Ontwikkeling en optimalisatie van een humaan hepatocellulair carcinoom-patiënt-afgeleid organoïdemodel voor potentiële doelidentificatie en ontdekking van geneesmiddelen

Summary

We bieden een uitgebreid overzicht en verfijning van bestaande protocollen voor de vorming van hepatocellulair carcinoom (HCC), die alle stadia van de organoïdeteelt omvatten. Dit systeem dient als een waardevol model voor de identificatie van potentiële therapeutische doelwitten en de beoordeling van de effectiviteit van kandidaat-geneesmiddelen.

Abstract

Hepatocellulair carcinoom (HCC) is wereldwijd een veel voorkomende en dodelijke tumor en de late ontdekking en het gebrek aan effectieve specifieke therapeutische middelen maken verder onderzoek naar de pathogenese en behandeling ervan noodzakelijk. Organoïden, een nieuw model dat sterk lijkt op inheems tumorweefsel en in vitro kan worden gekweekt, hebben de afgelopen jaren veel belangstelling gewekt, met tal van rapporten over de ontwikkeling van organoïdemodellen voor leverkanker. In deze studie hebben we met succes de procedure geoptimaliseerd en een kweekprotocol opgesteld dat de vorming van grotere HCC-organoïden met stabiele passaging en kweekomstandigheden mogelijk maakt. We hebben elke stap van de procedure uitgebreid geschetst, waarbij we het hele proces van HCC-weefseldissociatie, organoïdeplating, kweek, passaging, cryopreservatie en reanimatie hebben behandeld, en in dit artikel gedetailleerde voorzorgsmaatregelen hebben gegeven. Deze organoïden vertonen genetische gelijkenis met de originele HCC-weefsels en kunnen worden gebruikt voor diverse toepassingen, waaronder de identificatie van potentiële therapeutische doelen voor tumoren en de daaropvolgende ontwikkeling van geneesmiddelen.

Introduction

Hepatocellulair carcinoom (HCC), een veel voorkomende en zeer diverse tumor¹, heeft veel aandacht gekregen binnen de medische gemeenschap. De aanwezigheid van afstammingsplasticiteit en substantiële heterogeniteit in HCC suggereert dat tumorcellen afkomstig van verschillende patiënten en zelfs verschillende laesies binnen dezelfde patiënt ongelijke moleculaire en fenotypische eigenschappen kunnen vertonen, waardoor formidabele obstakels worden gevormd bij de vooruitgang van innovatieve therapeutische benaderingen 2,3,4,5 . Bijgevolg is er een dringende behoefte aan een beter begrip van de biologische kenmerken en mechanismen van geneesmiddelresistentie bij HCC om de formulering van effectievere behandelingsstrategieën te informeren.

In de afgelopen decennia hebben onderzoekers hun inspanningen gewijd aan de ontwikkeling van in vitro modellen met het oog op het bestuderen van HCC ^3,4. Ondanks enkele vorderingen blijven er beperkingen bestaan. Deze modellen omvatten een reeks technieken, zoals het gebruik van cellijnen, primaire cellen en van patiënten afgeleide xenotransplantaten (PDX). Cellijnen dienen als in vitro modellen voor langdurige kweek van tumorcellen verkregen van HCC-patiënten, en bieden de voordelen van gemak en gemakkelijke uitbreiding. Primaire celmodellen omvatten directe isolatie en kweek van primaire tumorcellen uit tumorweefsels van patiënten, waardoor een weergave wordt verkregen van biologische kenmerken die sterk lijken op die van de patiënten zelf. PDX-modellen omvatten de transplantatie van tumorweefsels van patiënten in muizen, met als doel de tumorgroei en -respons getrouwer te simuleren. Deze modellen hebben een belangrijke rol gespeeld in HCC-onderzoek, maar ze hebben bepaalde beperkingen, waaronder de heterogeniteit van cellijnen en het onvermogen om in vivo omstandigheden volledig te repliceren. Bovendien kan langdurige in-vitrokweek leiden tot een verslechtering van de oorspronkelijke kenmerken en functionaliteiten van de cellen, wat een uitdaging vormt bij het nauwkeurig weergeven van de biologische eigenschappen van HCC. Bovendien is het gebruik van PDX-modellen zowel tijdrovend als kostbaar³.

Om deze beperkingen aan te pakken en de fysiologische eigenschappen van HCC nauwkeuriger te repliceren, is het gebruik van organoïdetechnologie geïntroduceerd als een veelbelovend onderzoeksplatform dat in staat is om eerdere beperkingen te overtreffen. Organoïden, driedimensionale celmodellen die in vitro worden gekweekt, hebben het vermogen om de structuur en functionaliteit van echte organen na te bootsen. In de context van HCC bestaan er echter bepaalde uitdagingen bij het opstellen van organoïdemodellen. Deze uitdagingen omvatten onvoldoende gedetailleerde beschrijvingen van HCC-organoïdeconstructieprocedures, een gebrek aan uitgebreide protocollen voor het hele proces van HCC-organoïdeconstructie en de typisch kleine omvang van gekweekte organoïden ^6,7,8. In het licht van de doorgaans beperkte afmetingen van gekweekte organoïden, hebben we geprobeerd deze uitdagingen aan te pakken door de ontwikkeling van een uitgebreid protocol dat de volledige HCC-organoïdenconstructie omvat⁶. Dit protocol omvat weefseldissociatie, organoïdeplating, kweek, passaging, cryopreservatie en reanimatie. Door de procedurele stappen te optimaliseren en de samenstelling van het kweekmedium te verfijnen, hebben we met succes HCC-organoïdemodellen ontwikkeld die in staat zijn tot duurzame groei en langdurige passaging ^6,8. In de volgende paragrafen zal een uitgebreid verslag worden gegeven van de operationele fijne kneepjes en relevante factoren die betrokken zijn bij de constructie van HCC-organoïden.

Protocol

Menselijke biopsieweefsels werden verkregen van de betreffende patiënt in het Affiliated Cancer Hospital and Institute van de Guangzhou Medical University, en geïnformeerde toestemming werd verkregen van de patiënten. Zie de Materiaaltabel voor meer informatie over alle materialen, reagentia en instrumenten die in dit protocol worden gebruikt. 1. Het vaststellen van HCC-organoïden van patiënten uit chirurgische monsters OPMERKING…

Representative Results

Na implementatie van de bovengenoemde procedure is de opkomst van HCC-organoïde sferoïden doorgaans waarneembaar binnen een tijdsbestek van 3 dagen (Figuur 1). Figuur 1A,B toont de gevestigde HCC-organoïde, die op de eerste dag van vestiging onmiddellijk compacte sferoïden ontwikkelt die worden gekenmerkt door afgeronde randen en permeabel cytosol. Tijdens de groei van HCC-organoïden had het gebruik van verschillende concentraties BME versc…

Discussion

Een opmerkelijk voordeel van van patiënten afgeleide organoïdemodellen ligt in hun vermogen om de biologische kenmerken van tumoren getrouw na te bootsen, inclusief weefselstructuur en genoomlandschap. Deze modellen vertonen een opmerkelijk niveau van nauwkeurigheid en weerspiegelen effectief de heterogeniteit en progressie van tumoren, zelfs over langere perioden van cultivatie ^6,8,9. Door het gebruik van dit verfijnde organo…

Materials

[Leu15]-gastrin I human	Merck	G9145
1.5 mL Microtubes	Merck	AXYMCT150LC
A8301 (TGFβ inhibitor)	Tocris Bioscience	2939
B27 Supplement (503), minus vitamin A	Thermo Fisher Scientific	12587010
B-27 Supplement (503), serum-free	Thermo Fisher Scientific	17504044
BMP7	Peprotech	120-03P
Cell strainer size 100 μm	Merck	CLS352360
CHIR99021	Merck	SML1046
Collagenase D	Merck	11088858001
Corning Costar Ultra-Low	Merck	CLS3473
Costar 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile	Corning	3473
Costar 6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile	Corning	3471
Cultrex Organoid Harvesting Solution	R&D SYSTEMS	3700-100-01	Organoid harvesting solution
Cultrex Reduced Growth Factor BME, Type 2 PathClear (BME)	Merck	3533-005-02
DAPT	Merck	D5942
Dexamethasone	Merck	D4902
DMSO	Merck	C6164
DNaseI	Merck	DN25
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12	Thermo Fisher Scientific	12634028	Advanced DMEM/F-12
Earle’s balanced salt solution (EBSS)	Thermo Fisher Scientific	24010043
Forceps	N/A	N/A
Forskolin	Tocris Bioscience	1099
GlutaMAX supplement	Thermo Fisher Scientific	35050061
HEPES, 1 M	Thermo Fisher Scientific	15630080
Leica DM6 B Fluorescence Motorized Microscope	Leica	N/A
N2 supplement (1003)	Thermo Fisher Scientific	17502048
N-acetylcysteine	Merck	A0737-5MG
Nicotinamide	Merck	N0636
Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes	Thermo Fisher Scientific	339651
Nunc 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes	Thermo Fisher Scientific	339653
Penicillin/streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140122
Recombinant human EGF	Peprotech	AF-100-15
Recombinant human FGF10	Peprotech	100-26
Recombinant human FGF19	Peprotech	100-32
Recombinant human HGF	Peprotech	100-39
Recombinant human Noggin	Peprotech	120-10C
Rho kinase inhibitor Y-27632 dihydrochloride	Merck	Y0503
R-spodin1-conditioned medium	(Broutier et al.)	N/A	Secretion of cell lines
Surgical scissors	N/A	N/A
Surgical specimen of tumor removed from HCC patients	Affiliated Cancer Hospital and Institute of Guangzhou Medical University	N/A
TNFα	Peprotech	315-01A
TrypLE Express Enzyme (1x), no phenol red	Thermo Fisher Scientific	12604013	Trypsin substitute
Wnt-3a-conditioned medium	(Broutier et al.)	N/A	Secretion of cell lines