Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Curcuminoid-medieret antimikrobiel fotodynamisk terapi på en murin model af oral candidiasis

Published: October 27, 2023 doi: 10.3791/65903
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2
1Department of Dental Materials and Prosthodontics, School of Dentistry, Araraquara, São Paulo State University (UNESP), 2Department of Social Dentistry, School of Dentistry, Araraquara, São Paulo State University (UNESP)

Summary

Denne protokol beskriver anvendelsen af antimikrobiel fotodynamisk terapi (aPDT) i en murinmodel af oral candidiasis. aPDT blev udført under anvendelse af en vandopløselig blanding af curcuminoider og blåt LED-lys.

Abstract

Antimikrobiel fotodynamisk terapi (aPDT) er blevet grundigt undersøgt in vitro, og prækliniske dyremodeller for infektioner er egnede til evaluering af alternative behandlinger forud for kliniske forsøg. Denne undersøgelse beskriver effekten af aPDT i en murin model af oral candidiasis. Fyrre mus blev immunsupprimeret med subkutane injektioner af prednisolon, og deres tunger blev podet ved hjælp af en oral vatpind, der tidligere var gennemblødt i en C. albicans-cellesuspension . Tetracyklin blev administreret via drikkevand i løbet af forsøget. Fem dage efter svampepodning blev mus tilfældigt fordelt i otte grupper; En niende gruppe af ubehandlede uinficerede mus blev inkluderet som en negativ kontrol (n = 5). Tre koncentrationer (20 μM, 40 μM, og 80 μM) af en blanding af curcuminoider blev testet med et blåt LED-lys (89,2 mW/cm2; ~455 nm) og uden lys (henholdsvis C+L+ og C+L- grupper). Lys alene (C-L+), ingen behandling (C-L-) og dyr uden infektion blev vurderet som kontroller. Data blev analyseret ved hjælp af Welchs ANOVA og Games-Howell tests (α = 0,05). Oral candidiasis blev etableret hos alle inficerede dyr og visualiseret makroskopisk gennem tilstedeværelsen af karakteristiske hvide pletter eller pseudomembraner på tungenes dorsum. Histopatologiske sektioner bekræftede en stor tilstedeværelse af gær og filamenter begrænset til det keratiniserede lag af epitelet i C-L-gruppen, og tilstedeværelsen af svampeceller blev visuelt reduceret i billederne opnået fra mus udsat for aPDT med enten 40 μM eller 80 μM curcuminoider. aPDT medieret af 80 μM curcuminoider fremmede en 2,47 log10 reduktion i kolonitællinger sammenlignet med dem i CL-gruppen (p = 0,008). Alle andre grupper viste ingen statistisk signifikant reduktion i antallet af kolonier, herunder fotosensibiliserende (C + L-) eller lys alene (C + ) grupper. Curcuminoid-medieret aPDT reducerede svampebelastningen fra musens tunger.

Introduction

Oral candidiasis (OC) er den vigtigste svampeinfektion i mundhulen; det er forårsaget af overvækst af Candida spp. Prædisponerende faktorer for OC omfatter endokrin dysfunktion, brug af bredspektret antibiotika, radio- og kemoterapi, ernæringsmæssige mangler, xerostomi (lavt spytflow), protesebrug, dårlig hygiejne og især immunsuppression1. Blandt Candida-arter er Candida albicans den mest udbredte og virulente; Det findes som en kommensal art i menneskekroppen og som et opportunistisk patogen. C. albicans har evnen til at ændre sin morfologi fra kommensal gær (blastoporer) til patogene filamenter (hyfer og pseudohyfer)2. De trådformede former, især hyfer, kan invadere værtsepitelet ved endocytose eller aktiv penetration og forårsage infektion3. Andre virulensfaktorer af C. albicans omfatter vedhæftning, biofilmdannelse og sekretion af lipolytiske og hydrolytiske enzymer og toksiner, såsom lipaser, phospholipaser, proteinaser og candidalysin4.

OC-behandlinger involverer brug af svampedræbende midler, især topiske polyener og azoler (nystatin og miconazol)5. De viser dog kun kortsigtet effektivitet, og gentagelse er hyppig. Desuden har overforbruget af svampemidler givet anledning til problemet med udvikling af svampedræbende resistensog spredning 6. Derfor er der behov for alternative terapier, såsom antimikrobiel fotodynamisk terapi (aPDT), som kombinerer en fotosensibilisator (PS) og lys ved en passende bølgelængde (den samme som PS-absorptionen) i nærvær af ilt. PSs er bundet til eller optaget af celler og producerer, når de aktiveres af lys, reaktive iltarter (ROS), der er giftige for sensibiliserede celler7.

