Summary
El presente protocolo describe la técnica quirúrgica para implantar una guía de electrodos en el nervio vago abdominal en ratas, junto con métodos para pruebas de electrofisiología crónica y estimulación con el dispositivo implantado.
Abstract
La estimulación del nervio vago abdominal (ENV) se puede aplicar a la rama subdiafragmática del nervio vago de ratas. Debido a su ubicación anatómica, no tiene ningún efecto respiratorio y cardíaco fuera del objetivo comúnmente asociado con la ENV cervical. La ausencia de efectos respiratorios y cardíacos fuera del objetivo significa que no es necesario reducir la intensidad de la estimulación para reducir los efectos secundarios que se experimentan comúnmente durante la ENV cervical. Pocos estudios recientes demuestran los efectos antiinflamatorios de la ENV abdominal en modelos de ratas de enfermedad inflamatoria intestinal, artritis reumatoide y reducción de la glucemia en un modelo de rata con diabetes tipo 2. La rata es un gran modelo para explorar el potencial de esta tecnología debido a la anatomía bien establecida del nervio vago, el gran tamaño del nervio que permite un fácil manejo y la disponibilidad de muchos modelos de enfermedades. Aquí, describimos los métodos para limpiar y esterilizar la guía de electrodos VNS abdominales y el protocolo quirúrgico en ratas. También describimos la tecnología necesaria para la confirmación de la estimulación supraumbral mediante el registro de los potenciales de acción de los compuestos evocados. La ENV abdominal tiene el potencial de ofrecer un tratamiento selectivo y eficaz para una variedad de afecciones, incluidas las enfermedades inflamatorias, y se espera que la aplicación se expanda de manera similar a la ENV cervical.
Introduction
La estimulación del nervio vago (ENV) administrada en el sitio cervical en el cuello es un tratamiento aprobado por la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos (FDA) para la epilepsia refractaria, la depresión refractaria y la rehabilitación posterior a un accidente cerebrovascular isquémico1, y aprobado por la Comisión Europea para la insuficiencia cardíaca en Europa2. La VNS cervical no invasiva está aprobada por la FDA para la migraña y el dolor decabeza. Se espera que su aplicación se amplíe, con ensayos clínicos recientes que muestran la eficacia de la ENV en otras indicaciones como la enfermedad de Crohn3, la artritis reumatoide 4,5 y la alteración de la tolerancia a la glucosa y la diabetes tipo 2 6,7. Aunque prometedora, la ENV cervical puede causar bradicardia y apnea debido a la activación fuera del objetivo de las fibras nerviosas que inervan los pulmones y el corazón 8,9,10. Los efectos secundarios como tos, dolor, alteración de la voz, cefalea y aumento del índice de apnea-hipopnea son comúnmente reportados en pacientes que reciben ENV cervical11,12. La reducción de la fuerza de estimulación es una estrategia común para reducir estos efectos secundarios, sin embargo, la carga reducida puede limitar la eficacia de la terapia con ENV al no activar las fibras terapéuticas11. En apoyo de esta hipótesis, la tasa de respuesta de los pacientes que recibieron estimulación de alta intensidad para el tratamiento de la epilepsia fue mayor que la de los pacientes que recibieron estimulación de baja intensidad13.
La ENV abdominal se aplica sobre el nervio vago subdiafragmático, por encima de las ramas hepática y celíaca14 (Figura 1). Nuestro estudio previo demostró que en ratas la ENV abdominal no causa efectos secundarios cardíacos o respiratorios asociados con la ENV cervical10. Estudios anteriores también demuestran efectos antiinflamatorios de la ENV abdominal en un modelo de rata de enfermedad inflamatoria intestinal y artritis reumatoide10,15, así como la reducción de la glucemia en un modelo de rata con diabetes tipo 216. Recientemente, la tecnología de VNS abdominal se ha traducido para un primer ensayo clínico en humanos para el tratamiento de la enfermedad inflamatoria intestinal (NCT05469607).
La matriz de electrodos de nervio periférico utilizada para administrar estimulación al nervio vago abdominal (WO201909502017) se ha desarrollado a medida para su uso en ratas, y consta de dos o tres pares de electrodos de platino colocados a 4,7 mm de distancia, soportados por un manguito de elastómero de silicona de grado médico, una lengüeta de sutura para anclar la matriz al esófago, un cable conductor y un conector percutáneo que se monta en la región lumbar (Figura 2). El cable conductor se tuneliza debajo de la piel en el lado izquierdo del animal. El diseño de múltiples pares de electrodos permite la estimulación eléctrica del nervio, así como el registro de los potenciales de acción compuestos evocados eléctricamente (ECAP), lo que confirma la colocación correcta del implante en el nervio y las intensidades de estimulación supraumbral. La ENV abdominal es bien tolerada en ratas que se mueven libremente durante los meses 10,15,16. Esto permite evaluar su eficacia en modelos de enfermedad.
