软脑膜淋巴内皮细胞的收获和原代培养

Summary

软脑膜淋巴内皮细胞 （LEC） 是一种最近发现的颅内细胞类型，其功能知之甚少。本研究提出了一种可重复的方案，用于从小鼠收获 LLEC 并建立 体外 原代培养物。该协议旨在使研究人员能够深入研究 LEC 的细胞功能和潜在临床意义。

Abstract

软脑膜淋巴内皮细胞 （LEC） 是最近发现的颅内细胞群，具有与外周淋巴内皮细胞明显不同的独特分布。它们的细胞功能和临床意义在很大程度上仍然未知。因此，LLEC供应的可用性对于进行体外功能研究至关重要。然而，目前尚无现成的 体外收获和培养 LEC 的方案。

本研究使用多步骤方案成功收获了 LEC，其中包括用纤连蛋白包被烧瓶、在显微镜的帮助下解剖软脑膜、酶促消化软脑膜以制备单细胞悬浮液、用血管内皮生长因子-C （VEGF-C） 诱导 LLEC 扩增，以及通过磁活化细胞分选 （MACS） 选择淋巴管透明质酸受体-1 （LYVE-1） 阳性细胞。这个过程最终导致了一种主要文化的建立。通过免疫荧光染色和流式细胞术分析确认了LLECs的纯度，纯度超过95%。该多步方案已证明具有可重复性和可行性，这将极大地促进探索LLEC的细胞功能和临床意义。

Introduction

新发现的软脑膜淋巴内皮细胞 （LEC） 在软脑膜内形成单个细胞的网状结构，与外周淋巴内皮细胞相比，表现出不同的分布模式 ^1,2。与LLEC相关的细胞功能和临床意义在很大程度上仍然是未知的领域。为了为LLEC的功能研究铺平道路，必须建立体外模型进行研究。因此，本研究设计了一种用于 LEC 分离和原代培养的综合方案。

小鼠是首选的动物模型，因为它们适合在疾病研究中进行基因操作。先前的研究已成功从各种小鼠组织中分离出淋巴内皮细胞，包括淋巴结³、肠系膜组织⁴、真皮组织⁵、收集淋巴管⁶ 和肺组织⁷。这些分离程序主要依赖于磁活化细胞分选 （MACS） 和流式细胞术分选等技术 ^8,9,10。此外，研究工作还导致了大鼠蛛网膜细胞系和大鼠淋巴毛细血管细胞系的建立^11,12。尽管存在针对软脑膜¹³ 的外植体培养技术，但迫切需要一种标准化的方案来分离和培养 LLECs。因此，本研究通过在显微镜引导下细致地解离软脑膜，并通过使用血管内皮生长因子-C（VEGF-C）促进LLECs扩增，成功地收获和培养了LEC。淋巴内皮细胞的独特标志物是淋巴管透明质酸受体-1 （LYVE-1）¹⁴。该多步骤方案使用 MACS 选择性分离 LYVE-1 阳性 LEC，随后通过流式细胞术分析和免疫荧光染色验证其纯度。

该多步骤方案的主要步骤可以总结如下：烧瓶包被、软脑膜解离、软脑膜酶消化、细胞扩增、磁性细胞选择和随后的 LEC 培养。最后，通过流式细胞术分析和免疫荧光染色确认分离的LLECs的纯度。本研究的总体目标是提出一种可重复的多步骤方案，用于从小鼠软脑膜及其随后 的体外 培养中分离 LLEC。该协议有望极大地促进对 LEC 的细胞功能和临床意义的研究。

Protocol

该研究获得了昆明医科大学动物实验伦理委员会（kmmu20220945）的批准。所有实验均遵循既定的动物护理准则。从年龄在6-8周龄、体重在20-25g之间的雄性C57Bl/6J小鼠中收获软脑膜淋巴内皮细胞（LEC）。这些小鼠购自中国昆明的昆明医科大学。整个实验过程在严格的无菌条件下进行。除非另有说明，否则所有离心步骤均在室温下进行。 1.试剂和仪器的制备 <p class="jove…

Representative Results

本研究提出了一种可重复的多步骤方案，用于从小鼠身上收获淋巴内皮细胞 （LEC） 并随后 在体外建立其原代培养物。关键步骤包括烧瓶制备和纤连蛋白包被、软脑膜解离、通过酶消化获得单细胞悬浮液以及用 VEGF-C 诱导 LLECs 扩增。然后使用磁活化细胞分选 （MACS） 选择性分离 LYVE-1 阳性 LEC。最后，进行免疫荧光染色和流式细胞术分析以评估 LLEC 纯度，MTT 测定结果显示 LLEC 生长速率稳健（…

Discussion

以前没有报道过在 体外 收获和培养LLEC的现有方案。本研究介绍了一种可重复的多程序方案，用于从小鼠软脑膜中收获和培养 LEC。

虽然这种多程序方案是可重复的，但有几个关键考虑因素。例如，纤连蛋白包被的 T25 烧瓶通过消除非贴壁细胞来促进 LEC 的粘附和功能，从而确保更均匀的细胞群。此外，解离软脑膜的手术过程的持续时间和温度是影响细胞活力的关键因素…

Materials

Block buffer	Beyotime	P0102	Store aliquots at –4 °C
Collagenase I	Solarbio	C8140	Store aliquots at –20 °C
DAPI	Beyotime	P0131	Store aliquots at –20 °C
DMEM	Solarbio	11995	Store aliquots at –4 °C
D-PBS	Solarbio	D1041	Store aliquots at –4 °C
EGM-2 MV Bullet Kit	Lonza	C-3202	Store aliquots at –4 °C
FBS	Solarbio	S9010	Store aliquots at –20 °C
Fibronectin	Solarbio	F8180	Store aliquots at –20 °C
FlowJo Software	BD Biosciences	V10.8.1
LYVE-1 antibody	eBioscience	12-0443-82	Store aliquots at –4 °C
Magnetic separator	Miltenyi	130-042-302	Sterile before use
Magnetic separator stand	Miltenyi	130-042-303	Sterile before use
Microbeads	Miltenyi	130-048-801	Store aliquots at –4 °C
P/S	Solarbio	P1400	Store aliquots at –20 °C
Papain	Solarbio	G8430-25g	Store aliquots at –20 °C
PBS	Solarbio	D1040	Store aliquots at –4 °C
PDPN antibody	Santa	sc-53533	Store aliquots at –4 °C
PFA	Solarbio	P1110	Store aliquots at –4 °C
PROX1 antibody	Santa	sc-81983	Store aliquots at –4 °C
Selection column	Miltenyi	130-042-401	Sterile before use
Trypsin	Gibco	25200072	Store aliquots at –20 °C
VEGF-C	Abcam	ab51947	Store aliquots at –20 °C
VEGFR-3 antibody	Santa	sc-514825	Store aliquots at –4 °C