I aPDT er en af de anvendte fotosensibilisatorer (PSs) curcumin (CUR), en naturligt forekommende forbindelse ekstraheret fra jordstænglerne i gurkemejeplanten (Curcuma longa L.). Curcumin besidder adskillige terapeutiske egenskaber, herunder antiinflammatoriske, antioxidante, anticancer og antimikrobielle evner 8,9. En tidligere undersøgelse viste, at aPDT ved hjælp af CUR effektivt formindskede C. albicans i en murin model af oral candidiasis uden at forårsage skade på værtens væv10. CUR er den vigtigste curcuminoid ekstraheret fra gurkemeje, men andre polyfenoler, såsom demethoxycurcumin og bis-demethoxycurcumin, findes også i denne plante. Curcuminoid-medieret aPDT viste antibakteriel aktivitet mod biofilm af Staphylococcus aureus dyrket i katetre11. Men så vidt vi ved, forbliver dets svampedræbende aktivitet mod C. albicans uklar. Derfor evaluerede vi i denne undersøgelse aPDT medieret af et curcuminoidsalt mod C. albicans i en murinmodel af OC.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Forskningsprotokollen for brug af mus blev godkendt af den etiske komité for dyrebrug (sagsnummer 05/2008 og 09/2020) på tandlægeskolen, Araraquara, UNESP. C. albicans (ATCC 90028) blev anvendt som referencestamme. Seks uger gamle kvindelige schweiziske mus (n = 45) med et kropsmasseområde på 20-30 g blev brugt til denne undersøgelse. Dyrene blev leveret af São Paulo State University, UNESP, Botucatu.

1. Klargøring af PS og valg af lyskilde til aPDT

  1. Forbered PS i overensstemmelse med specifikationerne for det stof, der skal testes.
    BEMÆRK: I denne undersøgelse blev en vandopløselig blanding af curcuminoider (CUR-baseret vandopløselig saltblanding12) anvendt som PS (se materialetabel og figur 1). Fortyndinger ved 20 μM, 40 μM og 80 μM (henholdsvis 15,6, 29,2 og 58,4 mg/l) blev fremstillet i ultrarent vand umiddelbart før brug og opbevaret ved 5 °C.
  2. Vælg et let udstyr med en passende bølgelængde (den samme som PS-absorptionen), der er i stand til at belyse hele det fotosensibiliserede mål ensartet og samtidigt uden at opvarme vævet.
    BEMÆRK: I denne undersøgelse blev der brugt et håndstykke, der indeholdt en lysemitterende diode (LED, se materialetabel), der blev designet på Instituto de Física de São Carlos (University of São Paulo, São Carlos, SP, Brasilien). Udgangseffekten fra lyset var 89,2 mW/cm2 ved en blå bølgelængde på ca. 455 nm.

2. Fremstilling af C. albicans inokulum

  1. Referencestammen C. albicans (ATCC 90028) opbevares i gær-pepton-glucose (YEPD, se materialetabellen) med 50% glycerol ved -80 °C indtil brug.
  2. Den frosne stamme optøs ved stuetemperatur, fordelen af en 100 μL alikvote på en petriskål med Sabouraud dextroseagar (SDA) med chloramphenicol (se materialetabellen) og inkuberes ved 37 °C i 48 timer.
  3. Overfør fem kolonier til 10 ml gærkvælstofbouillon med 2% glucose (YNBg) medium og voks aerob ved 37 ° C i 16 timer.
  4. Gærkulturen fortyndes i frisk YNBg (1:10) og inkuberes aerobt ved 37 °C, indtil den optiske densitet når den midterste logaritmiske vækstfase.
    BEMÆRK: Standardiser den mikrobielle vækstkurve for hvert laboratorium tidligere. I den nuværende forskning fik kulturer lov til at inkubere i omkring 8 timer, indtil de nåede den midterste log-vækstfase som angivet ved den optiske densitet ved 540 nm (OD540) med en middelværdi på 0,536 ± 0,062 vilkårlige enheder (gennemsnit ± standardafvigelse [SD]).
  5. Kulturen centrifugeres ved 5.000 x g ved stuetemperatur i 5 min., supernatanten kasseres, og pelletpen vaskes to gange med samme volumen sterilt fosfatbufret saltvand (PBS; 0,136 M NaCl, 2 mM KCl, 1 mM KH2PO4, 10 mM Na2HPO4, pH 7,4).
  6. Der anvendes 100 μL alikvoter til udførelse af fire serielle 10 gange fortyndinger i PBS, spred fortyndinger på SDA-plader og inkuber ved 37 °C i 48 timer til kolonitælling. Som standard anvendes svampesuspensioner i koncentrationer på ca. 4,5 × 107 kolonidannende enheder pr. milliliter (CFU / ml)].

3. Induktion af OC hos mus

BEMÆRK: Følgende metode blev tidligere beskrevet af Takakura et al.13 og gengivet af vores gruppe10,14 med nogle ændringer.