Este manuscrito describe los métodos para la esterilización de la matriz de electrodos, la cirugía de implantación del nervio vago abdominal y la estimulación crónica y el registro de ECAP en ratas despiertas para estudiar la eficacia de la ENV abdominal en una variedad de modelos de enfermedad. Estos métodos se desarrollaron originalmente para estudiar la eficacia de la ENV abdominal en el modelo de rata de enfermedad inflamatoria intestinal10 y también se han utilizado con éxito para un modelo de rata de artritis reumatoide15 y diabetes16.
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Protocol
Todos los procedimientos que involucran animales fueron aprobados por el Comité de Ética Animal del Hospital St. Vincent (Melbourne) y cumplieron con el Código Australiano para el Cuidado y Uso de Animales con Fines Científicos (Consejo Nacional de Salud e Investigación Médica de Australia) y la Ley de Prevención de la Crueldad contra los Animales (1986). En total, se utilizaron 24 ratas hembras Dark Agouti (8-9 semanas de edad) para este estudio. Los grupos experimentales consistieron en: una cohorte normal (n = 8) que no recibió inyección de colágeno ni implante de ENV; una cohorte de enfermedad no estimulada (n = 8) que recibió un implante y una inyección de colágeno (no se realizaron pruebas electrofisiológicas); y una cohorte de enfermedad estimulada (n = 8) que recibió un implante, una inyección de colágeno, pruebas electrofisiológicas y terapia VNS. La cirugía de implantación se realizó 5 días antes de la inyección de colágeno, y la habituación a la terapia con ENV comenzó 4 días después de la inyección de colágeno y se produjo durante 7 días. La terapia con ENV se aplicó desde el día 11 hasta el 17 (inclusive) después de la inyección de colágeno15. Para la cohorte de la enfermedad estimulada, las pruebas electrofisiológicas se realizaron inmediatamente después de la cirugía de implantación bajo anestesia, el día de la inyección de colágeno, 10 días después de la inyección de colágeno y el día de la terminación (17 días después de la inyección de colágeno).
1. Sonicación y esterilización de la guía de electrodos
- Ajuste el limpiador ultrasónico a una frecuencia de 80 kHz y llene el tanque ultrasónico con agua del grifo. Sumerja la guía de electrodos en la solución de limpieza en un recipiente de plástico limpio y colóquela en el tanque ultrasónico.
NOTA: La solución de limpieza y el tiempo de sonicación que deben utilizarse para cada paso se resumen en la Tabla 1. Use un recipiente limpio para cada paso. - Coloque la guía de electrodos sonicados en una bolsa de esterilización con pinzas limpias sonicadas con una solución de limpieza líquida al 0,5% en agua destilada y enjuagada con agua destilada. Autoclave la guía de electrodos durante 45 minutos con una temperatura máxima de 130 °C y déjela secar en un banco limpio.
2. Implantación de una guía de electrodos en el nervio vago abdominal
NOTA: En este estudio hemos utilizado ratas agutí oscuras hembras (8-9 semanas de edad)15. También hemos utilizado con éxito este protocolo para implantar crónicamente ratas Sprague-Dawley macho adulto (10-14 semanas de edad)10,16. La cirugía se lleva a cabo en condiciones asépticas, y todos los instrumentos, la guía de electrodos y los consumibles, como las gasas y las puntas de algodón, se esterilizan en autoclave.
- Anestesiar a la rata en una cámara de inducción con isoflurano al 3% y 1 L/min de oxígeno. Una vez que no haya reflejo pedal para pellizcar los dedos de los pies, mueva a la rata a la esterilla térmica con un termostato en la mesa quirúrgica y coloque una máscara de isoflurano sobre la nariz.
- Controle la frecuencia respiratoria y la temperatura rectal durante toda la cirugía y ajuste el nivel de isoflurano entre 1,5% y 2,5% para mantener la frecuencia respiratoria entre 40 y 62 respiraciones por minuto. Ajuste la configuración de la estera térmica si es necesario, para mantener el rango de temperatura rectal entre 35,9 y 37,5 °C.
- Administrar la premedicación analgésica por vía subcutánea con jeringas de 1 ml con agujas de 25G (carprofeno 5 mg/kg y buprenorfina 0,03 mg/kg por vía subcutánea) antes del inicio de la cirugía.
