erkunden. Sie verweilen überwiegend in den Ecken, ohne ein Erkundungsverhalten in Richtung Mitte des offenen Feldes zu zeigen (mittleres Feld). Nach der Akupunkturbehandlung zeigt die explorative Aktivität von Hypoxie-induzierten Mäusen eine Verbesserung, und ihr Verhalten, sich in die Mitte des offenen Feldes zu wagen, wird wiederhergestellt (rechtes Bild) (Abbildung 5A).

Charakterisierung des räumlichen Lernens und Gedächtnisses bei Mäusen
In der normalen Gruppe verbrachten die Mäuse relativ viel Zeit im Zielquadranten und überquerten die Plattform häufiger, wie in der Trajektorienkarte (linkes Bild) gezeigt. Die hypoxische Langzeitmodellgruppe von Mäusen zeigte im Vergleich zur Normalgruppe ein geschwächtes räumliches Gedächtnis, was durch ihre Unfähigkeit angezeigt wird, den Zielquadranten innerhalb der angegebenen Zeit zu lokalisieren (mittleres Feld). Nach der Akupunkturbehandlung zeigten die Mäuse eine signifikante Verbesserung ihres Hypoxie-induzierten räumlichen Gedächtnisses. Sie zeigten ein organisierteres Erkundungsverhalten und verbrachten deutlich länger im Zielquadranten (rechtes Bild) (Abbildung 5B).

Histologische Untersuchung des Mäusehirns
In der Kontrollgruppe zeigte die Anordnung der Neuronen in der Hippocampusregion von Mäusen (oben links) eine Regelmäßigkeit, während sie in der Langzeit-hypoxischen Modellgruppe (oben rechts) gestört war. Umgekehrt zeigte die Behandlungsgruppe eine Verbesserung der Anordnung der Neuronen (unteres Bild). Darüber hinaus zeigte die Modellgruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe eine verstärkte Schrumpfung der neuronalen Kerne der Maus, aber dieser Effekt wurde in der Behandlungsgruppe teilweise gemildert. (Abbildung 6).

Figure 1
Abbildung 1: Etablierung eines Mausmodells für Hypoxie-induzierte kognitive Beeinträchtigung. Die Mäuse wurden von Tag 1 bis Tag 90 einer Hypoxie ausgesetzt. Die elektrische Akupunkturtherapie wurde ab dem 75. Tag täglich verabreicht, wobei jeder Behandlungszyklus 6 Tage und insgesamt 2 Behandlungszyklen dauerte. Zwischen den Zyklen gab es eine 1-tägige Pause. Verhaltenstests wurden an Tag 93 durchgeführt. Histologische Untersuchungen und Verhaltenstests können am 65. Tag durchgeführt werden, um die Etablierung des Modells in der Hippocampusregion zu bestätigen. Abkürzungen: Mo: Monat. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Anästhesievorbehandlung vor der Elektroakupunktur. Vor der Elektroakupunkturbehandlung wurden die Mäuse mit einem (A) Anästhesiegerät betäubt. Die Mäuse wurden dann in eine (B) Kammerbox mit (C) 2% Isofluran in der Kammer gelegt. (D) Die Dauer der modifizierten Anästhesiemethode war im Vergleich zur klassischen Anästhesiemethode kürzer. (E) Mäuse, die einer leichten Anästhesie ausgesetzt sind, behalten ihre Reaktion auf die Fußstimulation bei. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Anatomische Struktur der Akupunkturpunkte am Mäusekopf. Diese Abbildung zeigt die anatomischen Positionen von GV20 (Baihui), GV24 (Shenting) und ST36 (Zusanli) bei Mäusen. (A) Eine anatomische Ansicht des Mauskopfes, die die Stirn- und Scheitelknochen zeigt. (B) Eine anatomische Ansicht des Mausbeins, die das Schienbein, das Wadenbein und den Wadenkopf zeigt. (C) Positionen von Akupunkturpunkten auf dem Mauskopf. (D) GV20 befindet sich auf der Mittellinie der Stirn, in der Mitte zwischen den Ohrspitzen und direkt auf dem Scheitelbein. GV24 befindet sich auf der Mittellinie der Stirn, direkt vor der Verbindung von Stirn- und Scheitelbein. ST36 befindet sich an der Außenseite des Hinterbeins, ca. 2 mm unterhalb des Wadenkopfes. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Elektroakupunktur-Behandlung. Die Mäuse wurden unter Narkose an bestimmten Stellen von GV20 (Baihui), GV24 (Shenting) und bilateralem ST36 (Zusanli) einer Nadelstimulation unterzogen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5: Repräsentative Ergebnisse des Freifeldtests und des Wasserlabyrinthtests nach Elektroakupunkturbehandlung. (A) Der Freilandtest wurde durchgeführt, um die Verhaltensänderungen bei Mäusen zu bewerten, die einer chronischen Hypoxie (CH) und Akupunktur (EA) unterzogen wurden. Aus dem Test wurden drei repräsentative Trajektoriendiagramme generiert. (B) Der Wasserlabyrinth-Test wurde durchgeführt, um das räumliche Gedächtnis von Mäusen zu bewerten, die einer chronischen Hypoxie- und Akupunkturbehandlung unterzogen wurden. Aus dem Test wurden drei repräsentative Trajektoriendiagramme generiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 6
Abbildung 6: Histologische Untersuchung des Mäusehirns nach Elektroakupunkturbehandlung. Histologische Bilder der Mäuse in der Kontrollgruppe (oben links), der Hypoxie-Gruppe (oben rechts) und der Behandlungsgruppe (unteres Bild). Maßstabsbalken: 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