  1. Fordeler mus tilfældigt i ni grupper (n = 5), svarende til det samme antal behandlinger (supplerende fil 1).
    BEMÆRK: Mundhulen hos mus skal være negativ for Candida-vækst . Dette skal kontrolleres ved at pode mundhulen og plating prøven på SDA.
  2. Dyrene opbevares i propylenkasser10(højst 5 mus pr. kasse) med træspåner til gulvbelægning i et temperaturstyret vivarium ved 23 ± 2 °C under en lys/mørke-cyklus på 12/12 timer. Det er ikke nødvendigt at foretage nogen specifik berigelse.
  3. Hold mus på ekstruderet musediæt og filtreret vand ad libitum.
  4. Subkutant injiceres det immunsuppressive lægemiddel, prednisolon (100 mg/kg legemsvægt, se materialetabel), for første gang på dag ét til alle medlemmer af gruppe C+L+ 20, C+L+40, C+L+ 80, C+L- 20 μM, C+L-40, C+L-80, C-L+ og C-L- (supplerende fil 1).
    BEMÆRK: Hold mus fra samme gruppe i samme kasse og overvåg dem dagligt for tegn på stress og vægttab. Søg dyrlæge for smertestillende eller ændret mad / vand, hvis stress eller vægttab er noteret.
  5. Fra dag ét og indtil forsøgets afslutning tilvejebringes tetracyklinhydrochlorid i drikkevand ved 0,83 mg/ml13.
  6. Pod musetunger på dag to, herunder gruppe C + L + 20, C + L + 40, C + L + 80, C + L- 20, C + L - 40, C + L - 80, C - L + og C-L - (supplerende fil 1), med C. albicans inokulum. Pod ikke disse mus fra den negative kontrolgruppe (NCtrl).
    1. Bedøvede dyr ved intramuskulær injektion af 10 mg/kg chlorpromazinchlorid (se materialetabel) på hver lårmuskel, før podningen udføres.
    2. Udfør intraoral podning af musene ved at lægge en steril vatpind (en pr. dyr) i blød i en frisklavet (dvs. tilberedt umiddelbart før podning) standardiseret suspension af C. albicans.
    3. Placer bedøvede mus i liggende stilling. Træk forsigtigt tungen ud af munden ved hjælp af en steril tang. Gnid hver musens tunge med en gennemblødt vatpind i 30 s. Overvåg mus, indtil de kommer sig efter sedation.
  7. På dag fem administreres en komplementær subkutan injektion af prednisolon (100 mg/kg legemsvægt) for at opretholde immunsuppressionen.
    BEMÆRK: Denne protokol er tilstrækkelig til at holde infektionen i 7 dage efter intraoral podning. Protokollens tidslinje er vist i figur 2.

4. Antimikrobiel fotodynamisk terapi og genopretning af C. albicans fra orale læsioner

  1. På dag syv, før behandlingen, bedøves dyrene ved hjælp af en intraperitoneal injektion af ketaminhydrochlorid (100 mg / kg legemsvægt) kombineret med xylazin (10 mg / kg legemsvægt) (se materialetabel).
  2. Placer hvert dyr i liggende stilling på en pudeanordning14,15 udstyret med ledninger i rustfrit stål, der kan sløjfes rundt om fortænderne for at holde munden åben.
    BEMÆRK: Isotermiske puder anbefales til opvarmning af musene, mens de er bedøvede, forhindrer hypotermi ved stuetemperatur og undgår dødelighed relateret til anæstesi15. Hvert bedøvet dyr skal overvåges ved manglende tilbagetrækningsrefleks, når tæerne klemmes for at bekræfte anæstesidybden. En vedligeholdelsesdosis ketamin ved 1/3 af den oprindelige dosis (uden xylazin) kan administreres, hvis det er nødvendigt.
  3. Med underkæben og kinderne trukket tilbage, placer forsigtigt tungen uden for munden.
  4. For mus fra C+L+ grupper, pipette 70 μL af PS på tungens dorsum (ved en af de testede koncentrationer). Hold musene i mørke omgivelser i en varighed på 20 minutter som en præ-bestrålingsperiode. Sørg for, at tungen på hvert dyr i løbet af denne tid forbliver placeret inde i mundhulen for at forhindre, at fotosensibilisatoren (PS) indtages.
  5. Efter fotosensibiliseringsperioden skal du trække tungen ud af munden til belysning. Placer LED-enheden på tungens ryg, og lys ved 37,5 J/cm2 (7 min med den aktuelle enhed) (figur 3).
  6. For dyr fra C+L-grupperne pipetteres 70 μL PS ved en af de testede koncentrationer på tungens dorsum, og disse mus holdes i mørke i 27 min.
  7. For dyr fra C-L+ gruppen (behandlet med lys uden forudgående fotosensibilisering), pipette 70 μL steril saltopløsning på tungens dorsum. Hold musene i mørke i 20 minutter og belys derefter deres tunger ved 37,5 J/cm2 (7 min med den nuværende enhed).
  8. For mus fra C-L-gruppen (hverken behandlet med PS eller med lys), pipette 70 μL steril saltopløsning på tungens dorsum og hold dem i mørke i 27 min.
  9. Gendan C. albicans fra tungerne på alle mus umiddelbart efter behandlingen. Svab tungens dorsum i 1 min med en steril vatpind.
  10. Hver prøvepind anbringes i et rør indeholdende 1 ml sterilt saltvand og hvirvel i 1 minut for at resuspendere de mikrobielle celler.
  11. Der udføres straks 10 gange serielle fortyndinger i PBS og plader 25 μL alikvoter over SDA-plader i to eksemplarer. Pladerne inkuberes aerob ved 37 °C i 48 timer.
  12. Efter 48 timer skal du bruge en digital kolonitæller (se materialetabel) til at bestemme antallet af gærkolonier. Beregn C. albicans belastning (CFU / ml) for hvert dyr.
  13. Transformér CFU/ml-værdier til log10 , og analysér korrekt i henhold til eksperimentets design og dataantagelser.
    BEMÆRK: I denne undersøgelse blev Welchs envejs ANOVA og Games-Howell post-hoc test (α = 0,05)16 anvendt.