- Aféitese generosamente alrededor del sitio de la incisión, incluyendo el área a lo largo de la línea media ventral desde la apófisis xifoidea hasta el final de la caja torácica, la cara lumbar de la espalda a lo largo de la línea media dorsal y el lado izquierdo del cuerpo entre la extremidad anterior y la extremidad posterior para permitir el efecto túnel subcutáneo de la matriz.
- Limpie los sitios quirúrgicos con movimientos circulares tres veces con rondas alternas de betadine y alcohol y coloque un paño quirúrgico sobre el animal. Administrar bupivacaína (1-2 mg/kg) por vía subcutánea con una jeringa de 1 ml con aguja de 25G en los sitios de incisión dorsal y ventral.
- Coloque al animal en decúbito ventral y realice una incisión de 2 cm de largo en la espalda donde se anclará el pedestal percutáneo con una hoja de bisturí.
- Coloque a la rata en decúbito dorsal y haga una incisión de 3 cm en la piel a lo largo de la línea media justo debajo de la apófisis xifoidea con una hoja de bisturí. Sostenga la piel cerca del sitio de la incisión y, con unas tijeras de disección, diseccione la capa de piel de la capa muscular alrededor de la incisión.
- Para permitir el efecto túnel subcutáneo de la matriz desde el pedestal hasta el sitio de implantación, coloque al animal sobre su lado derecho, inserte un hemostático desde la incisión ventral y diseccione sin fondo hacia el sitio de la incisión dorsal. Corte el borde de la tapa de una aguja e inserte la guía de electrodos para protegerla durante el transporte (Figura 1B). Con las manos (use guantes estériles), tunelice la guía de electrodos debajo de la piel hacia la incisión ventral.
- Para acceder al esófago y al nervio vago, coloque al animal de nuevo en decúbito dorsal. Haga una incisión de 3 cm en la capa muscular a lo largo de la línea media debajo de la apófisis xifoidea, lo suficientemente grande como para exponer toda la longitud del hígado. Evite dañar el hígado durante este paso.
- Hacer una incisión más pequeña (menos de 1 cm) en la capa muscular lateralmente (el lado izquierdo del animal) hasta la incisión ventral principal. Tunelice la guía de electrodos a través de esta pequeña incisión utilizando la tapa de la aguja utilizada en el paso 2.8 para insertar la guía en la cavidad abdominal.
NOTA: Este paso reduce la tensión aplicada al sitio de la incisión principal y reduce el riesgo de que las suturas se rompan. - Retraiga la piel y las capas musculares para mantener abierta la cavidad abdominal. Asegúrese de mantener los pañuelos húmedos usando puntas de algodón y gasas empapadas en solución salina estéril para manipular el pañuelo.
- Retraiga suavemente el hígado cortando el tejido conectivo que lo rodea con unas tijeras Vannas y colocando un retractor sobre un pequeño trozo de gasa empapado en solución salina para protegerlo. Retraiga suavemente el estómago, para permitir el enderezamiento del esófago y el nervio vago suprayacente, colocando un retractor entre el esófago y el estómago.
NOTA: Los retractores se fabrican redondeando el extremo puntiagudo de los anzuelos. - Después de la exposición de la superficie ventral del esófago, identifique el nervio vago abdominal y sus subramas, incluyendo el nervio hepático, el nervio celíaco y dos ramas gástricas (Figura 1D).
- Cortar el tejido conectivo que sujeta el nervio vago abdominal al esófago con pinzas finas y tijeras Vannas y diseccionar la longitud del nervio desde justo por encima de las ramas hepática y celíaca hacia el diafragma. Asegúrese de no desgarrar, estirar ni pellizcar el nervio. Coloque una guía de electrodos junto al nervio para confirmar que la longitud suficiente del nervio está separada del tejido conectivo para que se ajuste a la matriz.
- Una vez que se haya despejado el tejido conectivo alrededor del nervio, pase las suturas de seda (7-0) en el lado del electrodo del manguito de la matriz debajo del nervio. Abra el manguito de la matriz y coloque el nervio con cuidado en el canal de la matriz.
- Asegúrese de que toda la longitud del nervio se encuentre dentro del canal de la matriz. Ate las suturas alrededor del manguito para cerrarlo de forma segura y asegurarse de que el nervio no se salga del canal. Recorta las suturas.
- Con una sutura de seda 7-0, sure la lengüeta de la matriz en el esófago para asegurar la matriz en su lugar y evitar que se tuerza. Evite dañar las otras ramas del nervio vago o insertar una aguja demasiado profundamente en el músculo liso del esófago.
- Retire suavemente los retractores y asegúrese de que se haya retirado toda la gasa de la cavidad abdominal. Administre 1-2 ml de solución salina estéril tibia con una jeringa de 1 ml en la cavidad abdominal y vuelva a colocar el hígado en la posición correcta.
