Skörd och primärodling av leptomeningeala lymfatiska endotelceller
Summary
Leptomeningeala lymfatiska endotelceller (LEC), en nyligen identifierad intrakraniell celltyp, har dåligt förstådda funktioner. Denna studie presenterar ett reproducerbart protokoll för skörd av LLEC från möss och etablering av in vitro primära kulturer. Detta protokoll är utformat för att göra det möjligt för forskare att fördjupa sig i de cellulära funktionerna och potentiella kliniska konsekvenserna av LEC.
Abstract
Leptomeningeala lymfatiska endotelceller (LEC) är en nyligen upptäckt intrakraniell cellulär population med en unik fördelning som tydligt skiljer sig från perifera lymfatiska endotelceller. Deras cellulära funktion och kliniska implikationer är fortfarande till stor del okända. Följaktligen är tillgången till ett utbud av LLEC avgörande för att kunna bedriva funktionell forskning in vitro. Det finns dock för närvarande inget befintligt protokoll för skörd och odling av LLEC in vitro.
Denna studie skördade framgångsrikt LLEC med hjälp av ett flerstegsprotokoll, som inkluderade beläggning av kolven med fibronektin, dissekering av leptomeningerna med hjälp av ett mikroskop, enzymatiskt smältande leptomeningerna för att framställa en encellssuspension, inducering av expansion av LLECs med vaskulär endotelial tillväxtfaktor-C (VEGF-C) och selektion av lymfkärlshyaluronreceptor-1 (LYVE-1) positiva celler genom magnetaktiverad cellsortering (MACS). Denna process ledde slutligen till att en primärkultur etablerades. RINC-renheten bekräftades genom immunofluorescensfärgning och flödescytometrisk analys, med en renhetsgrad som översteg 95 %. Detta flerstegsprotokoll har visat reproducerbarhet och genomförbarhet, vilket i hög grad kommer att underlätta utforskningen av den cellulära funktionen och de kliniska konsekvenserna av LEC.
Introduction
De nyupptäckta leptomeningeala lymfatiska endotelcellerna (LEC) bildar ett nätverk av enskilda celler inom leptomeningerna och uppvisar ett distinkt distributionsmönster jämfört med perifera lymfatiska endotelceller 1,2. De cellulära funktionerna och de kliniska implikationerna i samband med LLEC är fortfarande i stort sett outforskade områden. För att bana väg för funktionell forskning om LLEC är det absolut nödvändigt att etablera en in vitro-modell för deras studie. Därför har denna studie utarbetat ett omfattande protokoll för isolering och primär odling av LLECs.
Möss är den föredragna djurmodellen på grund av deras lämplighet för genetisk manipulation inom sjukdomsforskning. Tidigare studier har framgångsrikt isolerat lymfatiska endotelceller från olika musvävnader, inklusive lymfkörtlar3, tarmkäxvävnad4, hudvävnad5, uppsamlingslymfatik6 och lungvävnad7. Dessa isoleringsprocedurer har främst förlitat sig på tekniker som magnetisk aktiverad cellsortering (MACS) och flödescytometrisortering 8,9,10. Dessutom har forskningsinsatser lett till etablering av araknoidalcellinjer hos råtta och lymfatiska kapillärcellinjer hos råtta11,12. Trots att det finns explantationstekniker för leptomeninges13 finns det ett akut behov av ett standardiserat protokoll för isolering och odling av LLC. Följaktligen har denna studie framgångsrikt skördat och odlat LLECs genom att noggrant dissociera leptomeninges under ledning av ett mikroskop och främja LLECs expansion genom användning av vaskulär endotelial tillväxtfaktor-C (VEGF-C). Den utmärkande markören för lymfatiska endotelceller är lymfkärlets hyaluronreceptor-1 (LYVE-1)14. Detta flerstegsprotokoll isolerar selektivt LYVE-1-positiva LLEC med hjälp av MACS och verifierar därefter deras renhet genom flödescytometrisk analys och immunofluorescensfärgning.