5. Histopatologiske analyser

  1. På dag otte bedøves mus med ketamin ved 100 mg / kg kombineret med xylazin ved 10 mg / kg via intraperitonial injektion og aflives dem med en overdosis ketamin (200 mg / kg administreret via intraperiotonial). Bekræft døden ved at kontrollere for fravær af åndedrætsbevægelse (apnø) og fravær af hjerteslag (asystol).
  2. Klem forsigtigt tungen og træk den ud af dyrets mund. Brug en manuel skalpel til at lave et snit før de omkredse papiller for kirurgisk at fjerne hele tungen uden at forårsage skader på de forreste og centrale regioner.
  3. Fastgør tungen i 10% bufret formalin (pH 7,2-7,4) i 24 timer og vask den i rindende vand i 2 timer.
  4. Fortsæt med inkluderingen i paraffinprocessen: dehydrering, afklaring og imprægnering 10,14.
  5. Skær serielle sektioner (5 μm tykke) ved hjælp af et mikrotom, og fastgør derefter sektionerne på glasglas. Fortsæt med at plette disse sektioner ved hjælp af periodisk syre-Schiff og hæmatoxylin (PAS-H) til histopatologisk undersøgelse og identifikation af svampe gennem observation under et lysmikroskop.
  6. Spørg en patolog, helst blind for de undersøgte grupper, for at undersøge vævsreaktionen på grund af C. albicans infektion.
  7. Beskrive vævets histologiske egenskaber (epitel og bindevæv), især lokale inflammatoriske reaktioner af varierende intensitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Murinmodellen af OC viste typiske hvide pletter og pseudomembraner på tungen hos alle inficerede mus (figur 4A). C. albicans genvundet fra C-L- dyr bekræftede vævskolonisering af denne mikroorganisme (værdier varierede fra 1,62 x 104 til 4,80 x 105 CFU/ml). Som forventet viste dyrene fra NCtr-gruppen ingen vævsændringer eller kolonivækst efter prøveudtagning (figur 4B).

aPDT nedsatte levedygtigheden af C. albicans , når curcuminoider blev anvendt ved 80 μM til fotosensibilisering (figur 5). Den gennemsnitlige log10-reduktion , der blev opnået med 80 μM PS-medieret aPDT, var 2,47 sammenlignet med reduktionen i C-L-gruppen (p = 0,008).

Antallet af C. albicans-kolonier genvundet fra musetunger var ikke signifikant forskelligt blandt mus behandlet med curcuminoider uden belysning (C + L-grupper), mus behandlet med lys, men ikke tidligere fotosensibiliseret (C-L + -grupper) og ubehandlede mus (C-L-gruppe) (p ≥ 0,210).

De histologiske træk ved tungen hos uinficerede dyr (NCtr) viste normalt/sundt væv, herunder intakt lamina propria, basalmembran og filiforme papiller (figur 6A). I modsætning hertil var det tydeligt, at gær og filamenter var til stede i det keratiniserede lag af epitelet, selvom der ikke var nogen infiltration af svampe, når man undersøgte de histopatologiske billeder af musenes tunger fra C-L-gruppen. I det underliggende bindevæv blev der observeret et mildt inflammatorisk respons, primært medieret af mononukleære celler, og filiforme papiller var bemærkelsesværdigt fraværende (figur 6B). Den histologiske analyse af musenes tunger i både C+L- og C-L+-grupperne viste lignende egenskaber. I modsætning hertil afslørede tungesektionerne hos mus behandlet med 80 μM curcuminoidmedieret aPDT et reduceret antal svampeceller, hovedsageligt begrænset til det keratiniserede lag af epitelet (figur 6C).