- Cierre la capa muscular con sutura de seda 3-0 utilizando la técnica de sutura simple corrida, haciendo nudos cuadrados seguros con al menos 3 lanzamientos en ambos extremos. Separe los puntos de sutura muy juntos (aproximadamente 3 mm de distancia) para evitar complicaciones como hernia/protrusión de la apófisis xifoidea.
- Utilice sutura para cerrar la incisión del peritoneo junto con la incisión de la capa muscular, para reducir la posibilidad de adhesión del tejido.
- Con un material de sutura absorbible (Vicryl 4-0), cierre la incisión en la piel. Utilice una técnica de sutura enterrada, como la sutura vertical del colchón enterrada o la sutura dérmica enterrada para evitar que el animal retire la sutura.
- Gire al animal hacia la decúbito ventral y, con unas tijeras, extienda la incisión dorsal a 4-5 cm y diseccione aún más entre el músculo y la capa de piel para que la base del conector percutáneo pueda quedar plana sobre la capa muscular.
- Usando una sutura de seda 3-0, haga de 6 a 8 suturas interrumpidas simples alrededor de la base del conector para asegurarlo a la capa muscular que se encuentra debajo. Cierre la incisión en la piel con sutura de seda 3-0, utilizando la técnica de sutura horizontal de colchón, asegurando nudos cuadrados seguros con al menos 3 lanzamientos.
NOTA: En este paso, se prefieren las suturas de seda trenzada por su facilidad de manejo y su capacidad para crear nudos más seguros en comparación con las suturas de monofilamento. - Al finalizar la cirugía, administrar la solución de Hartmann por vía subcutánea (1 mL/100 g/h). Apague el isoflurano y deje que el animal se recupere sobre una esterilla térmica mientras lleva oxígeno (1,5 L/min). Una vez que la rata esté consciente y completamente móvil, devuélvala a su jaula de origen, colocada en una almohadilla térmica, hasta que se recupere por completo de la anestesia.
- Observe de cerca la recuperación del animal del isoflurano y asegúrese de que el animal pueda acceder a la comida y la bebida. En los dos días siguientes, administrar por vía subcutánea analgesia postquirúrgica (carprofeno 5 mg/kg, al día) para aliviar el dolor. Vigile al animal al menos 2 veces al día y compruebe si hay evidencia de defecación, calidad del pelaje, nivel de actividad y presencia de hinchazón o secreción de las heridas quirúrgicas.
- Registrar el peso del animal, y en el raro caso de que el animal pierda un 10% o más, iniciar un tratamiento intensivo. El tratamiento intensivo incluye la administración subcutánea de líquidos (solución de Hartmann, 2 x 10 ml) cada día, el suministro de alimentos adicionales, como verduras frescas y un suplemento dietético en gel, y la colocación de la mitad de la jaula en una almohadilla térmica con un termostato para obtener calor adicional. Aumentar la frecuencia de monitoreo hasta que el animal se recupere. Continuar con la administración de analgesia (carprofeno 5 mg/kg, SQ, diariamente) si es necesario según una escala de Muecas.
3. Pruebas electrofisiológicas
NOTA: El registro de los potenciales de acción compuestos evocados (ECAP) confirma la colocación adecuada de la guía de electrodos en el nervio vago. Además, el registro de los ECAP utilizando la guía de electrodos descrita anteriormente proporciona una confirmación probable de la activación eléctrica de las fibras C vagales y el VNSsupraumbral 10,15.
- Mida la impedancia de tierra común de los electrodos para evaluar su integridad y detectar cualquier circuito abierto o cortocircuito de cables antes de registrar los ECAP. Los electrodos del nervio vago abdominal que funcionan in vivo deben tener valores de impedancia entre 4 y 20 kΩ.
- Animales de prueba mientras están anestesiados, es decir, inmediatamente después de la cirugía, o despiertos y moviéndose libremente. Realice pruebas despiertos al menos 2-3 días después de la cirugía para permitir que las heridas quirúrgicas de la piel sanen y se estabilicen. Reúna el equipo necesario para las pruebas de impedancia y electrofisiológicas, que incluyen un estimulador hecho a medida, un dispositivo de adquisición de datos, un amplificador diferencial aislado y un software de adquisición y análisis de datos como se indica en la Tabla de Materiales.
- Envuelva al animal en una toalla si es necesario, conecte un cable al conector percutáneo trasero y conecte el otro extremo del cable a un estimulador. Para probar la impedancia de tierra común de los electrodos, aplique pulsos de corriente bifásicos (100 μs por fase y corriente de 107 μA) entre el electrodo de interés y todos los demás electrodos de la matriz.
