Høsting og primærkultur av leptomeningeale lymfatiske endotelceller
Summary
Leptomeningeale lymfatiske endotelceller (LLECs), en nylig identifisert intrakraniell celletype, har dårlig forstått funksjoner. Denne studien presenterer en reproduserbar protokoll for høsting av LLEC fra mus og etablering av in vitro primærkulturer. Denne protokollen er utformet for å gjøre det mulig for forskere å dykke inn i cellulære funksjoner og potensielle kliniske implikasjoner av LLECs.
Abstract
Leptomeningeale lymfatiske endotelceller (LLECs) er en nylig oppdaget intrakraniell cellulær populasjon med en unik fordeling klart forskjellig fra perifere lymfatiske endotelceller. Deres cellulære funksjon og kliniske implikasjoner forblir stort sett ukjente. Derfor er tilgjengeligheten av en tilførsel av LLEC avgjørende for å utføre funksjonell forskning in vitro. Imidlertid er det for tiden ingen eksisterende protokoll for høsting og dyrking av LLEC in vitro.
Denne studien høstet vellykket LLEC ved hjelp av en flertrinnsprotokoll, som inkluderte å belegge kolben med fibronektin, dissekere leptomeningene ved hjelp av et mikroskop, enzymatisk fordøye leptomeningene for å forberede en enkeltcellesuspensjon, indusere utvidelsen av LLEC med vaskulær endotelial vekstfaktor-C (VEGF-C), og velge lymfekarhyaluronreseptor-1 (LYVE-1) positive celler gjennom magnetisk aktivert cellesortering (MACS). Denne prosessen førte til slutt til etableringen av en primærkultur. Renheten til LLEC ble bekreftet gjennom immunfluorescensfarging og flowcytometrisk analyse, med et renhetsnivå på over 95 %. Denne flertrinnsprotokollen har vist reproduserbarhet og gjennomførbarhet, noe som i stor grad vil lette utforskningen av den cellulære funksjonen og kliniske implikasjoner av LLECs.
Introduction
De nylig oppdagede leptomeningeale lymfatiske endotelceller (LLEC) danner et maskeverk av individuelle celler i leptomeningene, og viser et distinkt distribusjonsmønster sammenlignet med perifere lymfatiske endotelceller 1,2. De cellulære funksjonene og kliniske implikasjonene forbundet med LLEC forblir stort sett ukjent territorium. For å bane vei for funksjonell forskning på LLEC, er det viktig å etablere en in vitro-modell for studien. Derfor har denne studien utarbeidet en omfattende protokoll for isolasjon og primærkultur av LLECs.
Mus er den foretrukne dyremodellen på grunn av deres egnethet for genetisk manipulasjon i sykdomsforskning. Tidligere studier har vellykket isolert lymfatiske endotelceller fra forskjellige musevev, inkludert lymfeknuter3, mesenterisk vev4, dermal vev5, samle lymfe6 og lungevev7. Disse isolasjonsprosedyrene har primært basert seg på teknikker som magnetisk-aktivert cellesortering (MACS) og flowcytometrisortering 8,9,10. I tillegg har forskningsinnsatsen ført til etablering av rotte araknoidale cellelinjer og rotte lymfatiske kapillære cellelinjer11,12. Til tross for eksistensen av eksplantkulturteknikker for leptomeninger13, eksisterer det et presserende behov for en standardisert protokoll for isolasjon og kultur av LLEC. Følgelig har denne studien vellykket høstet og dyrket LLEC ved omhyggelig dissosiering av leptomeninger under veiledning av et mikroskop og fremme LLECs ekspansjon ved bruk av vaskulær endotelial vekstfaktor-C (VEGF-C). Den karakteristiske markøren for lymfatiske endotelceller er lymfekarhyaluronreseptor-1 (LYVE-1)14. Denne flertrinnsprotokollen isolerer selektivt LYVE-1-positive LLEC-er ved bruk av MACS og verifiserer deretter deres renhet gjennom flowcytometrisk analyse og immunfluorescerende farging.
