Gewinnung und Primärkultur von leptomeningealen lymphatischen Endothelzellen

Summary

Leptomeningeale lymphatische Endothelzellen (LLECs), ein kürzlich identifizierter intrakranieller Zelltyp, haben nur unzureichend verstandene Funktionen. In dieser Studie wird ein reproduzierbares Protokoll für die Entnahme von LLECs aus Mäusen und die Etablierung von In-vitro-Primärkulturen vorgestellt. Dieses Protokoll soll es Forschern ermöglichen, sich mit den zellulären Funktionen und möglichen klinischen Auswirkungen von LLECs zu befassen.

Abstract

Leptomeningeale lymphatische Endothelzellen (LLECs) sind eine kürzlich entdeckte intrakranielle Zellpopulation mit einer einzigartigen Verteilung, die sich deutlich von peripheren lymphatischen Endothelzellen unterscheidet. Ihre zelluläre Funktion und ihre klinischen Implikationen sind noch weitgehend unbekannt. Folglich ist die Verfügbarkeit eines Angebots an LLECs für die Durchführung funktioneller Forschung in vitro unerlässlich. Derzeit gibt es jedoch kein bestehendes Protokoll für die Ernte und Kultivierung von LLECs in vitro.

In dieser Studie wurden LLECs erfolgreich mit einem mehrstufigen Protokoll geerntet, das die Beschichtung des Kolbens mit Fibronektin, die Präparation der Leptomeninge mit Hilfe eines Mikroskops, die enzymatische Verdauung der Leptomeninge zur Herstellung einer Einzelzellsuspension, die Induktion der Expansion von LLECs mit dem vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor-C (VEGF-C) und die Selektion von lymphatischen Gefäß-Hyaluronrezeptor-1 (LYVE-1)-positiven Zellen durch magnetisch aktivierte Zellsortierung (MACS) umfasste. Dieser Prozess führte schließlich zur Etablierung einer Primärkultur. Die Reinheit der LLECs wurde durch Immunfluoreszenzfärbung und durchflusszytometrische Analyse mit einem Reinheitsgrad von über 95 % bestätigt. Dieses mehrstufige Protokoll hat die Reproduzierbarkeit und Durchführbarkeit unter Beweis gestellt, was die Erforschung der zellulären Funktion und der klinischen Implikationen von LLECs erheblich erleichtern wird.

Introduction

Die neu entdeckten leptomeningealen lymphatischen Endothelzellen (LLECs) bilden ein Geflecht aus einzelnen Zellen innerhalb der Leptomeninge und weisen im Vergleich zu peripheren lymphatischen Endothelzellen ein deutliches Verteilungsmuster auf ^1,2. Die zellulären Funktionen und klinischen Implikationen, die mit LLECs verbunden sind, sind nach wie vor weitgehend unbekanntes Terrain. Um den Weg für die funktionelle Forschung an LLECs zu ebnen, ist es zwingend erforderlich, ein In-vitro-Modell für ihre Untersuchung zu etablieren. Daher wurde in dieser Studie ein umfassendes Protokoll für die Isolierung und Primärkultur von LLECs entwickelt.

Mäuse sind aufgrund ihrer Eignung für die genetische Manipulation in der Krankheitsforschung das bevorzugte Tiermodell. Frühere Studien haben erfolgreich lymphatische Endothelzellen aus verschiedenen Mausgeweben isoliert, darunter Lymphknoten³, Mesenterialgewebe⁴, Hautgewebe⁵, sammelnde Lymphgefäße⁶ und Lungengewebe⁷. Diese Isolierungsverfahren beruhen in erster Linie auf Techniken wie der magnetisch aktivierten Zellsortierung (MACS) und der Durchflusszytometrie ^8,9,10. Darüber hinaus haben die Forschungsbemühungen zur Etablierung von Arachnoidalzelllinien der Ratte und lymphatischen Kapillarzelllinien der Ratte geführt^11,12. Trotz der Existenz von Explantatkulturtechniken für Leptomeninge¹³ besteht ein dringender Bedarf an einem standardisierten Protokoll für die Isolierung und Kultur von LLECs. Folglich wurden in dieser Studie erfolgreich LLECs geerntet und kultiviert, indem Leptomeninge unter Anleitung eines Mikroskops akribisch dissoziiert und die LLEC-Expansion durch den Einsatz des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors-C (VEGF-C) gefördert wurden. Der charakteristische Marker für lymphatische Endothelzellen ist der lymphatische Gefäß-Hyaluronrezeptor-1 (LYVE-1)¹⁴. Dieses mehrstufige Protokoll isoliert selektiv LYVE-1-positive LLECs mittels MACS und verifiziert anschließend ihre Reinheit durch durchflusszytometrische Analyse und Immunfluoreszenzfärbung.