- Mida el voltaje máximo al final de la primera fase de la forma de onda de voltaje (Vtotal) y calcule la impedancia total (Ztotal) usando la ley de Ohm (Z = voltaje/corriente).
- Conecte un par de electrodos al estimulador y un par de electrodos al equipo de registro y aplique estimulación bipolar para generar ECAPs utilizando el electrodo de referencia del implante VNS colocado debajo de la piel como referencia para el registro diferencial de ECAPs. Realice dos series de grabaciones promediadas a partir de un total de 50 repeticiones utilizando el software de adquisición y análisis de datos.
- Utilice los siguientes ajustes para las mediciones.
Corrientes: 0 a 2 mA en incrementos de 0,1 mA;
Ancho de pulso: 25 - 200 μs;
Intervalo entre fases: 8 - 50 μs;
Velocidad de estimulación: 10 - 30 pulsos/s;
Frecuencia de muestreo: 100 kHz;
Filtro: Paso alto 200 Hz, paso bajo 2000 Hz, ganancia de voltaje 1 x 102. - Utilizando el software de análisis de datos, analice la respuesta ECAP midiendo el voltaje pico a pico de las formas de onda dentro de la ventana de análisis (4 - 10 ms después del estímulo, indicado por el sombreado en la Figura 3A, B). El umbral ECAP se define como la intensidad mínima de la corriente de estímulo que produce una amplitud de respuesta de al menos 0,1 μVpico-pico en ambos conjuntos de registros electrofisiológicos promedio. Una respuesta válida se repetirá para al menos dos niveles actuales por encima del umbral, y no estará presente para al menos dos niveles actuales por debajo del umbral10,15.
4. ENV abdominal crónica en ratas despiertas
NOTA: La VNS abdominal se puede aplicar a animales despiertos una vez que la herida quirúrgica alrededor del conector percutáneo se haya curado y estabilizado. Para reducir cualquier respuesta al estrés y permitir una mejor recopilación de datos, los animales se habitúan al entorno de manipulación y estimulación de los evaluadores, una hora al día durante siete días antes de la cirugía de implantación y el comienzo de la terapia VNS.
- Mida la impedancia de cada electrodo como se describe en el paso 3.4, antes de aplicar cualquier VNS. Asegúrese de que la impedancia de los electrodos de estimulación sea inferior a 20 kΩ.
- Conecte un cable al conector percutáneo posterior y conecte el otro extremo del cable a un estimulador programado para aplicar la estimulación adecuada (p. ej., 27 Hz, 1,6 mA, 200 μs de ancho de pulso con 50 μs de espacio entre fases, 30 s ON, 2,5 min off15), y encienda el estimulador.
NOTA: Aunque a menudo se observa que los animales se quedan dormidos durante la estimulación, si están adecuadamente habituados, use un cable con material exterior protector, como bobinas de acero, siempre que sea posible para evitar que se muerda. - Observe al animal al comienzo de cada sesión de terapia VNS para asegurarse de que no haya ninguna reacción adversa, como un aseo excesivo o un aumento/disminución repentinos del nivel de actividad en sincronía con el momento de la estimulación.
- Supervise cada 30 minutos para comprobar si el cable está torcido o desconectado. Para aplicar la ENV de forma crónica (p. ej., 3 h al día durante 7 días15), repita los pasos 4.1-4.3 al comienzo de cada sesión.
NOTA: El uso de un conmutador puede reducir la posibilidad de que los cables se retuerzan y podría requerir un monitoreo menos frecuente.
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Representative Results
El registro de los potenciales de acción compuestos evocados (ECAP, Figura 3A, B) inmediatamente después de la cirugía es una técnica que se puede utilizar para ayudar a confirmar la correcta colocación del nervio dentro del canal de la matriz, y que la estimulación es eficaz para activar el nervio vago.
En la Figura 3, a las ratas agutí oscuras hembras (8-9 semanas de edad) se les implantó la guía de electrodos VNS. En ratas seleccionadas aleatoriamente para recibir estimulación terapéutica, los ECAP se registraron inmediatamente después de la cirugía (día 0, Figura 3A) y al final de la sesión de terapia con ENV (día 23, Figura 3B). La presencia de ECAP (Figura 3B) indicó que la intensidad de la estimulación estaba por encima del umbral neural y que el nervio se activó con éxito. Los animales en el grupo de tratamiento con ENV fueron excluidos si no se registraron los ECAP, ya que no había garantía de que la estimulación se administrara con éxito15. La latencia de la respuesta neuronal (Figura 3A, B, indicada por una flecha verde) se puede utilizar para evaluar qué clase de fibras se activaron.