De primære trinnene i denne flertrinnsprotokollen kan oppsummeres som følger: kolbebelegg, dissosiasjon av leptomeninger, enzymatisk fordøyelse av leptomeninger, celleutvidelse, magnetisk cellevalg og påfølgende kultur av LLEC. Til slutt bekreftes renheten til de isolerte LLECene gjennom flowcytometrisk analyse og immunfluorescerende farging. Det overordnede målet med denne studien er å presentere en reproduserbar, flertrinnsprotokoll for isolering av LLEC fra museleptomeninger og deres påfølgende in vitro-kultur . Denne protokollen er klar til å legge til rette for undersøkelser av cellulære funksjoner og kliniske implikasjoner av LLECs.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den eksisterende protokollen for høsting og dyrking av LLEC in vitro er ikke tidligere rapportert. Denne studien introduserer en reproduserbar, multi-prosedyreprotokoll for høsting og dyrking av LLEC fra museleptomeninger.
Selv om denne protokollen med flere prosedyrer er reproduserbar, er det flere viktige hensyn. For eksempel fremmer fibronektinbelagte T25-kolber adhesjonen av LLEC og funksjon ved å eliminere ikke-adherente celler, og sikrer dermed en mer homogen cellulær popula…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Studien ble støttet av tilskudd fra National Natural Science Foundation of China (81960226, 81760223), Natural Science Foundation of Yunnan-provinsen (202001AS070045, 202301AY070001-011), og Scientific Research Foundation of Yunnan Province Department of Education (2023Y0784).
Materials
| Block buffer | Beyotime | P0102 | Store aliquots at –4 °C |
| Collagenase I | Solarbio | C8140 | Store aliquots at –20 °C |
| DAPI | Beyotime | P0131 | Store aliquots at –20 °C |
| DMEM | Solarbio | 11995 | Store aliquots at –4 °C |
| D-PBS | Solarbio | D1041 | Store aliquots at –4 °C |
| EGM-2 MV Bullet Kit | Lonza | C-3202 | Store aliquots at –4 °C |
| FBS | Solarbio | S9010 | Store aliquots at –20 °C |
| Fibronectin | Solarbio | F8180 | Store aliquots at –20 °C |
| FlowJo Software | BD Biosciences | V10.8.1 | |
| LYVE-1 antibody | eBioscience | 12-0443-82 | Store aliquots at –4 °C |
| Magnetic separator | Miltenyi | 130-042-302 | Sterile before use |
| Magnetic separator stand | Miltenyi | 130-042-303 | Sterile before use |
| Microbeads | Miltenyi | 130-048-801 | Store aliquots at –4 °C |
| P/S | Solarbio | P1400 | Store aliquots at –20 °C |
| Papain | Solarbio | G8430-25g | Store aliquots at –20 °C |
| PBS | Solarbio | D1040 | Store aliquots at –4 °C |
| PDPN antibody | Santa | sc-53533 | Store aliquots at –4 °C |
| PFA | Solarbio | P1110 | Store aliquots at –4 °C |
| PROX1 antibody | Santa | sc-81983 | Store aliquots at –4 °C |
| Selection column | Miltenyi | 130-042-401 | Sterile before use |
| Trypsin | Gibco | 25200072 | Store aliquots at –20 °C |
| VEGF-C | Abcam | ab51947 | Store aliquots at –20 °C |
| VEGFR-3 antibody | Santa | sc-514825 | Store aliquots at –4 °C |
References
- Shibata-Germanos, S., et al. Structural and functional conservation of non-lumenized lymphatic endothelial cells in the mammalian leptomeninges. Acta Neuropathologica. 139 (2), 383-401 (2020).
- Suárez, I., Schulte-Merker, S. Cells with many talents: lymphatic endothelial cells in the brain meninges. Cells. 10 (4), 799 (2021).
- Jordan-Williams, K. L., Ruddell, A. Culturing purifies murine lymph node lymphatic endothelium. Lymphatic Research and Biology. 12 (3), 144-149 (2014).
- Jones, B. E., Yong, L. C. Culture and characterization of bovine mesenteric lymphatic endothelium. In vitro Cellular & Developmental Biology. 23 (10), 698-706 (1987).
- Podgrabinska, S., et al. Molecular characterization of lymphatic endothelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (25), 16069-16074 (2002).
- Jablon, K. L., et al. Isolation and short-term culturing of primary lymphatic endothelial cells from collecting lymphatics: A techniques study. Microcirculation. 30 (2-3), e12778 (2023).
- Lapinski, P. E., King, P. D. Isolation and culture of mouse lymphatic endothelial cells from lung tissue. Methods in Molecular Biology. 2319, 69-75 (2021).
- Lokmic, Z. Isolation, Identification, and culture of human lymphatic endothelial cells. Methods in Molecular Biology. 1430, 77-90 (2016).
- Thiele, W., Rothley, M., Schmaus, A., Plaumann, D., Sleeman, J. Flow cytometry-based isolation of dermal lymphatic endothelial cells from newborn rats. Lymphology. 47 (4), 177-186 (2014).
- Lokmic, Z., et al. Isolation of human lymphatic endothelial cells by multi-parameter fluorescence-activated cell sorting. Journal of Visualized Experiments. 99, e52691 (2015).
- Janson, C., Romanova, L., Hansen, E., Hubel, A., Lam, C. Immortalization and functional characterization of rat arachnoid cell lines. Neuroscience. 177, 23-34 (2011).
- Romanova, L. G., Hansen, E. A., Lam, C. H. Generation and preliminary characterization of immortalized cell line derived from rat lymphatic capillaries. Microcirculation. 21 (6), 551-561 (2014).
- Park, T. I., et al. Routine culture and study of adult human brain cells from neurosurgical specimens. Nature Protocols. 17 (2), 190-221 (2022).
- Okuda, K. S., et al. lyve1 expression reveals novel lymphatic vessels and new mechanisms for lymphatic vessel development in zebrafish. Development. 139 (13), 2381-2391 (2012).
- Bokobza, C., et al. Magnetic Isolation of microglial cells from neonate mouse for primary cell cultures. Journal of Visualized Experiments. 185, e62964 (2022).
- Wang, J. M., Chen, A. F., Zhang, K. Isolation and primary culture of mouse aortic endothelial cells. Journal of Visualized Experiments. 118, e52965 (2016).
- Breiteneder-Geleff, S., et al. Angiosarcomas express mixed endothelial phenotypes of blood and lymphatic capillaries: podoplanin as a specific marker for lymphatic endothelium. The American Journal of Pathology. 154 (2), 385-394 (1999).
- Petrova, T. V., Koh, G. Y. Organ-specific lymphatic vasculature: From development to pathophysiology. The Journal of Experimental Medicine. 215 (1), 35-49 (2018).
- Wilting, J., et al. The transcription factor Prox1 is a marker for lymphatic endothelial cells in normal and diseased human tissues. The FASEB Journal. 16 (10), 1271-1273 (2002).
- Yin, X., et al. Lymphatic endothelial heparan sulfate deficiency results in altered growth responses to vascular endothelial growth factor-C (VEGF-C). The Journal of Biological Chemistry. 286 (17), 14952-14962 (2011).
- DeSisto, J., et al. Single-cell transcriptomic analyses of the developing meninges reveal meningeal fibroblast diversity and function. Developmental Cell. 54 (1), 43-59 (2020).
- Chen, Z., et al. A method for eliminating fibroblast contamination in mouse and human primary corneal epithelial cell cultures. Current Eye Research. , 1-11 (2023).
- Starzonek, C., et al. Enrichment of human dermal stem cells from primary cell cultures through the elimination of fibroblasts. Cells. 12 (6), 949 (2023).
- Lam, C. H., Romanova, L., Hubel, A., Janson, C., Hansen, E. A. The influence of fibroblast on the arachnoid leptomeningeal cells in vitro. Brain Research. 1657, 109-119 (2017).
