Kompletterande metoder för att undersöka mitofagiskt flöde i bukspottkörtelns β-celler

Summary

Detta protokoll beskriver två metoder för kvantitativ analys av mitofagi i bukspottkörtelns β-celler: för det första en kombination av cellpermeabla mitokondriespecifika färgämnen, och för det andra en genetiskt kodad mitofagireporter. Dessa två tekniker kompletterar varandra och kan användas baserat på specifika behov, vilket möjliggör flexibilitet och precision när det gäller att kvantitativt ta itu med mitokondriell kvalitetskontroll.

Abstract

Mitofagi är en kvalitetskontrollmekanism som är nödvändig för att upprätthålla optimal mitokondriell funktion. Dysfunktionell β-cellig mitofagi resulterar i otillräcklig insulinfrisättning. Avancerade kvantitativa bedömningar av mitofagi kräver ofta användning av genetiska rapportörer. Musmodellen mt-Keima, som uttrycker en mitokondrieriktad pH-känslig dubbelexcitationskvotmetrisk sond för kvantifiering av mitofagi via flödescytometri, har optimerats i β-celler. Förhållandet mellan sura och neutrala mt-Keima-våglängdsutsläpp kan användas för att på ett robust sätt kvantifiera mitofagi. Att använda genetiska mitofagirapportörer kan dock vara utmanande när man arbetar med komplexa genetiska musmodeller eller svårtransfekterade celler, såsom primära mänskliga öar. Detta protokoll beskriver en ny komplementär färgämnesbaserad metod för att kvantifiera β-cellsmitofagi i primära öar med hjälp av MtPhagy. MtPhagy är ett pH-känsligt, cellgenomsläppligt färgämne som ackumuleras i mitokondrierna och ökar dess fluorescensintensitet när mitokondrier befinner sig i miljöer med lågt pH, såsom lysosomer under mitofagi. Genom att kombinera MtFagy-färgämnet med Fluozin-3-AM, en Zn²⁺ -indikator som selekterar för β-celler, och tetrametylrhodamin, etylester (TMRE) för att bedöma mitokondriell membranpotential, kan mitofagiskt flöde kvantifieras specifikt i β-celler via flödescytometri. Dessa två tillvägagångssätt är mycket komplementära, vilket möjliggör flexibilitet och precision vid bedömning av mitokondriell kvalitetskontroll i många β-cellsmodeller.

Introduction

Bukspottkörtelns β-celler producerar och utsöndrar insulin för att möta metaboliska krav, och β-cellsdysfunktion är ansvarig för hyperglykemi och diabetesdebut vid både typ 1- och typ 2-diabetes. β-celler kopplar glukosmetabolism med insulinutsöndring via mitokondriell energi och metabolisk produktion, som beror på en reserv av funktionell mitokondriell massa ^1,2,3. För att upprätthålla optimal β-cellsfunktion förlitar sig β-celler på mitokondriella kvalitetskontrollmekanismer för att avlägsna åldrade eller skadade mitokondrier och bevara funktionell mitokondriell massa⁴. Selektiv mitokondriell autofagi, även känd som mitofagi, är en nyckelkomponent i den mitokondriella kvalitetskontrollvägen.

Bedömningar av mitofagi i levande celler förlitar sig ofta på förändringar i mitokondriellt pH som uppstår under mitofagi. Mitokondrier har ett svagt alkaliskt pH, och friska mitokondrier finns normalt i den pH-neutrala cytosolen. Under mitofagi inkorporeras skadade eller dysfunktionella mitokondrier selektivt i autofagosomer och elimineras så småningom i sura lysosomer⁵. Flera in vivo transgena mitofagiska reportermusmodeller, såsom mt-Keima⁶, mitoQC⁷ och CMMR⁸, såväl som transfekterbara mitofagiska sonder, såsom Cox8-EGFP-mCherry plasmid⁹, använder denna pH-förändring för att ge kvantitativa bedömningar av mitofagi. Användning av transgena möss som uttrycker den pH-känsliga dual-excitation ratiometriska sonden mt-Keima har optimerats för mitofagibedömningar i öar och β-celler via flödescytometri ^10,11. Förhållandet mellan sur och neutral mt-Keima-våglängdsemission (förhållandet mellan sur 561 nm och neutral 480 nm excitation) kan användas för att på ett robust sätt kvantifiera mitofagi ^6,12.

Detta protokoll beskriver ett optimerat tillvägagångssätt för att bedöma mitofagiflödet i primära öar och β-celler isolerade från mt-Keima transgena möss ^10,11. Även om mt-Keima är en mycket känslig sond kräver den antingen komplicerade djuravelssystem eller transfektion av celler, vilket ofta kan vara en utmaning när man arbetar i kombination med andra genetiska modeller eller med primära mänskliga öar. Dessutom kan användningen av flera fluorescenslasrar och detektorer för att identifiera neutrala och sura cellpopulationer begränsa den kombinatoriska användningen av andra fluorescerande rapportörer.

För att övervinna dessa utmaningar beskriver detta protokoll också en komplementär, enkelfluorescerande kanal, färgämnesbaserad metod för robust detektion av mitofagi i β-celler från isolerade musöar. Detta tillvägagångssätt, kallat MtPhagy-metoden, använder en kombination av tre cellpermeabla färgämnen för att selektera för β-celler, kvantifiera cellpopulationerna som aktivt genomgår mitofagi och bedöma mitokondriell membranpotential (MMP eller Δψm) samtidigt.