En estudios previos, hemos observado que la mayoría de las respuestas neuronales suelen ocurrir entre 4 ms y 10 ms10,15. Dado que la distancia entre los pares de estimulación y registro es de 4,7 mm, la velocidad de conducción aproximada de esta ventana de respuesta es de 0,47 - 1,2 m/s, lo que es consistente con la velocidad de conducción de las fibras C18.
Hay un aumento en el umbral neural entre el día 0 (377 μA, Figura 3A) y el día 23 (1335 μA, Figura 3B), que ocurre con el tiempo probablemente debido a una fibrosis benigna menor que se forma alrededor de la interfaz tejido-electrodo10,15.
La figura 3C indica la configuración de las pruebas experimentales y el posicionamiento del conector posterior, que se mantuvo estable durante el período de pruebas de 3 semanas15.
Figura 1: Sitios para la ENV cervical y la ENV abdominal. (A) La ENV cervical se aplica por encima de las ramas del corazón y las vías respiratorias, y la ENV abdominal se aplica por debajo de estas ramas. (B) La guía de electrodos se inserta en la tapa de una aguja (sin el borde) para protegerla durante el túnel debajo de la piel. (C) La matriz VNS abdominal de rata se implanta y se asegura con suturas (D) por encima de la celiaquía y ramas hepáticas por debajo del diafragma. Abreviaturas: VN = nervio vago, b. = rama. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Matriz VNS de rata. (A) Una matriz VNS de rata se compone de un conector percutáneo y una matriz de electrodos conectados por un cable conductor. (B) Se puede suturar una lengüeta cerca de la guía de electrodos al esófago para ayudar a estabilizar la posición de la matriz. La matriz estándar de nervio vago abdominal de rata viene con dos pares de electrodos (E1 y E2, y E3 y E4). Ambos pares de electrodos se pueden utilizar para la estimulación o el registro. El conector percutáneo se monta en la región de la madera del animal y el cable conductor se tuneliza debajo de la piel en el lado izquierdo del animal. El electrodo de referencia a lo largo del cable conductor se coloca debajo de la piel en el lado izquierdo del animal una vez que se implanta la guía de electrodos. La guía de electrodos se implanta en el nervio vago a lo largo del esófago, por encima del estómago y justo por debajo del diafragma. (C) La longitud adicional del cable conductor en el lado izquierdo del animal debajo de la piel proporciona alivio de tensión. Abreviaturas: E = electrodo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Trazas electrofisiológicas típicas registradas del nervio vago abdominal durante la implantación crónica y de una rata que recibe terapia con ENV. (A) Cada traza electrofisiológica tiene un promedio de 25 repeticiones. Los recuadros sombreados en verde indican la latencia típica de la respuesta de la fibra C en el nervio vago abdominal de la rata, entre 4 ms y 10 ms (utilizando una guía de electrodos con una distancia de 4,7 mm entre los pares de electrodos de estimulación y registro, de centro a centro). Los ECAP están etiquetados con puntas de flecha verdes. (B) Una rata que recibe terapia VNS a través del conector percutáneo en su espalda en la jaula de la casa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Solución de limpieza | Tiempo de sonicación |
| 1. 0.5% pironeg en agua ultrapura | 15 minutos |
| 2. Agua ultrapura | 5 minutos |
| 3. Agua ultrapura | 5 minutos |
| 4. Etanol al 96% | 10 minutos |
| 5. Agua ultrapura | 5 minutos |
| 6. Agua ultrapura | 5 minutos |
Tabla 1: Etapas de la sonicación. La tabla proporciona detalles de la sonicación realizada aquí.
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Discussion
Este método de cirugía de implante de VNS abdominal y estimulación crónica del nervio vago y registro de ECAP se ha utilizado con éxito y ha sido bien tolerado durante 5 semanas en ratas después de la implantación 10,15,16. La retracción del estómago, el hígado y el intestino para obtener una buena visión del esófago y el nervio vago es uno de los pasos clave de la cirugía. Una vez que estos órganos se retraen, el nervio vago se vuelve accesible. La retracción del estómago corre el riesgo de comprometer la respiración, en cuyo caso el retractor se afloja. Además, al cortar el tejido conectivo que rodea el esófago para acceder al nervio vago, se debe tener cuidado para evitar daños en el diafragma, lo que puede provocar una alteración de la presión intratorácica, una supresión respiratoria grave y la muerte del animal durante la cirugía. Se recomienda que el tejido conectivo que rodea el esófago se limpie lo suficiente como para que quepa la guía de electrodos por encima de las ramas hepática y celíaca.
