माउस प्राथमिक लेंस उपकला सेल संस्कृति का अनुकूलन: Trypsinization के लिए एक व्यापक गाइड
Summary
यह पांडुलिपि प्राथमिक लेंस उपकला कोशिकाओं (एलईसी) के संवर्धन के लिए एक विस्तृत वीडियो प्रोटोकॉल की रूपरेखा तैयार करती है, जिसका उद्देश्य मोतियाबिंद और पीछे कैप्सूल ओपेसिफिकेशन (पीसीओ) में प्रजनन क्षमता और सहायता अनुसंधान में सुधार करना है। यह लेंस विच्छेदन, एलईसी अलगाव और सत्यापन पर चरण-दर-चरण निर्देश प्रदान करता है, विशेष रूप से क्षेत्र में नए लोगों के लिए एक मूल्यवान मार्गदर्शक के रूप में कार्य करता है।
Abstract
लेंस उपकला कोशिकाएं (एलईसी) होमियोस्टैसिस और लेंस के सामान्य कार्य को बनाए रखने में कई महत्वपूर्ण भूमिका निभाती हैं। एलईसी लेंस वृद्धि, विकास, आकार और पारदर्शिता निर्धारित करते हैं। इसके विपरीत, बेकार एलईसी मोतियाबिंद गठन और पीछे कैप्सूल अपारदर्शिता (पीसीओ) का कारण बन सकता है। नतीजतन, लेंस विकास, जैव रसायन, मोतियाबिंद चिकित्सा विज्ञान और पीसीओ की रोकथाम में लगे शोधकर्ताओं के लिए एक मजबूत प्राथमिक एलईसी संस्कृति प्रणाली स्थापित करना महत्वपूर्ण है। हालांकि, प्राथमिक एलईसी की खेती ने उनकी सीमित उपलब्धता, धीमी प्रसार दर और नाजुक प्रकृति के कारण लंबे समय से चुनौतियां पेश की हैं।
यह अध्ययन प्राथमिक एलईसी संस्कृति के लिए एक व्यापक प्रोटोकॉल पेश करके इन बाधाओं को संबोधित करता है। प्रोटोकॉल में आवश्यक कदम शामिल हैं जैसे कि एक अनुकूलित संस्कृति माध्यम का निर्माण, लेंस कैप्सूल का सटीक अलगाव, ट्रिप्सिनाइजेशन तकनीक, उपसंस्कृति प्रक्रियाएं, फसल प्रोटोकॉल और भंडारण और शिपमेंट के लिए दिशानिर्देश। संस्कृति प्रक्रिया के दौरान, सेल आकृति विज्ञान चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर निगरानी की गई थी.
सुसंस्कृत एलईसी की प्रामाणिकता की पुष्टि करने के लिए, महत्वपूर्ण लेंस प्रोटीन, अर्थात् αA- और γ-क्रिस्टलीय की उपस्थिति और उपकोशिकीय वितरण का पता लगाने के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख आयोजित किए गए थे। यह विस्तृत प्रोटोकॉल शोधकर्ताओं को प्राथमिक एलईसी की खेती और विशेषता के लिए एक मूल्यवान संसाधन से लैस करता है, लेंस जीव विज्ञान की हमारी समझ में प्रगति और लेंस से संबंधित विकारों के लिए चिकित्सीय रणनीतियों के विकास को सक्षम करता है।
Introduction
आंख का लेंस रेटिना पर आने वाली रोशनी को केंद्रित करके दृष्टि में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। इसमें विशेष कोशिकाओं से बना एक पारदर्शी, अवशिष्ट संरचना होती है, जिनमें से लेंस उपकला कोशिकाएं (एलईसी) प्रमुख खिलाड़ी होती हैं। एलईसी लेंस के पूर्वकाल सतह पर स्थित हैं और इसकी पारदर्शिता बनाए रखने, पानी के संतुलन को विनियमित करने, और लेंस विकास औरविकास 1,2 में भाग लेने के लिए जिम्मेदार हैं. एलईसी लेंस के पूर्वकाल भाग में स्थित एक अद्वितीय प्रकार की कोशिकाएं हैं, जो जीवन भर लेंस फाइबर का लगातार उत्पादन करके लेंस स्पष्टता और कार्य को बनाए रखने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती हैं।
मोतियाबिंद लेंस के प्रगतिशील बादल की विशेषता है, विरूपण और प्रकाश के प्रकीर्णन में जिसके परिणामस्वरूप, समझौता दृष्टि 3,4 के लिए अग्रणी. मोतियाबिंद गठन अंतर्निहित सटीक तंत्र जटिल और बहुक्रियाशील हैं, जिसमें यूवी विकिरण, ऑक्सीडेटिव क्षति और ग्लाइकेशन 5,6जैसे विभिन्न सेलुलर और आणविक प्रक्रियाएं शामिल हैं। एलईसी मोतियाबिंद के विकास में महत्वपूर्ण योगदान करने के लिए पाया गया है, जिससे उन्हेंअनुसंधान 1,2,7,8,9का एक महत्वपूर्ण केंद्र बना दिया गया है।
इसके अलावा, नेत्र विज्ञान में सबसे अधिक दबाव वाले मुद्दों में से एक आज पोस्टीरियर कैप्सूल ओपेसिफिकेशन (पीसीओ) की अपेक्षाकृत उच्च घटना है, जिसे माध्यमिक मोतियाबिंद भी कहा जाता है। पीसीओ मोतियाबिंद सर्जरी के बाद सबसे आम जटिलता बनी हुई है, जो 20-40% वयस्क रोगियों और 100% बच्चों को 5 साल के भीतर सर्जरी के बादप्रभावित करती है। पीसीओ मुख्य रूप से अवशिष्ट एलईसी के कारण होता है जो मोतियाबिंद निष्कर्षण के बाद कैप्सुलर बैग में रहते हैं। इन कोशिकाओं को एक बहुआयामी पैथोफिजियोलॉजिकल परिवर्तन से गुजरना पड़ता है जिसमें न केवल उपकला-से-मेसेनकाइमल संक्रमण (ईएमटी) बल्कि लेंस फाइबर के लिए एलईसी का भेदभाव भी होता है, जिसके परिणामस्वरूप सेल आबादी होती है जो एलईसी, फाइबर और मायोफिब्रोब्लास्ट्स 11,12,13का मिश्रण होती है। रूपांतरित कोशिकाएं पीछे के लेंस कैप्सूल में फैलती हैं और पलायन करती हैं, जिससे दृश्य हानि होती है। संस्कृति मॉडल में एलईसी के व्यवहार और नियंत्रण तंत्र को समझना पीसीओ की रोकथाम और प्रबंधन में मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है। इसलिए, एलईसी संवर्धन का यह प्रोटोकॉल नेत्र शोधकर्ताओं के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण प्रस्तुत करता है जिसका उद्देश्य इस प्रचलित पश्चात जटिलता का अध्ययन, समझना और अंततः मुकाबला करना है।