De primära stegen i detta flerstegsprotokoll kan sammanfattas enligt följande: kolvbeläggning, dissociation av leptomeninger, enzymatisk nedbrytning av leptomeninger, cellexpansion, magnetiskt cellval och efterföljande odling av LLC. Slutligen bekräftas renheten hos de isolerade LEC-cellerna genom flödescytometrisk analys och immunofluorescensfärgning. Det övergripande syftet med denna studie är att presentera ett reproducerbart flerstegsprotokoll för isolering av LLEC från musleptomeninger och deras efterföljande in vitro-odling . Detta protokoll är redo att i hög grad underlätta undersökningar av de cellulära funktionerna och de kliniska konsekvenserna av LEC.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det befintliga protokollet för skörd och odling av LLEC in vitro har inte rapporterats tidigare. Denna studie introducerar ett reproducerbart, multiprocedurellt protokoll för skörd och odling av LLEC från musleptomeninger.
Även om detta protokoll med flera procedurer är reproducerbart finns det flera viktiga överväganden. Till exempel främjar fibronektinbelagda T25-kolvar vidhäftningen av LEC:er och funktion genom att eliminera icke-vidhäftande celler, vilket säkerställe…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Studien stöddes av anslag från National Natural Science Foundation of China (81960226, 81760223), Natural Science Foundation of Yunnan Province (202001AS070045, 202301AY070001-011) och Scientific Research Foundation of Yunnan Province Department of Education (2023Y0784).
Materials
| Block buffer | Beyotime | P0102 | Store aliquots at –4 °C |
| Collagenase I | Solarbio | C8140 | Store aliquots at –20 °C |
| DAPI | Beyotime | P0131 | Store aliquots at –20 °C |
| DMEM | Solarbio | 11995 | Store aliquots at –4 °C |
| D-PBS | Solarbio | D1041 | Store aliquots at –4 °C |
| EGM-2 MV Bullet Kit | Lonza | C-3202 | Store aliquots at –4 °C |
| FBS | Solarbio | S9010 | Store aliquots at –20 °C |
| Fibronectin | Solarbio | F8180 | Store aliquots at –20 °C |
| FlowJo Software | BD Biosciences | V10.8.1 | |
| LYVE-1 antibody | eBioscience | 12-0443-82 | Store aliquots at –4 °C |
| Magnetic separator | Miltenyi | 130-042-302 | Sterile before use |
| Magnetic separator stand | Miltenyi | 130-042-303 | Sterile before use |
| Microbeads | Miltenyi | 130-048-801 | Store aliquots at –4 °C |
| P/S | Solarbio | P1400 | Store aliquots at –20 °C |
| Papain | Solarbio | G8430-25g | Store aliquots at –20 °C |
| PBS | Solarbio | D1040 | Store aliquots at –4 °C |
| PDPN antibody | Santa | sc-53533 | Store aliquots at –4 °C |
| PFA | Solarbio | P1110 | Store aliquots at –4 °C |
| PROX1 antibody | Santa | sc-81983 | Store aliquots at –4 °C |
| Selection column | Miltenyi | 130-042-401 | Sterile before use |
| Trypsin | Gibco | 25200072 | Store aliquots at –20 °C |
| VEGF-C | Abcam | ab51947 | Store aliquots at –20 °C |
| VEGFR-3 antibody | Santa | sc-514825 | Store aliquots at –4 °C |
References
- Shibata-Germanos, S., et al. Structural and functional conservation of non-lumenized lymphatic endothelial cells in the mammalian leptomeninges. Acta Neuropathologica. 139 (2), 383-401 (2020).
- Suárez, I., Schulte-Merker, S. Cells with many talents: lymphatic endothelial cells in the brain meninges. Cells. 10 (4), 799 (2021).
- Jordan-Williams, K. L., Ruddell, A. Culturing purifies murine lymph node lymphatic endothelium. Lymphatic Research and Biology. 12 (3), 144-149 (2014).