Las posibles complicaciones posquirúrgicas incluyen la adhesión del tejido alrededor del esófago, la hernia y el íleo postoperatorio. La adhesión tisular puede minimizarse mediante la aplicación generosa de solución salina estéril en la cavidad abdominal durante la cirugía y antes de cerrar la cavidad abdominal. La sutura que cierra la capa del peritoneo junto con la capa muscular también debe ayudar a proteger los órganos internos y reducir la adhesión del tejido. Dado que el hígado se magulla fácilmente y la manipulación del intestino puede causar íleo postoperatorio, es importante un manejo mínimo y suave de estos órganos. Por último, especialmente en los animales más pesados, es fundamental que los puntos de sutura se coloquen juntos o que se utilicen suturas interrumpidas al cerrar la cavidad abdominal para evitar la protrusión de la hernia y la apófisis xifoidea.
Como cuidado postoperatorio estándar, los animales deben ser revisados regularmente después de la cirugía para detectar evidencia de defecación, cambio de peso, pelaje, nivel de actividad y presencia de hinchazón o secreción de las heridas quirúrgicas. En raras ocasiones, puede producirse secreción excesiva, enrojecimiento e hinchazón alrededor de las heridas quirúrgicas, lo que sugiere infección. En tales ocasiones, se administran antibióticos como Baytril (0,2 mg/mL, en agua de bebida durante 3-5 días) hasta que la infección se haya resuelto. Mientras que las ratas normales generalmente se recuperan bien de la cirugía, las ratas con condiciones de salud comprometidas (es decir, modelos de enfermedad) pueden requerir más tiempo antes de que las pruebas y la estimulación puedan comenzar después de la cirugía. Los cuidados postoperatorios adecuados (como se resume en el paso 2.26) de estos animales son esenciales para el bienestar de los animales.
Una de las limitaciones de este protocolo es que, si bien el diseño de la guía de electrodos VNS de rata es excelente para registrar una respuesta de fibra C más lenta, el espacio entre los pares de electrodos (4,7 mm) puede no ser adecuado para capturar la actividad de algunos de los tipos de fibra más rápidos. Aunque la longitud total de la matriz está limitada por la longitud disponible del nervio vago subdiafragmático por encima de las ramas hepática y celíaca, estas matrices VNS se pueden comprar con pares de electrodos adicionales. Dichas matrices pueden ser utilizadas para explorar la aplicación de la estimulación de bloqueo que puede manipular la dirección de VNS16,19, ampliando el posible uso de este modelo.
El registro de los ECAP se puede utilizar para evaluar la ubicación de la matriz alrededor del nervio, la calidad de la interfaz del electrodo y la capacidad del dispositivo para activar las fibras vagales. El nervio vago es un nervio autónomo, formado por un 97%-99% de fibras C18,20, siendo el 1%-3% restante de fibras fibras mielinizadas (función desconocida), como lo confirman los estudios de microscopía electrónica de transmisión20. Es probable que las respuestas de la Figura 3 se deban a la actividad evocada eléctricamente del nervio vago, más que a la actividad miogénica, ya que se ajustan a la forma y la forma del potencial de acción compuesto de un nervio periférico21,22. Además, la velocidad de conducción típica de los ECAP del nervio vago abdominal de rata es de 0,47 - 1,2 m/s, lo que es consistente con la velocidad de conducción de las fibras C18. En los estudios piloto iniciales de desarrollo del dispositivo, los registros se validaron en estudios con ratas anestesiadas cortando el nervio vago entre el electrodo estimulante y el electrodo registrador, lo que resultó en la eliminación de cualquier respuesta evocada (datos no mostrados). La guía de electrodos ha sido diseñada para que el nervio vago se asiente dentro de un canal de platino-silicona, aislándolo eléctricamente de las estructuras circundantes (por ejemplo, el esófago). La estimulación y el registro también se realizan utilizando configuraciones bipolares que utilizan electrodos adyacentes, lo que minimiza aún más las oportunidades de propagación de la estimulación y la contaminación del registro. Hemos reportado consistentemente formas de onda similares después de la estimulación eléctrica del nervio vago abdominal en preparaciones anestesiadas y despiertas 10,15,16,19,23, incluyendo estudios en los que los efectos fisiológicos de la estimulación confirmaron la activación del nervio vago 10,15,16. Aunque es imposible excluir la contaminación del registro por actividad miogénica, las respuestas miogénicas suelen distinguirse de la respuesta neuronal debido a su perfil de amplitud de crecimiento rápido y grande24 en contraste con los perfiles de crecimiento graduados y más pequeños observados en nuestros estudios10,15 y en la Figura 3A,B: Día 0: nivel actual 377 μA latencia: 7,24 ms > nivel de corriente 1750 μA: 6,74 ms.