Figure 1
Figur 1: Kemisk struktur af fotosensibilisatoren. Den kemiske struktur af den vandopløselige saltblanding, der anvendes som fotosensibilisator, bestående af 53,4% naturligt curcumin og 46,6% andre curcuminoider (demethoxycurcumin og bis-demethoxycurcumin). Den endelige gennemsnitlige molekylvægt er 730,32 g / mol. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Protokoltidslinje for murine model af oral candidiasis og aPDT. En tidslinje, der skitserer protokollen for murine model af oral candidiasis og antimikrobiel fotodynamisk terapi (aPDT). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Belysning af mustunger efter fotosensibilisering. Efter fotosensibilisering (inkubation af det inficerede væv med fotosensibilisatoren) blev tungerne oplyst ved 37,5 J / cm2 ved hjælp af et blåt (~ 455 nm) LED-lys. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Hvide læsioner i murine oral candidiasis model. (A) Repræsentative billeder, der viser de hvide læsioner, der er observeret i murine modellen for oral candidiasis. (B) Negativ (ikke-inficeret) kontrol. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Candida albicans genvundet fra musens tunger. Data repræsenterer gennemsnitsværdier ± standardafvigelse af log10 (CFU/ml) fra behandlingsgrupperne. Welchs envejs ANOVA indikerede, at virkningerne af behandlingerne var statistisk signifikant forskellige blandt grupperne (p < 0,001). Forskellige små bogstaver (a, b, c) ved siden af middelværdierne indikerer statistisk signifikante forskelle ifølge Games-Howell-testen (s≤ 0,030). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6: Repræsentative billeder af histologiske sektioner af musetunger. Histologiske sektioner af musetunger blev farvet med PAS-H, og billederne blev taget ved 200x. (A) Negative kontrolmus uden induceret oral candidiasis, fotosensibilisering og belysning (NCtr-gruppe). (B) Mus med induceret oral candidiasis, hverken fotosensibiliseret eller udsat for LED-belysning (CL-gruppe). C) Dyr med induceret oral candidiasis, eksponeret for 80 μM curcuminoider og 37,5 J/cm2 LED-belysning (C+L+80-gruppe). Skalabjælker = 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende fil 1: Eksperimentelle grupper. En liste over de eksperimentelle grupper, der anvendes i denne undersøgelse. Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

C. albicans har været forbundet med orale og spiserørsinfektioner hos personer med immunkompromitteret tilstand, diabetes mellitus, langvarig brug af antibiotika og dårlig mundhygiejne 1,3. Undersøgelsen af infektionssygdomme hos mennesker kræver både in vitro- og in vivo-undersøgelser, før kliniske forsøg kan udformes sikkert og præcist. Denne undersøgelse beskriver en metode til etablering af en murinmodel af OC, som kan bruges til at evaluere patogenesen af orale infektioner af C. albicans og effekten af svampedræbende tilgange 15,16,17,18,19.

Den murinmodel af OC, der anvendes her, blev etableret med succes, hvilket fremgår af den betydelige svampebelastningsgenopretning fra læsioner såvel som af de karakteristiske infektionstræk, der blev observeret i de makroskopiske og histopatologiske analyser af tungen hos inficerede mus. Mange undersøgelser har brugt lignende murinmodeller af OC. I sådanne modeller immunsupprimeres hunmus og podes med C. albicans, hvilket resulterer i læsioner på tungen 10,13,14,15,20,21. Immunosuppression med prednisolon, et glukokortikoid, hæmmer neutrofilers aktivitet mod C. albicans22. I dette studie blev hunmus immunsupprimeret med to subkutane injektioner af prednisolon, en dag før og tre dage efter infektion med C. albicans13. Derudover forårsagede administrationen af tetracyklin i drikkevand i løbet af eksperimentet oral dysbiose ved at forstyrre orale bakterier og hjælpe C. albicans til at trives23,24. Desuden forhindrede sedationen forårsaget af den intramuskulære injektion af chlorpromazinchlorid dyrene i at drikke vand og spise umiddelbart efter podning. Således forblev svampeceller i kontakt med tungens dorsum i længere tid, hvilket muliggjorde udviklingen af kimrør og overgangen fra gær til filamenter (hyfer og pseudohyfer), som er de patogene morfologier af C. albicans, der kan invadere det menneskelige epitel. Teichert et al.25 anvendte en immundefektprotokol til at inducere OC hos mus og genvandt kun 2 x 102 CFU/ml C. albicans.

Mens Totti et al.26 udnyttede sialoadenektomiserede mus og gennemførte fire separate podninger med en C. albicans suspension, er det bemærkelsesværdigt, at infektionen i deres tilfælde ikke blev opretholdt hos de fleste dyr i løbet af eksperimentet. I modsætning hertil blev podningen med svampeceller i denne undersøgelse kun udført én gang, og det resulterede i genopretning af 104 CFU / ml C. albicans fra mundhulen. Denne undersøgelse anvendte murine model af candidiasis beskrevet af Takakura et al.13, som udførte oral podning med en klinisk stamme isoleret fra en patient med kutan candidiasis (106 CFU / ml). Tre til syv dage efter podningen blev 105-10 6 CFU/ml C. albicans genfundet fra mundhulen hos mus13. Forskellene mellem metoden for Takakura et al.13 og denne undersøgelse inkluderer brugen af forskellige svampekoncentrationer i podestoffet (denne undersøgelse anvendte 107 CFU / ml C. albicans) og forskellige C. albicans-stammer til oral podning (referencestammen ATCC 90028 blev brugt her). Carmello et al.20 anvendte en lignende protokol, som involverede anvendelse af immunsupprimerede dyr. Imidlertid administrerede de to yderligere subkutane injektioner af prednisolon til dyrene på dag 1, 5, 9 og 13 i forsøget. Deres undersøgelse afslørede en positiv sammenhæng mellem de scorer, der blev tildelt de orale læsioner hos de inficerede dyr og antallet af CFU / ml over en periode fra 5 til 16 dage efter infektion. Det har været veletableret i tidligere forskning, at det er afgørende at nøje overvåge dyr under anæstesi for at forhindre hypotermi. Yderligere vedligeholdelsesdoser af ketamin bør administreres med diskretion, kun når det er nødvendigt27.

