Raccolta e coltura primaria di cellule endoteliali linfatiche leptomeningee
Summary
Le cellule endoteliali linfatiche leptomeningee (LLEC), un tipo di cellula intracranica recentemente identificato, hanno funzioni poco conosciute. Questo studio presenta un protocollo riproducibile per la raccolta di LLEC dai topi e la creazione di colture primarie in vitro . Questo protocollo è progettato per consentire ai ricercatori di approfondire le funzioni cellulari e le potenziali implicazioni cliniche delle LLEC.
Abstract
Le cellule endoteliali linfatiche leptomeningee (LLEC) sono una popolazione cellulare intracranica scoperta di recente con una distribuzione unica chiaramente distinta dalle cellule endoteliali linfatiche periferiche. La loro funzione cellulare e le implicazioni cliniche rimangono in gran parte sconosciute. Di conseguenza, la disponibilità di una fornitura di LLEC è essenziale per condurre ricerche funzionali in vitro. Tuttavia, attualmente non esiste un protocollo esistente per la raccolta e la coltura di LLEC in vitro.
Questo studio ha raccolto con successo le LLEC utilizzando un protocollo a più fasi, che includeva il rivestimento del pallone con fibronectina, la dissezione delle leptomeningi con l’assistenza di un microscopio, la digestione enzimatica delle leptomeningi per preparare una sospensione a singola cellula, l’induzione dell’espansione delle LLEC con il fattore di crescita dell’endotelio vascolare-C (VEGF-C) e la selezione di cellule positive al recettore ialuronico dei vasi linfatici-1 (LYVE-1) attraverso la selezione cellulare attivata magneticamente (MACS). Questo processo ha portato alla creazione di una cultura primaria. La purezza degli LLEC è stata confermata attraverso la colorazione in immunofluorescenza e l’analisi citofluorimetrica, con un livello di purezza superiore al 95%. Questo protocollo in più fasi ha dimostrato riproducibilità e fattibilità, il che faciliterà notevolmente l’esplorazione della funzione cellulare e delle implicazioni cliniche delle LLEC.
Introduction
Le cellule endoteliali linfatiche leptomeningee (LLEC) appena scoperte formano un reticolo di singole cellule all’interno delle leptomeningi, mostrando un modello di distribuzione distinto rispetto alle cellule endoteliali linfatiche periferiche 1,2. Le funzioni cellulari e le implicazioni cliniche associate alle LLEC rimangono in gran parte un territorio inesplorato. Al fine di aprire la strada alla ricerca funzionale sui LLEC, è imperativo stabilire un modello in vitro per il loro studio. Pertanto, questo studio ha ideato un protocollo completo per l’isolamento e la coltura primaria delle LLEC.
I topi sono il modello animale preferito per la loro idoneità alla manipolazione genetica nella ricerca sulle malattie. Studi precedenti hanno isolato con successo cellule endoteliali linfatiche da vari tessuti di topo, tra cui i linfonodi3, il tessuto mesenterico4, il tessuto dermico5, i linfatici di raccolta6 e il tessuto polmonare7. Queste procedure di isolamento si sono basate principalmente su tecniche come il cernimento cellulare attivato magneticamente (MACS) e lo smistamento con citometria a flusso 8,9,10. Inoltre, gli sforzi di ricerca hanno portato alla creazione di linee cellulari aracnoidee di ratto e linee cellulari capillari linfatiche di ratto11,12. Nonostante l’esistenza di tecniche di coltura di espianto per leptomeningi13, esiste un urgente bisogno di un protocollo standardizzato per l’isolamento e la coltura delle LLEC. Di conseguenza, questo studio ha raccolto e coltivato con successo le LLEC dissociando meticolosamente le leptomeningi sotto la guida di un microscopio e promuovendo l’espansione delle LLEC attraverso l’uso del fattore di crescita dell’endotelio vascolare-C (VEGF-C). Il marcatore distintivo per le cellule endoteliali linfatiche è il recettore ialuronico dei vasi linfatici-1 (LYVE-1)14. Questo protocollo a più fasi isola selettivamente gli LLEC positivi a LYVE-1 utilizzando MACS e successivamente ne verifica la purezza attraverso l’analisi citofluorimetrica e la colorazione immunofluorescente.
Le fasi principali di questo protocollo multi-step possono essere riassunte come segue: rivestimento del pallone, dissociazione delle leptomeningi, digestione enzimatica delle leptomeningi, espansione cellulare, selezione magnetica delle cellule e successiva coltura di LLEC. Infine, la purezza delle LLEC isolate è confermata attraverso l’analisi citofluorimetrica e la colorazione immunofluorescente. L’obiettivo generale di questo studio è quello di presentare un protocollo riproducibile e multi-step per l’isolamento di LLEC da leptomeningi di topo e la loro successiva coltura in vitro . Questo protocollo è destinato a facilitare notevolmente le indagini sulle funzioni cellulari e sulle implicazioni cliniche delle LLEC.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo esistente per la raccolta e la coltura di LLEC in vitro non è stato precedentemente riportato. Questo studio introduce un protocollo riproducibile e multiprocedurale per la raccolta e la coltura di LLEC da leptomeningi di topo.
Sebbene questo protocollo multiprocedurale sia riproducibile, ci sono diverse considerazioni chiave. Ad esempio, i palloni T25 rivestiti di fibronectina promuovono l’adesione delle LLEC e funzionano eliminando le cellule non aderenti, garantendo …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Lo studio è stato sostenuto da sovvenzioni della National Natural Science Foundation of China (81960226, 81760223), della Natural Science Foundation della provincia dello Yunnan (202001AS070045, 202301AY070001-011) e della Scientific Research Foundation del Dipartimento dell’Istruzione della provincia dello Yunnan (2023Y0784).
Materials
| Block buffer | Beyotime | P0102 | Store aliquots at –4 °C |
| Collagenase I | Solarbio | C8140 | Store aliquots at –20 °C |
| DAPI | Beyotime | P0131 | Store aliquots at –20 °C |
| DMEM | Solarbio | 11995 | Store aliquots at –4 °C |
| D-PBS | Solarbio | D1041 | Store aliquots at –4 °C |
| EGM-2 MV Bullet Kit | Lonza | C-3202 | Store aliquots at –4 °C |
| FBS | Solarbio | S9010 | Store aliquots at –20 °C |
| Fibronectin | Solarbio | F8180 | Store aliquots at –20 °C |
| FlowJo Software | BD Biosciences | V10.8.1 | |
| LYVE-1 antibody | eBioscience | 12-0443-82 | Store aliquots at –4 °C |
| Magnetic separator | Miltenyi | 130-042-302 | Sterile before use |
| Magnetic separator stand | Miltenyi | 130-042-303 | Sterile before use |
| Microbeads | Miltenyi | 130-048-801 | Store aliquots at –4 °C |
| P/S | Solarbio | P1400 | Store aliquots at –20 °C |
| Papain | Solarbio | G8430-25g | Store aliquots at –20 °C |
| PBS | Solarbio | D1040 | Store aliquots at –4 °C |
| PDPN antibody | Santa | sc-53533 | Store aliquots at –4 °C |
| PFA | Solarbio | P1110 | Store aliquots at –4 °C |
| PROX1 antibody | Santa | sc-81983 | Store aliquots at –4 °C |
| Selection column | Miltenyi | 130-042-401 | Sterile before use |
| Trypsin | Gibco | 25200072 | Store aliquots at –20 °C |
| VEGF-C | Abcam | ab51947 | Store aliquots at –20 °C |
| VEGFR-3 antibody | Santa | sc-514825 | Store aliquots at –4 °C |
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