Si bien la activación del nervio vago subdiafragmático, que consiste casi en su totalidad en fibras C20,25, ha demostrado ser eficaz para el tratamiento de modelos preclínicos de enfermedad inflamatoria intestinal10, artritis reumatoide15 y diabetes16, los parámetros abdominales óptimos de la ENV para maximizar su efecto terapéutico no se han explorado completamente14. La investigación adicional sobre este tema sería de gran beneficio, ya que la aplicación de la ENV abdominal para el tratamiento de la enfermedad inflamatoria intestinal se está investigando actualmente en un primer ensayo clínico en humanos. Dado que el efecto antiinflamatorio de la ENV abdominal se considera sistémico26, existe un gran potencial de que esta terapia también sea eficaz para otras afecciones inflamatorias como el lupus eritematoso sistémico27 y la enfermedad renal crónica28.
Nuestros estudios en ratas muestran que la ENV abdominal tiene una ventaja única sobre la ENV cervical en el sentido de que no causa efectos cardíacos o respiratorios fuera del objetivo10. La estimulación de mayor intensidad se puede aplicar durante períodos de tiempo más largos sin comprometer la respiración o la frecuencia cardíaca del animal. Junto con la capacidad de monitorizar la respuesta neuronal evocada confirmando las intensidades de estimulación supraumbral, este método proporciona un gran modelo para estudiar la eficacia de la ENV abdominal para el tratamiento de una variedad de enfermedades. A medida que la aplicación de VNS continúa expandiéndose, se espera que la aplicación de este método de VNS también se expanda.
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Disclosures
Esta investigación se llevó a cabo en ausencia de relaciones comerciales o financieras que pudieran interpretarse como un potencial conflicto de intereses.
Acknowledgments
El desarrollo del implante VNS abdominal de rata fue financiado por la Agencia de Proyectos de Investigación Avanzada de Defensa (DARPA) BTO, bajo los auspicios del Dr. Doug Weber y el Dr. Eric Van Gieson a través del Centro de Sistemas de Guerra Espacial y Naval (Contrato No. N66001-15-2-4060). La investigación reportada en esta publicación fue apoyada por el Fondo de Incubación del Instituto de Biónica. El Bionics Institute agradece el apoyo que reciben del Gobierno de Victoria a través de su Programa de Apoyo a la Infraestructura Operativa. Nos gustaría agradecer al Sr. Owen Burns por el diseño mecánico, al Prof. John B Furness por su experiencia anatómica, al Prof. Robert K Shepherd por su experiencia en interfaz periférica, neuromodulación y grabación, a la Sra. Philippa Kammerer y a la Sra. Amy Morley por la cría y pruebas de animales, a la Sra. Fenella Muntz y al Dr. Peta Grigsby por su asesoramiento sobre el cuidado postoperatorio de los animales, y a la Sra. Jenny Zhou y al equipo de fabricación de electrodos de NeoBionica por la producción de las matrices VNS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% saline | Briemarpak | SC3050 | |
| Baytril | Bayer | ||
| Betadine | Sanofi-Aventis Healthcare | ||
| Buprelieve (Buprenorphine) | Jurox | ||
| Data acquisition device | National Instruments | USB-6210 | |
| DietGel Boost (dietary gel supplement) | ClearH2O | ||
| Dumont tweezer, style 5 | ProSciTech | T05-822 | |
| Dumont tweezer, style N7, self-closing | ProSciTech | EMS72864-D | |
| Elmasonic P sonicator | Elma | ||
| Hartmann's solution | Baxter | AHB2323 | |
| Hemostat | ProSciTech | TS1322-140 | |
| HPMC/PAA Moisturising Eye Gel | Alcon | ||
| Igor Pro-8 software | Wavemetrics, Inc | ||
| Isoflo (Isoflurane) | Zoetis | ||
| Isolated differential amplifier | World Precision Instruments | ISO-80 | |
| Liquid pyroneg | Diversey | HH12291 | cleaning solution |
| Marcaine (Bupivacaine) | Aspen | ||
| Plastic drape | Multigate | 22-203 | |
| Rat vagus nerve implant | Neo-Bionica | ||
| Rimadyl (Carprofen) | Zoetis | ||
| Silk suture 3-0 | Ethicon | ||
| Silk suture 7-0 | Ethicon | ||
| SteriClave autoclave | Cominox | 24S | |
| Sterile disposable surgical gown | Zebravet | DSG-S | |
| Suicide Nickel hooks | Jarvis Walker | ||
| Ultrapure water | Merck Millipre | Milli-Q Direct | |
| Underpads | Zebravet | UP10SM | |
| Vannas scissors | ProSciTech | EMS72933-01 | |
| Vicryl suture 4-0 | Ethicon |
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