एलईसी जीव विज्ञान की पेचीदगियों और मोतियाबिंद गठन और पीसीओ में इसकी भूमिका को जानने के लिए, इन विट्रो प्राथमिक सेल संस्कृति प्रणालियों में मजबूत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य स्थापित करना आवश्यक है। प्राथमिक एलईसी संस्कृति शोधकर्ताओं को एलईसी के कार्यों, सिग्नलिंग और आणविक विशेषताओं का अध्ययन करने के लिए एक नियंत्रित वातावरण प्रदान करती है। इसके अलावा, यह सेलुलर प्रक्रियाओं की जांच और विभिन्न प्रयोगात्मक स्थितियों के प्रभावों की अनुमति देता है, लेंस शरीर विज्ञान और विकृति विज्ञान में मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान करता है।
पूर्व अनुसंधान ने एलईसी संस्कृति तकनीकों 14,15,16,17,18,19,20की हमारी समझ को समृद्ध किया है। यद्यपि इन अध्ययनों ने विभिन्न पद्धतियों को नियोजित किया है और एलईसी व्यवहार और विशेषताओं पर महत्वपूर्ण निष्कर्ष निकाले हैं, एलईसी संवर्धन के लिए एक व्यापक और सुलभ वीडियो रिकॉर्डिंग प्रोटोकॉल वर्तमान साहित्य में अनुपस्थित है। यह सीमा नौसिखिए शोधकर्ताओं की तकनीकों को सटीक रूप से पुन: पेश करने की क्षमता में बाधा डाल सकती है और प्रयोगात्मक परिणामों में विसंगतियों और विविधताओं को जन्म दे सकती है। एक वीडियो रिकॉर्डिंग प्रोटोकॉल प्रदान करके, इस शोध पत्र का उद्देश्य इस अंतर को पाटना और एक मानकीकृत संसाधन प्रदान करना है जो प्रजनन क्षमता को बढ़ा सकता है और एलईसी संस्कृति के क्षेत्र में ज्ञान हस्तांतरण की सुविधा प्रदान कर सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस पत्र में प्रस्तुत प्रोटोकॉल प्राथमिक एलईसी के सफल अलगाव, संस्कृति और उपसंस्कृति के लिए एक व्यापक, चरण-दर-चरण मार्गदर्शिका प्रदान करता है, जो वीडियो प्रलेखन के साथ पूरा होता है। लिखित निर्देशों के स?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को एनईआई R21EY033941 (होंगली वू को) द्वारा समर्थित किया गया था; रक्षा विभाग W81XWH2010896 (होंगली वू को); R15GM123463-02 (कायला ग्रीन और होंगली वू को)
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA | Thermo Fisher | #25300054 | For LECs dissociation |
| Alexa Fluor 488 Secondary Antibody | Jackson ImmunoResearch | #715-545-150 | For cell validation |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-605-003 | For cell validation |
| Antibody dilution buffer | Licor | #927-60001 | For cell validation |
| Beaver safety knife | Beaver-Visitec International | #3782235 | For lens dissection |
| Blocking buffer | Licor | #927-60001 | For cell validation |
| Capsulorhexis forceps | Titan Medical Instruments | TMF-124 | For lens capsule isolation |
| DMEM | Sigma Aldrich | D6429 | For LECs culture medium |
| DMSO | Sigma Aldrich | #D2650 | For making freezing medium |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Thermo Fisher | #J67802 | For lens dissection |
| Dumont tweezers | Roboz Surgical Instrument | RS-4976 | For lens capsule isolation |
| EpiCGS-a (optional) | ScienCell | 4182 | For LECs culture medium |
| FBS | Sigma Aldrich | F2442 | For LECs culture medium |
| Gentamicin (50 mg/mL) | Sigma-Aldrich | G1397 | For LECs culture medium |
| Hoechst 33342 solution | Thermo Fisher | #62249 | For cell validation |
| Micro-dissecting scissors | Roboz Surgical Instrument | RS-5983 | For lens dissection |
| Micro-dissecting tweezers | Roboz Surgical Instrument | RS5137 | For lens dissection |
| PROX1 antibody | Thermo Fisher | 11067-2-AP | For cell validation |
| Vannas micro-dissecting spring scissors | Roboz Surgical Instrument | RS-5608 | For lens capsule isolation |
| αA-crystallin antibody | Santa Cruz | sc-28306 | For cell validation |
| γ-crystallin antibody | Santa Cruz | sc-365256 | For cell validation |
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