Recolección y cultivo primario de células endoteliales linfáticas leptomeníngeas
Summary
Las células endoteliales linfáticas leptomeníngeas (LLC), un tipo de célula intracraneal recientemente identificada, tienen funciones poco conocidas. En este estudio se presenta un protocolo reproducible para la recolección de LLECs de ratones y el establecimiento de cultivos primarios in vitro . Este protocolo está diseñado para permitir a los investigadores profundizar en las funciones celulares y las posibles implicaciones clínicas de los LLECs.
Abstract
Las células endoteliales linfáticas leptomeníngeas (LLECs) son una población celular intracraneal recientemente descubierta con una distribución única claramente distinta de las células endoteliales linfáticas periféricas. Su función celular y sus implicaciones clínicas siguen siendo en gran medida desconocidas. En consecuencia, la disponibilidad de un suministro de LLEC es esencial para llevar a cabo la investigación funcional in vitro. Sin embargo, actualmente no existe un protocolo para la recolección y el cultivo de LLEC in vitro.
Este estudio cosechó con éxito los LLEC utilizando un protocolo de varios pasos, que incluyó el recubrimiento del matraz con fibronectina, la disección de las leptomeninges con la ayuda de un microscopio, la digestión enzimática de las leptomeninges para preparar una suspensión unicelular, la inducción de la expansión de los LLEC con el factor de crecimiento endotelial vascular-C (VEGF-C) y la selección de células positivas para el receptor hialurónico-1 del vaso linfático (LYVE-1) a través de la clasificación celular activada magnéticamente (MACS). Este proceso condujo finalmente al establecimiento de una cultura primaria. La pureza de los LLEC se confirmó mediante tinción de inmunofluorescencia y análisis de citometría de flujo, con un nivel de pureza superior al 95%. Este protocolo de varios pasos ha demostrado reproducibilidad y viabilidad, lo que facilitará en gran medida la exploración de la función celular y las implicaciones clínicas de los LLECs.
Introduction
Las células endoteliales linfáticas leptomeníngeas (LLECs) recientemente descubiertas forman una malla de células individuales dentro de las leptomeninges, exhibiendo un patrón de distribución distinto en comparación con las células endoteliales linfáticas periféricas 1,2. Las funciones celulares y las implicaciones clínicas asociadas con los LLEC siguen siendo en gran medida un territorio inexplorado. Con el fin de allanar el camino para la investigación funcional de los LLECs, es imperativo establecer un modelo in vitro para su estudio. Por lo tanto, este estudio ha diseñado un protocolo integral para el aislamiento y el cultivo primario de los LLECs.
Los ratones son el modelo animal preferido debido a su idoneidad para la manipulación genética en la investigación de enfermedades. Estudios anteriores han aislado con éxito células endoteliales linfáticas de varios tejidos de ratón, incluidos los ganglios linfáticos3, el tejido mesentérico4, el tejido dérmico5, los linfáticos colectores6 y el tejido pulmonar7. Estos procedimientos de aislamiento se han basado principalmente en técnicas como la clasificación de células activadas magnéticamente (MACS) y la clasificación por citometría de flujo 8,9,10. Además, los esfuerzos de investigación han llevado al establecimiento de líneas celulares aracnoideas de rata y líneas celulares capilares linfáticas de rata11,12. A pesar de la existencia de técnicas de cultivo de explantes para leptomeninges13, existe una necesidad urgente de un protocolo estandarizado para el aislamiento y cultivo de LLECs. En consecuencia, este estudio ha cosechado y cultivado con éxito LLECs disociando meticulosamente leptomeninges bajo la guía de un microscopio y promoviendo la expansión de LLECs mediante el uso del factor de crecimiento endotelial vascular-C (VEGF-C). El marcador distintivo de las células endoteliales linfáticas es el receptor hialurónico de vasos linfáticos-1 (LYVE-1)14. Este protocolo de varios pasos aísla selectivamente los LLEC positivos para LYVE-1 mediante MACS y, posteriormente, verifica su pureza mediante análisis citométrico de flujo y tinción inmunofluorescente.
Los pasos principales de este protocolo de varios pasos se pueden resumir de la siguiente manera: recubrimiento de matraz, disociación de leptomeninges, digestión enzimática de leptomeninges, expansión celular, selección celular magnética y posterior cultivo de LLECs. Finalmente, se confirma la pureza de los LLEC aislados mediante análisis citométrico de flujo y tinción inmunofluorescente. El objetivo general de este estudio es presentar un protocolo reproducible de varios pasos para el aislamiento de LLECs de leptomeninges de ratón y su posterior cultivo in vitro . Este protocolo está preparado para facilitar en gran medida las investigaciones sobre las funciones celulares y las implicaciones clínicas de los LLECs.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo existente para la recolección y el cultivo de LLEC in vitro no ha sido reportado previamente. Este estudio presenta un protocolo reproducible y multiprocedimiento para la recolección y el cultivo de LLEC de leptomeninges de ratón.
Si bien este protocolo de procedimientos múltiples es reproducible, hay varias consideraciones clave. Por ejemplo, los matraces T25 recubiertos de fibronectina promueven la adhesión de los LLEC y su función eliminando las células no adher…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El estudio contó con el apoyo de subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81960226, 81760223), la Fundación de Ciencias Naturales de la Provincia de Yunnan (202001AS070045, 202301AY070001-011) y la Fundación de Investigación Científica del Departamento de Educación de la Provincia de Yunnan (2023Y0784).
Materials
| Block buffer | Beyotime | P0102 | Store aliquots at –4 °C |
| Collagenase I | Solarbio | C8140 | Store aliquots at –20 °C |
| DAPI | Beyotime | P0131 | Store aliquots at –20 °C |
| DMEM | Solarbio | 11995 | Store aliquots at –4 °C |
| D-PBS | Solarbio | D1041 | Store aliquots at –4 °C |
| EGM-2 MV Bullet Kit | Lonza | C-3202 | Store aliquots at –4 °C |
| FBS | Solarbio | S9010 | Store aliquots at –20 °C |
| Fibronectin | Solarbio | F8180 | Store aliquots at –20 °C |
| FlowJo Software | BD Biosciences | V10.8.1 | |
| LYVE-1 antibody | eBioscience | 12-0443-82 | Store aliquots at –4 °C |
| Magnetic separator | Miltenyi | 130-042-302 | Sterile before use |
| Magnetic separator stand | Miltenyi | 130-042-303 | Sterile before use |
| Microbeads | Miltenyi | 130-048-801 | Store aliquots at –4 °C |
| P/S | Solarbio | P1400 | Store aliquots at –20 °C |
| Papain | Solarbio | G8430-25g | Store aliquots at –20 °C |
| PBS | Solarbio | D1040 | Store aliquots at –4 °C |
| PDPN antibody | Santa | sc-53533 | Store aliquots at –4 °C |
| PFA | Solarbio | P1110 | Store aliquots at –4 °C |
| PROX1 antibody | Santa | sc-81983 | Store aliquots at –4 °C |
| Selection column | Miltenyi | 130-042-401 | Sterile before use |
| Trypsin | Gibco | 25200072 | Store aliquots at –20 °C |
| VEGF-C | Abcam | ab51947 | Store aliquots at –20 °C |
| VEGFR-3 antibody | Santa | sc-514825 | Store aliquots at –4 °C |
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