- Jones, B. E., Yong, L. C. Culture and characterization of bovine mesenteric lymphatic endothelium. In vitro Cellular & Developmental Biology. 23 (10), 698-706 (1987).
- Podgrabinska, S., et al. Molecular characterization of lymphatic endothelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (25), 16069-16074 (2002).
- Jablon, K. L., et al. Isolation and short-term culturing of primary lymphatic endothelial cells from collecting lymphatics: A techniques study. Microcirculation. 30 (2-3), e12778 (2023).
- Lapinski, P. E., King, P. D. Isolation and culture of mouse lymphatic endothelial cells from lung tissue. Methods in Molecular Biology. 2319, 69-75 (2021).
- Lokmic, Z. Isolation, Identification, and culture of human lymphatic endothelial cells. Methods in Molecular Biology. 1430, 77-90 (2016).
- Thiele, W., Rothley, M., Schmaus, A., Plaumann, D., Sleeman, J. Flow cytometry-based isolation of dermal lymphatic endothelial cells from newborn rats. Lymphology. 47 (4), 177-186 (2014).
- Lokmic, Z., et al. Isolation of human lymphatic endothelial cells by multi-parameter fluorescence-activated cell sorting. Journal of Visualized Experiments. 99, e52691 (2015).
- Janson, C., Romanova, L., Hansen, E., Hubel, A., Lam, C. Immortalization and functional characterization of rat arachnoid cell lines. Neuroscience. 177, 23-34 (2011).
- Romanova, L. G., Hansen, E. A., Lam, C. H. Generation and preliminary characterization of immortalized cell line derived from rat lymphatic capillaries. Microcirculation. 21 (6), 551-561 (2014).
- Park, T. I., et al. Routine culture and study of adult human brain cells from neurosurgical specimens. Nature Protocols. 17 (2), 190-221 (2022).
- Okuda, K. S., et al. lyve1 expression reveals novel lymphatic vessels and new mechanisms for lymphatic vessel development in zebrafish. Development. 139 (13), 2381-2391 (2012).
- Bokobza, C., et al. Magnetic Isolation of microglial cells from neonate mouse for primary cell cultures. Journal of Visualized Experiments. 185, e62964 (2022).
- Wang, J. M., Chen, A. F., Zhang, K. Isolation and primary culture of mouse aortic endothelial cells. Journal of Visualized Experiments. 118, e52965 (2016).
- Breiteneder-Geleff, S., et al. Angiosarcomas express mixed endothelial phenotypes of blood and lymphatic capillaries: podoplanin as a specific marker for lymphatic endothelium. The American Journal of Pathology. 154 (2), 385-394 (1999).
- Petrova, T. V., Koh, G. Y. Organ-specific lymphatic vasculature: From development to pathophysiology. The Journal of Experimental Medicine. 215 (1), 35-49 (2018).
- Wilting, J., et al. The transcription factor Prox1 is a marker for lymphatic endothelial cells in normal and diseased human tissues. The FASEB Journal. 16 (10), 1271-1273 (2002).
- Yin, X., et al. Lymphatic endothelial heparan sulfate deficiency results in altered growth responses to vascular endothelial growth factor-C (VEGF-C). The Journal of Biological Chemistry. 286 (17), 14952-14962 (2011).
- DeSisto, J., et al. Single-cell transcriptomic analyses of the developing meninges reveal meningeal fibroblast diversity and function. Developmental Cell. 54 (1), 43-59 (2020).
- Chen, Z., et al. A method for eliminating fibroblast contamination in mouse and human primary corneal epithelial cell cultures. Current Eye Research. , 1-11 (2023).
- Starzonek, C., et al. Enrichment of human dermal stem cells from primary cell cultures through the elimination of fibroblasts. Cells. 12 (6), 949 (2023).
- Lam, C. H., Romanova, L., Hubel, A., Janson, C., Hansen, E. A. The influence of fibroblast on the arachnoid leptomeningeal cells in vitro. Brain Research. 1657, 109-119 (2017).