Med hensyn til effektiviteten af aPDT-applikation viste resultaterne, at bestråling af tunger, der tidligere var behandlet med en 80 μM curcuminoidsaltblanding, forårsagede en signifikant reduktion (2,47 log10) i levedygtigheden af C. albicans. Histologiske analyser afslørede, at sektioner fra tunger behandlet med 80 μM curcuminoid-medieret aPDT viste et reduceret antal svampeceller, som var begrænset til det keratiniserede lag, og et lavt inflammatorisk respons. Det er værd at understrege, at der blev påvist et inflammatorisk respons hos alle mus, der var inficeret med C. albicans. Denne observation indebærer, at inflammationen observeret i alle aPDT-grupperne kan være forbundet med Candida-infektion snarere end at blive tilskrevet aPDT, et konsistent fund i overensstemmelse med vores tidligere undersøgelser 10,13,14,15.

Tidligere undersøgelser brugte CUR, methylenblåt og fotodithazin (PDZ) som PSs og opnåede lovende resultater 10,20,24,25,27. I en lignende undersøgelse10, en kombineret eksponering for CUR og LED-lys forårsagede en signifikant reduktion i levedygtigheden af C. albicans; brugen af 80 μM CUR og lys reducerede imidlertid svampelevedygtigheden med 4,0 log10. Dovigo et al.10 brugte kun CUR som PS, mens vi brugte et salt indeholdende de tre vigtigste curcuminoider fra C. longa. Når CUR (260 μM) og LED-lys blev brugt i fem på hinanden følgende dage til behandling af oral candidiasis hos mus, observerede forfatterne en reduktion på 1,11 log10 i svampelevedygtighed21. Når methylenblåt blev anvendt som PS ved 450 μg/ml og 500 μg/ml, udryddede aPDT fuldstændigt C. albicans fra mundhulen hos mus25. Når aPDT blev medieret af PDZ (100 mg/l), blev der desuden observeret en reduktion på 3,0 log10 og fuldstændig remission af orale læsioner20. Derudover øgede aPDT TNF-α-ekspressionen sammenlignet med ekspressionen i den ubehandlede gruppe20. I en undersøgelse, hvor der blev anvendt en fluconazolresistent stamme, fremmede aPDT medieret af PDZ (200 mg/l) en reduktion svarende til 1,3 log1027. Desuden resulterede kombinationen af aPDT med nystatin i en betydelig reduktion i svampelevedygtighed, svarende til et fald på 2,6 log10 sammen med bemærkelsesværdige forbedringer i orale læsioner og en reduktion i det inflammatoriske respons27. Samlet set giver disse undersøgelser overbevisende beviser for effektiviteten af aPDT til at reducere svampebyrden inden for murinmodellen for oral candidiasis, hvilket understreger dets potentiale som en klinisk behandlingsmulighed på grund af dets antimikrobielle effektivitet uden at forårsage skade på værtsvæv.