Det första av dessa färgämnen är Fluozin-3-AM, en cellpermeabel Zn²⁺-indikator med en Ex/Em 494/516 nm¹³. Musöar består av en heterogen population av funktionellt distinkta celler, inklusive α-, β-, δ- och PP-celler. β-celler utgör cirka 80 % av cellerna i musön och kan särskiljas från andra ö-celltyper på grund av deras höga Zn²⁺-koncentration i insulingranulat^14,15, vilket gör det möjligt att identifiera β-celler som den^höga populationen av Fluozin-3-AM. MtPhagy-färgämnet, ett pH-känsligt färgämne som immobiliseras på mitokondrier via en kemisk bindning och avger svag fluorescens, används också i detta protokoll¹⁶. Vid mitofaginiduktion inkorporeras skadade mitokondrier i den sura lysosomen, och MtFagy-färgämnet ökar sin fluorescensintensitet i miljön med lågt pH (Ex/Em 561/570-700 nm).

Dessutom används tetrametylrhodamin, etylester (TMRE), för att bedöma MMP. TMRE är ett cellpermeabelt positivt laddat färgämne (Ex/Em 552/575 nm) som binds av friska mitokondrier på grund av den relativa negativa laddningen som upprätthålls av deras membranpotential¹⁷. Skadade eller sjuka mitokondrier förlorar sin membranpotential, vilket resulterar i minskad förmåga att binda TMRE. Genom att använda dessa färgämnen tillsammans kan β-celler som genomgår mitofagi identifieras som Fluozin^highMtPhagy^highTMRE^low population via flödescytometri. Eftersom mitofagi är en dynamisk snarare än statisk process, optimerades detta protokoll för att bedöma mitofagiskt flöde med hjälp av valinomycin, en K⁺-jonofor som inducerar mitofagi efter avledning av MMP¹⁸. Jämförelse av mitofagi i närvaro och frånvaro av valinomycin möjliggör bedömning av mitofagiskt flöde i olika provgrupper.

Den nuvarande metodens färgämnesbaserade karaktär gör det möjligt att extrapolera den till mänskliga öar och andra celltyper som är svåra att transfektera och kringgår behovet av komplicerade djuravelssystem, till skillnad från mt-Keima-protokollet. Det övergripande målet med detta protokoll är att kvantifiera mitofagi i β-celler på encellsnivå via två oberoende flödescytometribaserade metoder. Sammantaget beskriver detta protokoll två kraftfulla och kompletterande metoder som möjliggör både precision och flexibilitet i den kvantitativa studien av mitokondriell kvalitetskontroll.

Protocol

Djurstudierna som presenteras i detta protokoll har granskats och godkänts av University of Michigan Institutional Animal Care and Use Committee. Tjugo veckor gamla C57BL/6J-möss, på antingen en 15-veckors vanlig fettdiet (RFD) eller högfettdiet (HFD), användes för denna studie. 1. Bedömning av mitofagi med hjälp av den färgämnesbaserade MtPhagy-metoden (metod 1) Förberedelse och behandling av musöarUtför öodling och exponering för valinomycin …

Representative Results

Bedömning av mitofagi med hjälp av den färgämnesbaserade MtPhagy-metodenDetta färgämnesbaserade tillvägagångssätt optimerades för att analysera mitofagiskt flöde i primära β-celler hos möss utan behov av en genetisk rapportör, med hjälp av Fluozin-3-AM, TMRE och MtPhagy samt DAPI för att utesluta döda celler. Genom att para ihop dessa färgämnen med valinomycin för att inducera mitofagi beskriver detta protokoll en färgämnesbaserad metod för att selektivt mäta mitofagiskt flö…

Discussion

Detta protokoll beskrev två komplementära metoder för att kvantifiera mitofagiskt flöde i dissocierade primära musöar. Med hjälp av mt-Keima-metoden kvantifierades en ökning av mitofagi som en ökad kvot av sura (561 nm) / neutrala (405 nm) celler, medan i MtPhagy-metoden kvantifierades ökat mitofagiflöde som en ökning i Fluozin^highMtPhagy^highTMRE^low cell population. Dessa metoder möjliggör snabba, kvantitativa och β-cellspecifika bedömningar av mitofagiflödet.

<p clas…

Materials

Antibiotic-Antimycotic	Life Technologies	15240-062
Attune NxT Flow Cytometer	Thermofisher Scientific	A24858
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)	Thermofisher Scientific	D1306	DAPI reconstituted in ddH2O to reach 0.2 µg/mL stock
Dimethyl Sulfoxide	Sigma-Aldrich	317275
Fatty Acid Free heat shock BSA powder	Equitech	BAH66
Fetal bovine serum	Gemini Bio	900-108
Fluozin-3AM	Thermofisher Scientific	F24195	100 μg Fluozin-3AM powder reconstituted in 51 μL DMSO and 51 μL Pluronic F-127 to reach 1 mM stock.
Gibco RPMI 1640 Medium	Fisher Scientific	11-875-093
HEPES (1M)	Life Technologies	15630-080
MtPhagy dye	Dojindo	MT02-10	5 μg MtPhagy powder reconstituted with 50 μL DMSO to reach 100 μM stock.
MtPhagy dye	Dojindo	MT02-10
Penicillin-Streptomycin (100x)	Life Technologies	15140-122	1x Solution used in procotol by diluting 1:10 in ddH2O
Phosphate buffered saline, 10x	Fisher Scientific	BP399-20	1x Solution used in procotol by diluting 1:10 in ddH2O
Sodium Pyruvate (100x)	Life Technologies	11360-070	5 μg MtPhagy powder reconstituted with 50 μL DMSO to reach 100 μM stock.
TMRE [Tetramethylrhodamine, ethyl ester, perchlorate]	Anaspec	AS-88061	TMRE powder reconstituted in DMSO to reach 100 μM stock.
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Thermofisher Scientific	25300054
Valinomycin	Sigma	V0627	Valinomycin powder reconsituted in DMSO to reach 250 nM stock.