Die Hauptschritte dieses mehrstufigen Protokolls können wie folgt zusammengefasst werden: Kolbenbeschichtung, Dissoziation von Leptomeningen, enzymatischer Verdau von Leptomeningen, Zellexpansion, magnetische Zellselektion und anschließende Kultur von LLECs. Abschließend wird die Reinheit der isolierten LLECs durch durchflusszytometrische Analyse und Immunfluoreszenzfärbung bestätigt. Das übergeordnete Ziel dieser Studie ist es, ein reproduzierbares, mehrstufiges Protokoll für die Isolierung von LLECs aus Leptomeningen der Maus und deren anschließende in vitro Kultur vorzustellen. Dieses Protokoll wird die Untersuchung der zellulären Funktionen und der klinischen Implikationen von LLECs erheblich erleichtern.

Protocol

Diese Forschung wurde von der Ethikkommission für Tierversuche der Medizinischen Universität Kunming genehmigt (kmmu20220945). Alle Versuche hielten sich an die etablierten Richtlinien für die Tierpflege. Leptomeningeale lymphatische Endothelzellen (LLECs) wurden von männlichen C57Bl/6J-Mäusen im Alter von 6-8 Wochen und einem Gewicht zwischen 20-25 g gewonnen. Diese Mäuse wurden von der Medizinischen Universität Kunming in Kunming, China, beschafft. Der gesamte Versuchsablauf wurde unter streng sterilen Bedingung…

Representative Results

In dieser Studie wird ein reproduzierbares, mehrstufiges Protokoll für die Entnahme von lymphatischen Endothelzellen (LLECs) aus Mäusen und die anschließende Etablierung ihrer Primärkultur in vitro vorgestellt. Zu den wichtigsten Schritten gehören die Kolbenvorbereitung und die Fibronektin-Beschichtung, die Dissoziation von Leptomeningen, die Gewinnung einer Einzelzellsuspension durch enzymatischen Aufschluss und die Induktion der LLEC-Expansion mit VEGF-C. LYVE-1-positive LLECs werden dann selektiv mittels…

Discussion

Über das bestehende Protokoll für die Ernte und Kultivierung von LLECs in vitro wurde bisher nicht berichtet. In dieser Studie wird ein reproduzierbares, multiprozedurales Protokoll für die Gewinnung und Kultivierung von LLECs aus Leptomeningen der Maus vorgestellt.

Obwohl dieses multiprozedurale Protokoll reproduzierbar ist, gibt es mehrere wichtige Überlegungen. Zum Beispiel fördern Fibronektin-beschichtete T25-Kolben die Adhäsion von LLECs und ihre Funktion, indem sie nicht a…

Materials

Block buffer	Beyotime	P0102	Store aliquots at –4 °C
Collagenase I	Solarbio	C8140	Store aliquots at –20 °C
DAPI	Beyotime	P0131	Store aliquots at –20 °C
DMEM	Solarbio	11995	Store aliquots at –4 °C
D-PBS	Solarbio	D1041	Store aliquots at –4 °C
EGM-2 MV Bullet Kit	Lonza	C-3202	Store aliquots at –4 °C
FBS	Solarbio	S9010	Store aliquots at –20 °C
Fibronectin	Solarbio	F8180	Store aliquots at –20 °C
FlowJo Software	BD Biosciences	V10.8.1
LYVE-1 antibody	eBioscience	12-0443-82	Store aliquots at –4 °C
Magnetic separator	Miltenyi	130-042-302	Sterile before use
Magnetic separator stand	Miltenyi	130-042-303	Sterile before use
Microbeads	Miltenyi	130-048-801	Store aliquots at –4 °C
P/S	Solarbio	P1400	Store aliquots at –20 °C
Papain	Solarbio	G8430-25g	Store aliquots at –20 °C
PBS	Solarbio	D1040	Store aliquots at –4 °C
PDPN antibody	Santa	sc-53533	Store aliquots at –4 °C
PFA	Solarbio	P1110	Store aliquots at –4 °C
PROX1 antibody	Santa	sc-81983	Store aliquots at –4 °C
Selection column	Miltenyi	130-042-401	Sterile before use
Trypsin	Gibco	25200072	Store aliquots at –20 °C
VEGF-C	Abcam	ab51947	Store aliquots at –20 °C
VEGFR-3 antibody	Santa	sc-514825	Store aliquots at –4 °C