Afslutningsvis er murine model af OC anvendt i denne undersøgelse egnet til at efterligne infektion og evaluere aPDT effektivitet. Som en begrænsning anvendte OC-modellen her kun en referencestamme af C. albicans (andre stammer, kliniske isolater og ikke-albicans Candida-arter blev ikke evalueret). Desuden kan den kortikosteroidinducerede immunsuppression, der anvendes til mus til at udvikle oral infektion, muligvis ikke efterligne andre immundefekttilstande, såsom på grund af HIV-infektion. Der kan også være forskelle i værtsbetingelserne for udvikling af OC, såsom den orale mikrobiota hos mus og mennesker. Denne protokol bør udvides yderligere til at evaluere blandede biofilm dannet af mere end én art eller af forskellige stammer fra samme art. Desuden er det de sværeste trin i protokollen at holde mus tilstrækkeligt bedøvet og forhindre hypotermi, samtidig med at man undgår anæstesirelateret dødelighed.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Forfatterne takker den økonomiske støtte fra FAPESP (São Paulo Research Foundation, procesnummer FAPESP # 2013/07276-1 (CePID CePOF) og 2008/00601-6. Vi takker også Dr. Ana Paula Silva for at give oplysningerne om det CUR-baserede vandopløselige salt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C. albicans ATCC (Rockville, Md, USA) 90028 Used to prepare the Candida inoculum
Centrifuge  Eppendorf Centrifuge 5804/5804R,B. Braun, Melsungen, Hesse, Germany 022628146 (NA) Used to prepare the Candida inoculum
Chlorpromazine chloride 2 mg/mL Compounding pharmacy, Araraquara, SP, Brazil  -   Used to sedate animals during candida inoculation
Curcumin-based water-soluble salt PDTPharma, Cravinhos, Brazil  -  Consisting of 53.4% of natural curcumin, and  46.6% of other curcuminoids (demethoxycurcumin and bis-demethoxycurcumin). Prepared in water and N-MethylD-Glucamine (final average molecular weight of 730.32 g.mol−1)
Digital colony counter CP 600 Plus, Phoenix Ind Com Equipamentos Científicos Ltda, Araraquara, SP, Brazil  -  Used to count colonies on agar plates
Extruded mouse chow Benelab food, Industry Qualy Animal Nutrition and Commerce Ltda., Lindóia, São Paulo State, Brazil.  - Used for the feeding of the mice
Ketamine Hydrochloride 10% Ketamina Agener, União Química Farmacêutica Nacional S/A, Embu-Guaçu, SP, Brazil  -  Used to anesthetize animals before  treatments and for euthanasia
Light-emitting diode handpiece (prototype) Instituto de Física de São Carlos, University of São Paulo, São Carlos, SP, Brazil  -  Fabricated with LXHL-PR09, Luxeon III Emitter, Lumileds Lighting, San Jose, California, USA
Methylprednisolone acetate 40 mg DEPO-MEDROL, Pfizer, New York  -  Used as an immunosuppressant
Microtome Leica Microsystems, Bannockburn, IL, USA SM2500 Used to cut the serial sections of the tongues
Propylene boxes (cages housing) H13 x L20 x D30 cm Bonther Equipaments, Ribeirão Preto, SP, Brazil  -  Used to keep the animals throughout  the experimental period
Sabouraud Dextrose Agar with Chloramphenicol HiMedia, Mumbai, India MM1067-500G Culture medium for yeast growth (agar)
Spectrophotometer Spectrophotometer Kasvi K37-VIS , São José dos Pinhais, PR, Brazil K37-VIS  Used to standardize the inoculum concentration
Tetracycline hydrochloride  Compounding pharmacy, Araraquara, SP, Brazil  -  Antibiotic given to induce oral dysbiosis
Wood shavings J.R. Wood Shavings, Comerce of Sawdust Ltda., Conchal, São Paulo State, Brazil  - Used for floor covering inside the housing boxes
Xylazine 2% Calmiun, União Química Farmacêutica Nacional S/A, Embu-Guaçu, SP, Brazil  -  Used in combination with ketamine for anesthesia
Yeast Nitrogen Broth  Difco, InterLab, Detroit, MI, USA DF0919-07-3  Culture medium for yeast growth (broth)
Yeast Peptone Dextrose Broth NutriSelect Basic, Sigma Aldrich Y1375 Culture medium for maintaining the strains at -80°C and grow

