Hepatoselüler karsinom (HCC) organoid oluşumu için organoid kültivasyonun tüm aşamalarını kapsayan mevcut protokollere kapsamlı bir genel bakış ve iyileştirme sunuyoruz. Bu sistem, potansiyel terapötik hedeflerin belirlenmesi ve ilaç adaylarının etkinliğinin değerlendirilmesi için değerli bir model görevi görmektedir.
Hepatosellüler karsinom (HCC) dünya çapında oldukça yaygın ve ölümcül bir tümördür ve geç keşfi ve etkili spesifik terapötik ajanların eksikliği, patogenezi ve tedavisi ile ilgili daha fazla araştırma yapılmasını gerektirmektedir. Doğal tümör dokusuna çok benzeyen ve in vitro kültürlenebilen yeni bir model olan organoidler, karaciğer kanseri için organoid modellerin geliştirilmesine ilişkin çok sayıda raporla son yıllarda büyük ilgi görmüştür. Bu çalışmada, prosedürü başarılı bir şekilde optimize ettik ve stabil pasajlama ve kültür koşulları ile daha büyük boyutlu HCC organoidlerinin oluşumunu sağlayan bir kültür protokolü oluşturduk. Bu yazıda, HCC doku ayrışması, organoid kaplama, kültür, pasaj, kriyoprezervasyon ve resüsitasyon sürecinin tamamını kapsayan prosedürün her adımını kapsamlı bir şekilde özetledik ve ayrıntılı önlemler sağladık. Bu organoidler, orijinal HCC dokularına genetik benzerlik gösterir ve tümörler için potansiyel terapötik hedeflerin belirlenmesi ve müteakip ilaç geliştirme dahil olmak üzere çeşitli uygulamalar için kullanılabilir.
Yaygın ve çok çeşitli bir tümörolan hepatosellüler karsinom (HCC) 1, tıp camiasında büyük ilgi görmüştür. HCC’de soy plastisitesinin ve önemli heterojenliğin varlığı, çeşitli hastalardan kaynaklanan tümör hücrelerinin ve hatta aynı hastadaki farklı lezyonların farklı moleküler ve fenotipik özellikler gösterebileceğini ve böylece yenilikçi terapötik yaklaşımların ilerlemesinde zorlu engeller oluşturabileceğini düşündürmektedir 2,3,4,5 . Sonuç olarak, daha etkili tedavi stratejilerinin formülasyonunu bilgilendirmek için HCC’de ilaç direncinin biyolojik özelliklerinin ve mekanizmalarının daha iyi anlaşılmasına ihtiyaç vardır.
Son yıllarda, araştırmacılar çabalarını HCC 3,4’ü incelemek amacıyla in vitro modellerin geliştirilmesine adamışlardır. Bazı gelişmelere rağmen, sınırlamalar devam etmektedir. Bu modeller, hücre hatlarının, birincil hücrelerin ve hastadan türetilen ksenogreftlerin (PDX) kullanımı gibi bir dizi tekniği kapsar. Hücre hatları, HCC hastalarından elde edilen tümör hücrelerinin uzun süreli kültürü için in vitro modeller olarak hizmet eder ve kolaylık ve kolay genişleme avantajları sunar. Primer hücre modelleri, primer tümör hücrelerinin hasta tümör dokularından doğrudan izolasyonunu ve kültürünü içerir, böylece hastaların kendilerine çok benzeyen biyolojik özelliklerin bir temsilini sağlar. PDX modelleri, tümör büyümesini ve yanıtını daha sadık bir şekilde simüle etmek amacıyla hasta tümör dokularının farelere nakledilmesini gerektirir. Bu modeller HCC araştırmalarında etkili olmuştur, ancak hücre hatlarının heterojenliği ve in vivo koşullarda tam olarak kopyalanamaması dahil olmak üzere belirli sınırlamalara sahiptirler. Ayrıca, uzun süreli in vitro kültivasyon, hücrelerin orijinal özelliklerinin ve işlevlerinin bozulmasına neden olabilir ve HCC’nin biyolojik özelliklerini doğru bir şekilde temsil etmede zorluklar ortaya çıkarabilir. Ek olarak, PDX modellerinin kullanımı hem zaman alıcı hem de maliyetlidir3.
Bu sınırlamaları ele almak ve HCC’nin fizyolojik özelliklerini daha doğru bir şekilde çoğaltmak için, organoid teknolojisinin kullanımı, önceki kısıtlamaları aşabilen umut verici bir araştırma platformu olarak tanıtılmıştır. İn vitro kültürlenmiş üç boyutlu hücre modelleri olan organoidler, gerçek organların yapısını ve işlevselliğini kopyalama yeteneğine sahiptir. Bununla birlikte, HCC bağlamında, organoid modellerin oluşturulmasında bazı zorluklar vardır. Bu zorluklar arasında HCC organoid yapım prosedürlerinin yeterince ayrıntılı olmayan açıklamaları, HCC organoid yapımının tüm süreci için kapsamlı protokollerin eksikliği ve tipik olarak küçük boyutlu kültürlenmiş organoidler 6,7,8 yer almaktadır. Kültürlenmiş organoidlerin tipik olarak sınırlı boyutları ışığında, HCC organoid yapısının tamamını kapsayan kapsamlı bir protokol geliştirerek bu zorlukların üstesinden gelmeye çalıştık6. Bu protokol doku ayrışması, organoid kaplama, kültür, pasaj, kriyoprezervasyon ve resüsitasyonu kapsar. Prosedürel adımları optimize ederek ve kültür ortamının bileşimini iyileştirerek, sürekli büyüme ve uzun vadeli geçiş yapabilen HCC organoid modellerini başarıyla kurduk 6,8. Sonraki bölümlerde, HCC organoidlerinin yapımında yer alan operasyonel karmaşıklıkların ve ilgili faktörlerin kapsamlı bir açıklaması sunulacaktır.
Hasta kaynaklı organoid modellerin dikkate değer bir yararı, doku yapısını ve genomik manzarayı kapsayan tümörlerin biyolojik özelliklerini aslına uygun olarak kopyalama kapasitelerinde yatmaktadır. Bu modeller dikkate değer bir doğruluk düzeyi gösterir ve uzun süreli ekim dönemlerinde bile tümörlerin heterojenliğini ve ilerlemesini etkili bir şekilde yansıtır 6,8,9. Bu rafine organoid kültür protokolü…
The authors have nothing to disclose.
Bu araştırma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (82122048; 82003773; 82203380) ve Guangdong Temel ve Uygulamalı Temel Araştırma Vakfı (2023A1515011416) tarafından desteklenmiştir.
[Leu15]-gastrin I human | Merck | G9145 | |
1.5 mL Microtubes | Merck | AXYMCT150LC | |
A8301 (TGFβ inhibitor) | Tocris Bioscience | 2939 | |
B27 Supplement (503), minus vitamin A | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
B-27 Supplement (503), serum-free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
BMP7 | Peprotech | 120-03P | |
Cell strainer size 100 μm | Merck | CLS352360 | |
CHIR99021 | Merck | SML1046 | |
Collagenase D | Merck | 11088858001 | |
Corning Costar Ultra-Low | Merck | CLS3473 | |
Costar 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile | Corning | 3473 | |
Costar 6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile | Corning | 3471 | |
Cultrex Organoid Harvesting Solution | R&D SYSTEMS | 3700-100-01 | Organoid harvesting solution |
Cultrex Reduced Growth Factor BME, Type 2 PathClear (BME) | Merck | 3533-005-02 | |
DAPT | Merck | D5942 | |
Dexamethasone | Merck | D4902 | |
DMSO | Merck | C6164 | |
DNaseI | Merck | DN25 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12634028 | Advanced DMEM/F-12 |
Earle’s balanced salt solution (EBSS) | Thermo Fisher Scientific | 24010043 | |
Forceps | N/A | N/A | |
Forskolin | Tocris Bioscience | 1099 | |
GlutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
HEPES, 1 M | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
Leica DM6 B Fluorescence Motorized Microscope | Leica | N/A | |
N2 supplement (1003) | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
N-acetylcysteine | Merck | A0737-5MG | |
Nicotinamide | Merck | N0636 | |
Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339651 | |
Nunc 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339653 | |
Penicillin/streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
Recombinant human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
Recombinant human FGF10 | Peprotech | 100-26 | |
Recombinant human FGF19 | Peprotech | 100-32 | |
Recombinant human HGF | Peprotech | 100-39 | |
Recombinant human Noggin | Peprotech | 120-10C | |
Rho kinase inhibitor Y-27632 dihydrochloride | Merck | Y0503 | |
R-spodin1-conditioned medium | (Broutier et al.) | N/A | Secretion of cell lines |
Surgical scissors | N/A | N/A | |
Surgical specimen of tumor removed from HCC patients | Affiliated Cancer Hospital and Institute of Guangzhou Medical University | N/A | |
TNFα | Peprotech | 315-01A | |
TrypLE Express Enzyme (1x), no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 12604013 | Trypsin substitute |
Wnt-3a-conditioned medium | (Broutier et al.) | N/A | Secretion of cell lines |