Bei der Akupunktur, einer nicht-pharmakologischen medizinischen Praxis, die vor über 2.000 Jahren in China ihren Ursprung hat, werden dünne Nadeln in bestimmte Punkte des Körpers eingeführt, die als Akupunkturpunkte bekannt sind. Es wird angenommen, dass diese Punkte durch Kanäle oder Meridiane verbunden sind, durch die die Lebensenergie des Körpers oder "Qi" fließt24. Durch die Stimulierung dieser Punkte zielt die Akupunktur darauf ab, das Gleichgewicht und die Harmonie des Körpers wiederherzustellen. Es hat sich gezeigt, dass es verschiedene Erkrankungen wirksam behandelt, darunter chronische Schmerzen, Angstzustände/Depressionen, Verdauungsprobleme, Menstruationsbeschwerden und Atemwegserkrankungen 25,26,27,28,29. In den letzten Jahren hat sich die Akupunktur zu einer wirksamen therapeutischen Intervention bei neuronalen Erkrankungen, einschließlich kognitiver Dysfunktion, entwickelt. Mehrere Studien haben seine Fähigkeit gezeigt, Neurotransmitter zu modulieren, die Durchblutung des Gehirns zu erhöhen, oxidativen Stress zu reduzieren und die Neuroplastizität zu verbessern 20,30,31,32. Folglich wird sie zunehmend als sichere und wirksame Behandlungsoption anerkannt, insbesondere wenn sie neben der schulmedizinischen Versorgung eingesetzt wird33. Trotz ihrer langen Geschichte und weit verbreiteten Anwendung ist der Wirkmechanismus der Akupunktur jedoch nach wie vor unvollständig verstanden. Eine Theorie besagt, dass Akupunktur die Freisetzung von Endorphinen, den natürlichen Schmerzmitteln des Körpers, stimuliert und dadurch Schmerzen lindert und das Wohlbefinden fördert34. Eine andere Theorie besagt, dass Akupunktur das autonome Nervensystem beeinflussen kann, das verschiedene unwillkürliche Körperfunktionen reguliert35,36. Obwohl sich unser Verständnis der Mechanismen der Akupunktur noch in der Entwicklung befindet, wächst unter den Wissenschaftlern die Erkenntnis, dass eine standardisierte Labormethodik für die Akupunktur, insbesondere unter Verwendung von Nagetiermodellen, für die Forschung in diesem Bereich unerlässlich ist.

Die Auswahl eines geeigneten Anästhesieprotokolls ist der erste entscheidende Schritt bei der Durchführung der Akupunktur im Mausmodell. Herkömmliche Protokolle beinhalten oft eine kontinuierliche Hochdosisanästhesie, die erhebliche Auswirkungen auf das Nervensystem der Maus haben und nach der Akupunkturbehandlung zu falsch-negativen Verhaltenstestergebnissen führen kann. In dieser Studie schlagen wir ein verbessertes Protokoll vor, das eine versiegelte Anästhesiebox verwendet, um die Mäuse zu betäuben, bis sie das Bewusstsein verlieren. Anschließend wird während der Akupunkturbehandlung mit einem niedrig dosierten Anästhetikum ein stabiler Zustand aufrechterhalten. Diese Methode hilft, Funktions- und Verhaltensanomalien zu minimieren, die durch übermäßige Anästhesiedosierung verursacht werden, und erhöht die Genauigkeit der Experimente. Darüber hinaus können sich Forscher für Isofluran anstelle von Ketamin und Xylazin entscheiden, da es eine schnellere Erholungszeit bietet und die mit Ketamin und Xylazin verbundenen systemischen Toxizitätsrisiken reduziert37. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass durch die Anästhesie verursachte falsch negative Ergebnisse dennoch auftreten können. Selbst eine leichte Anästhesie, die 2 aufeinanderfolgende Wochen andauert, kann sich negativ auf die Kognition auswirken38. Um die Wirksamkeit der Behandlung genauer zu bewerten, können Forscher eine zusätzliche Gruppe von anästhesierten Mäusen, die keine Behandlung erhalten, zu Vergleichszwecken einbeziehen. Ein weiterer kritischer Aspekt der Akupunkturbehandlung bei Mäusen ist die Bestimmung der Kombination von Akupunkturpunkturpunkten. Zu den häufig verwendeten Akupunkturpunkten für Erkrankungen des zentralen Nervensystems beim Menschen gehören Baihui (GV20), Yintang (EX-HN3), Shenting (GV24) und Zusanli (ST36)39,40,41. In dieser Studie konzentrierten wir uns auf die Einbeziehung von Baihui (GV20), Shenting (GV24) und Zusanli (ST36) in die Behandlung. Trotz der Herausforderungen, die die geringe Größe der Mäuse bei der Akupunkturpunktlokalisation mit sich bringt, erweist sich die Gelenkpositionierung auf der Grundlage anatomischer Strukturen als effektive Methode. Schließlich ist die Bestimmung der geeigneten Stimulationsfrequenz und -intensität ein weiterer wichtiger Schritt bei der Durchführung einer Akupunkturbehandlung bei Mäusen. In dieser Studie verwendeten wir niederfrequente Elektroakupunktur bei 2 Hz und einer moderaten Intensität von 2 mA. Obwohl das therapeutische Ergebnis der Akupunktur offensichtlich ist, sind weitere Untersuchungen erforderlich, um den zugrunde liegenden Mechanismus zu verstehen.

Trotz der breiten Anwendungsmöglichkeiten der Akupunktur bei der Behandlung neurologischer Erkrankungen hat diese Technik gewisse Einschränkungen. Eine Einschränkung ist die hohe Abhängigkeit von der Erfahrung des Bedieners, was zu suboptimalen Ergebnissen oder Schäden an den Versuchspersonen führen kann, wenn sie von unerfahrenen Bedienern durchgeführt werden. Eine weitere Einschränkung ist die Notwendigkeit, die klinische Akupunkturbehandlung zu verbessern, um ihre Wirksamkeit zu verbessern. Derzeit untersuchen Forscher die Kombination von Akupunktur mit anderen Therapien wie pharmakologischen Interventionen und kognitivem Training, um die Behandlungsergebnisse zu verbessern42. Darüber hinaus haben technologische Fortschritte zur Entwicklung neuer Techniken wie der transkraniellen Magnetstimulation (TMS) geführt, die in Verbindung mit Akupunktur zur weiteren Verbesserung der kognitiven Funktion eingesetzt werden können43. Trotz dieser Einschränkungen hat die Akupunktur erhebliche Vorteile bei der Behandlung verschiedener neurologischer Erkrankungen gezeigt und birgt ein großes Potenzial für zukünftige Anwendungen, insbesondere in Kombination mit anderen Therapien. Dieser Artikel enthält detaillierte Methoden zur Konstruktion eines Mausmodells für chronische Hypoxie-induzierte kognitive Beeinträchtigungen, den Prozess der Akupunkturbehandlung und Verhaltenstestmethoden. Diese Methoden können Forschern dabei helfen, gründliche Studien über die Anwendung und den Mechanismus der Akupunktur durchzuführen und so die Weiterentwicklung der traditionellen chinesischen Medizin zu fördern.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde vom S & T Program of Hebei (NO.E2020100001 und NO.22372502D), dem High-level S & T Innovation and Entrepreneurship Talent Project von Shijiazhuang (No. 07202203) unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% paraformaldehyde solution Bioroyee (Beijing) Biotechnology Co., Ltd RL3234
ANY-maze Science  SA201 Video tracking system
C75BL/6J mice BEIJING HFK BIOSCIENCE CO.,LTD No.110322220103041767 Gender: Male,  Weight: 18–22 g
Electroacupuncture device Great Wall KWD-808 I
Hwato acupuncture  needle Suzhou Medical Appliance Factory 2655519 
Isoflurane RWD Life Science Co.,Ltd R510-22
NanoZoomer Digital Pathology Hamamatsu Photonics K. K C9600-01
Small animal anesthesia machine RWD YL-LE-A106

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Verhalten Ausgabe 202 chronische Hypoxie kognitive Beeinträchtigung leichte Anästhesie nicht-pharmakologische traditionelle chinesische Medizin
Akupunkturbehandlung in einem Mausmodell der chronischen Hypoxie-induzierten kognitiven Dysfunktion
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Wan, F., Guo, Z., Wang, M., Hou, Y., … More

Wan, F., Guo, Z., Wang, M., Hou, Y., Wang, L., Li, W., Kang, N., Zhu, P., Li, M. Acupuncture Treatment in a Mouse Model of Chronic Hypoxia-Induced Cognitive Dysfunction. J. Vis. Exp. (202), e65784, doi:10.3791/65784 (2023).

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