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vila, T., Sultan, A. S., Montelongo-Jauregui, D., Jabra-Rizk, M. A. Oral candidiasis: a disease of opportunity. Journal of fungi (Basel, Switzerland). 6 (1), 15 (2020).
  2. Sudbery, P. E. Growth of Candida albicans hyphae. Nature Reviews Microbiology. 9 (10), 737-748 (2011).
  3. Moyes, D. L., Richardson, J. P., Naglik, J. R. Candida albicans-epithelial interactions and pathogenicity mechanisms: scratching the surface. Virulence. 6 (4), 338-346 (2015).
  4. Lopes, J. P., Lionakis, M. S. Pathogenesis and virulence of Candida albicans. Virulence. 13 (1), 89-121 (2022).
  5. Quindós, G., et al. Therapeutic tools for oral candidiasis: Current and new antifungal drugs. Medicina oral, patologia oral y cirugia buccal. 24 (2), e172-e180 (2019).
  6. Nishimoto, A. T., Sharma, C., Rogers, P. D. Molecular and genetic basis of azole antifungal resistance in the opportunistic pathogenic fungus Candida albicans. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 75 (2), 257-270 (2020).
  7. Gholami, L., Shahabi, S., Jazaeri, M., Hadilou, M., Fekrazad, R. Clinical applications of antimicrobial photodynamic therapy in dentistry. Frontiers in Microbiology. 13, 1020995 (2013).
  8. Trigo-Gutierrez, J. K., Vega-Chacón, Y., Soares, A. B., Mima, E. G. O. Antimicrobial activity of curcumin in nanoformulations: a comprehensive review. International Journal of Molecular Sciences. 22 (13), 7130 (2021).
  9. Santezi, C., Reina, B. D., Dovigo, L. N. Curcumin-mediated Photodynamic Therapy for the treatment of oral infections-A review. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 21, 409-415 (2018).
  10. Dovigo, L. N., et al. Curcumin-mediated photodynamic inactivation of Candida albicans in a murine model of oral candidiasis. Medical Mycology. 51 (3), 243-251 (2013).
  11. Zangirolami, A. C., Carbinatto, F., Filho, J. D. V., Bagnato, V. S., Blanco, K. C. Impact of light-activated curcumin and curcuminoids films for catheters decontamination. Colloids and SurfacesB: Biointerfaces. 213, 112386 (2022).
  12. Santezi, C., Tanomaru, J. M., Bagnato, V. S., Júnior, O. B., Dovigo, L. N. Potential of curcumin-mediated photodynamic inactivation to reduce oral colonization. Photodiagnosis Photodynamic Therapy. 15, 46-52 (2016).
  13. Takakura, N., et al. A novel murine model of oral candidiasis with local symptoms characteristic of oral thrush. Microbiology and immunology. 47 (5), 321-326 (2003).
  14. Mima, E. G., et al. Susceptibility of Candida albicans to photodynamic therapy in a murine model of oral candidosis. OralSurgery, Oral Medicine, Oral Pathology, Oral Radiology and Endodontology. 109, 392-401 (2010).
  15. Solis, N. V., Filler, S. G. Mouse model of oropharyngeal candidiasis. Nature Protocol. 7 (4), 637-642 (2012).
  16. Marôco, J. Análise Estatística com o SPSS Statistics 25. , ReportNumber 7th ed, Lisboa, Portugal. (2018).
  17. Naglik, J. R., Fidel, P. L. Jr, Odds, F. C. Animal models of mucosal Candida infection. FEMS Microbiology Letters. 283 (2), 129-139 (2008).
  18. Samaranayake, Y. H., Samaranayake, L. P. Experimental oral candidiasis in animal models. Clinical Microbiology Reviews. 14, 398-429 (2001).
  19. Chamilos, G., Lionakis, M. S., Lewis, R. E., Kontoyiannis, D. P. Role of mini-host models in the study of medically important fungi. The Lancet Infectious Diseases. 7, 42-55 (2007).
  20. Carmello, J. C., et al. Treatment of oral candidiasis using Photodithazine- mediated photodynamic therapy in vivo. PLoS One. 11 (6), e0156947 (2016).
  21. Sakima, V. T., et al. Antimicrobial photodynamic therapy mediated by curcumin-loaded polymeric nanoparticles in a murine model of oral candidiasis. Molecules. 23 (8), 2075 (2018).
  22. Abe, S., et al. A glucocorticoid antagonist, mifepristone affects anti-Candida activity of murine neutrophils in the presence of prednisolone in vitro and experimental candidiasis of prednisolone-treated mice in vivo. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 13 (4), 311-316 (1996).
  23. Jones, J. H., Russell, C., Young, C., Owen, D. Tetracycline and the colonization and infection of the mouths of germ-free and conventionalized rats with Candida albicans. Journal Antimicrobial Chemotherapy. 2 (3), 247-253 (1976).
  24. Russell, C., Jones, J. H. Effects of oral inoculation of Candida albicans in tetracycline-treated rats. Journal of Medical Microbiology. 6 (3), 275-279 (1973).
  25. Teichert, M. C., Jones, J. W., Usacheva, M. N., Biel, M. A. Treatment of oral candidiasis with methylene blue- mediated photodynamic therapy in an immunodeficient murine model. OralSurgery, Medicine, Pathology, Radiology and Endodontology. 93, 155-160 (2002).
  26. Totti, M. G. A., Santos, E. B., Almeida, O. P., Koga-Ito, C. Y., Jorge, A. O. C. Oral candidosis by Candida albicans in normal and xerostomic mice. Brazilian Oral Research. 18, 202-207 (2004).
  27. Hidalgo, K. J. R., et al. Antimicrobial photodynamic therapy in combination with nystatin in the treatment of experimental oral candidiasis induced by Candida albicans resistant to fluconazole. Pharmaceuticals (Basel). 12 (3), E140 (2019).

Tags

Curcuminoid-medieret Antimikrobiel fotodynamisk terapi Murin model Oral candidiasis APDT In vitro Prækliniske dyremodeller Alternative behandlinger Kliniske forsøg Effekt Immunsupprimerede mus Subkutane injektioner Prednisolon C. albicans cellesuspension tetracyklin koncentrationer af curcuminoider blå LED-lys negativ kontrol Welchs ANOVA Games-Howell tests hvide pletter pseudomembraner histopatologiske sektioner
Curcuminoid-medieret antimikrobiel fotodynamisk terapi på en murin model af oral candidiasis
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mima, E. G. d. O., Pavarina, A. C.,… More

Mima, E. G. d. O., Pavarina, A. C., Jordão, C. C., Vieira, S. M., Dovigo, L. N. Curcuminoid-Mediated Antimicrobial Photodynamic Therapy on a Murine Model of Oral Candidiasis. J. Vis. Exp. (200), e65903, doi:10.3791/65903 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter