Modello transitorio di occlusione dell'arteria cerebrale media dell'ictus
Summary
Questo protocollo descrive il modello di ischemia cerebrale focale transitoria nei topi attraverso l’occlusione intraluminale dell’arteria cerebrale media. Inoltre, vengono mostrati esempi di valutazione dei risultati utilizzando la risonanza magnetica per immagini e test comportamentali.
Abstract
L’ictus è una delle principali cause di morte o disabilità cronica a livello globale. Tuttavia, i trattamenti ottimali esistenti sono limitati alle terapie di riperfusione durante la fase acuta dell’ictus ischemico. Per ottenere informazioni sulla fisiopatologia dell’ictus e sviluppare approcci terapeutici innovativi, i modelli di ictus in vivo dei roditori svolgono un ruolo fondamentale. La disponibilità di animali geneticamente modificati ha particolarmente favorito l’uso dei topi come modelli sperimentali di ictus.
Nei pazienti colpiti da ictus, l’occlusione dell’arteria cerebrale media (MCA) è un evento comune. Di conseguenza, il modello sperimentale più diffuso prevede l’occlusione intraluminale dell’MCA, una tecnica minimamente invasiva che non richiede craniectomia. Questa procedura prevede l’inserimento di un monofilamento attraverso l’arteria carotide esterna (ECA) e l’avanzamento attraverso l’arteria carotide interna (ICA) fino a raggiungere il punto di ramificazione dell’MCA. Dopo un’occlusione arteriosa di 45 minuti, il monofilamento viene rimosso per consentire la riperfusione. Durante tutto il processo, il flusso sanguigno cerebrale viene monitorato per confermare la riduzione durante l’occlusione e il successivo recupero dopo la riperfusione. Gli esiti neurologici e tissutali vengono valutati utilizzando test comportamentali e studi di risonanza magnetica per immagini (MRI).
Introduction
L’ictus è una malattia devastante che colpisce circa 15 milioni di persone in tutto il mondo ogni anno, secondo l’OMS. Circa un terzo dei pazienti soccombe alla condizione, mentre un altro terzo sperimenta una disabilità permanente. L’ictus è una patologia complessa che coinvolge vari tipi di cellule, come le cellule immunitarie neurali e periferiche, la vascolarizzazione e le risposte sistemiche1. L’intricata rete di reazioni innescate dall’ictus a livello di sistema non può attualmente essere replicata utilizzando modelli in vitro . Pertanto, i modelli animali sperimentali sono essenziali per approfondire i meccanismi della malattia e per sviluppare e testare nuove terapie. Attualmente, la riperfusione tissutale precoce è l’unico intervento approvato, sia attraverso la trombolisi con attivatore del plasminogeno di tipo tissutale (tPA) che la trombectomia endovascolare1.
Le occlusioni dell’arteria cerebrale media (MCA) sono frequenti nei pazienti colpiti da ictus. Di conseguenza, nei ratti 2,3,4 sono stati inizialmente sviluppati modelli di occlusione transitoria di MCA (tMCAo) di roditori. Al giorno d’oggi, i topi geneticamente modificati sono gli animali più comunemente usati nei modelli sperimentali di ictus. In questo studio, descriviamo un modello minimamente invasivo di tMCAo intraluminale nei topi. L’approccio viene eseguito attraverso l’arteria carotide a livello del collo, senza craniectomia.
La durata del periodo di occlusione è un fattore critico che determina l’estensione della lesione ischemica. Anche brevi occlusioni di 10 minuti possono causare la morte neuronale selettiva senza un apparente infarto, mentre occlusioni più lunghe, in genere della durata di 30-60 minuti, provocano un certo grado di infarto cerebrale. A differenza dei rami prossimali e distali dell’MCA che irrorano la corteccia e hanno collaterali, le arterie lenticolo-striatali che forniscono sangue allo striato mancano di collaterali5. Di conseguenza, c’è una maggiore riduzione del flusso sanguigno nello striato rispetto alla corteccia dopo tMCAo. Pertanto, occlusioni di 30 minuti o meno colpiscono generalmente lo striato ma non la corteccia, mentre occlusioni più lunghe, da 45 minuti in poi, spesso generano una lesione ischemica in tutto il territorio MCA, compreso lo striato e la corteccia dorsolaterale.
Per garantire il benessere dei topi, somministriamo analgesici prima della procedura e utilizziamo l’anestesia durante l’intervento chirurgico. Ciononostante, l’anestesia può potenzialmente introdurre alterazioni artificiali nella fisiologia del topo e influenzare alcune misure di esito6. L’intervento chirurgico, se eseguito da personale esperto, di solito dura circa 15 minuti per l’induzione di MCAo. Successivamente, il tempo totale sotto anestesia dipende dal periodo di occlusione. Per gli esperimenti in cui è fondamentale ridurre al minimo l’anestesia, una fase alternativa della procedura prevede l’interruzione dell’anestesia durante il periodo di occlusione e la limitazione alle sole fasi chirurgiche per l’inserimento e il ritiro del filamento che occlude l’MCA. Questo approccio riduce la durata dell’anestesia e minimizza i suoi potenziali effetti artefatti sul modello sperimentale 7,8. Pertanto, il metodo di induzione dell’ischemia focale transitoria è presentato mediante occlusione intraluminale dell’MCA con due varianti: con il topo anestetizzato durante l’intero periodo di occlusione o con il topo sveglio durante questo periodo. In entrambi i casi, un intervento chirurgico fittizio dovrebbe essere eseguito in parallelo all’intervento effettuato sui topi ischemici. Inoltre, vengono forniti dati sulla valutazione dell’esito misurati da test comportamentali e risonanza magnetica in vari momenti dopo la riperfusione. Infine, vengono discussi i principali fattori da considerare nell’implementazione della procedura sperimentale.
Protocol
Representative Results
Discussion
La procedura tMCAo intraluminale è il modello più comunemente utilizzato di ischemia cerebrale focale con riperfusione nella ricerca di base. Attualmente, i topi sono il modello animale preferito a causa della disponibilità di ceppi geneticamente modificati. Tuttavia, è essenziale riconoscere che i topi geneticamente modificati e il loro background genetico possono avere un impatto sulla vascolarizzazione del cervello. La presenza di circolazione collaterale e di anastomosi tra diversi territori arteriosi può influe…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Studio finanziato dalla sovvenzione PID2020-113202RB-I00 finanziata dal Ministerio de Ciencia e Innovación (MCIN)/Agencia Estatal de Investigación (AEI), Gobierno de España/10.13039/501100011033 e dal Fondo europeo di sviluppo regionale (FESR). Un modo di fare Europa”. NCC e MAR avevano borse di studio pre-dottorato (rispettivamente PRE2021-099481 e PRE2018-085737) finanziate da MCIN/AEI/ 10.13039/501100011033 e da “European Social Fund (ESF) Investing in your future”. Ringraziamo Francisca Ruiz-Jaén e Leonardo Márquez-Kisinousky per il loro supporto tecnico. Riconosciamo il supporto della struttura di imaging MRI dell’Institut d’Investigacions Biomèdiques August Pi i Sunyer (IDIBAPS). Il Programma Centres de Recerca de Catalunya (CERCA) della Generalitat de Catalunya sostiene l’IDIBAPS.
Materials
| 6/0 suture | Arago | Vascular ligatures | |
| 6/0 suture with curved needle | Arago | Skin sutures | |
| 9 mg/mL Saline | Fresenius Kabi | CN616003 EC | For hydration |
| Anaesthesia system | SurgiVet | ||
| Blunt retractors, 1 mm wide | Fine Science Tools | 18200-09 | |
| Buprenorfine | Buprex | For pain relief | |
| Clamp applying forceps | Fine Science Tools | S&T CAF4 | |
| Dumont mini forceps | Fine Science Tools | M3S 11200-10 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 91106-12 | |
| Glue | Loctite | To stick LDF probe to the skull | |
| Grip Strength Meter | IITC Life Science Inc. | #2200 | |
| Isoflurane | B-Braun | CN571105.8 | |
| LDF Perimed | Perimed | Periflux System 5000 | |
| LDF Probe Holders | Perimed | PH 07-4 | |
| Medical tape | |||
| MRI magnet | Bruker BioSpin, Ettlingen, Germany | BioSpec 70/30 horizontal animal scanner | |
| Needle Holder with Suture Cutter | Fine Science Tools | 12002-14 | |
| Nylon filament | Doccol | 701912PK5Re | |
| Recovery cage with heating pad | |||
| Sirgical scissors | Fine Science Tools | 91401-12 | |
| Small vessel cauterizer kit | Fine Science Tools | 18000-00 | |
| Stereomicroscope and cold light | Leica | M60 | |
| Suture tying forceps | Fine Science Tools | 18025-10 | |
| Thermostat, rectal probe and mouse pad | Letica Science Instruments | LE 13206 | |
| Vannas spring scissors (4mm cutting edge) | Fine Science Tools | 15019-10 | |
| Vascular clamps | Fine Science Tools | 00396-01 |
References
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