Mouse Primary Lens 상피 세포 배양 최적화: 트립신화에 대한 종합 가이드
Summary
이 원고는 백내장 및 후낭 혼탁(PCO)에 대한 재현성을 개선하고 연구를 지원하는 것을 목표로 하는 1차 수정체 상피 세포(LEC) 배양을 위한 자세한 비디오 프로토콜을 간략하게 설명합니다. 렌즈 박리, LEC 분리 및 검증에 대한 단계별 지침을 제공하며, 특히 이 분야의 초보자에게 귀중한 가이드 역할을 합니다.
Abstract
수정체 상피세포(LEC)는 수정체의 항상성과 정상적인 기능을 유지하는 데 여러 가지 중요한 역할을 합니다. LEC는 렌즈의 성장, 발달, 크기 및 투명도를 결정합니다. 반대로, LEC의 기능 장애는 백내장 형성 및 후낭 혼탁(PCO)으로 이어질 수 있습니다. 따라서 강력한 1차 LEC 배양 시스템을 구축하는 것은 수정체 개발, 생화학, 백내장 치료제 및 PCO 예방에 종사하는 연구자에게 중요합니다. 그러나 1차 LEC를 배양하는 것은 제한된 가용성, 느린 증식 속도 및 섬세한 특성으로 인해 오랫동안 어려움을 겪어 왔습니다.
이 연구는 1차 LEC 배양을 위한 포괄적인 프로토콜을 제시함으로써 이러한 장애물을 해결합니다. 이 프로토콜은 최적화된 배양 배지의 제형화, 렌즈 캡슐의 정확한 분리, 트립신화 기술, 하위 배양 절차, 수확 프로토콜, 보관 및 배송 지침과 같은 필수 단계를 포함합니다. 배양 과정 전반에 걸쳐 위상차 현미경을 사용하여 세포 형태를 모니터링했습니다.
배양된 LEC의 진위를 확인하기 위해 면역형광 분석을 수행하여 중요한 수정체 단백질, 즉 αA- 및 γ-결정체의 존재 및 세포 내 분포를 검출했습니다. 이 상세한 프로토콜은 연구자들에게 일차 LEC를 배양하고 특성화하는 데 유용한 자원을 제공하여 수정체 생물학에 대한 이해와 수정체 관련 질환에 대한 치료 전략 개발을 가능하게 합니다.
Introduction
눈의 수정체는 들어오는 빛을 망막에 집중시킴으로써 시력에 중요한 역할을 합니다. 이 세포는 특수 세포로 구성된 투명한 무혈 구조로 구성되어 있으며, 그 중 수정체 상피 세포(LEC)가 핵심 역할을 합니다. LEC는 수정체의 전면에 위치하며 수정체의 투명성을 유지하고, 수분 균형을 조절하며, 수정체의 성장과 발달에 관여하는 역할을 합니다 1,2. LEC는 수정체의 앞쪽에 위치한 독특한 유형의 세포로, 평생 동안 수정체 섬유를 지속적으로 생산하여 수정체의 선명도와 기능을 유지하는 데 중요한 역할을 합니다.
백내장은 수정체가 점진적으로 흐려져 빛의 왜곡과 산란을 일으켜 시력을 손상시키는 것이 특징입니다 3,4. 백내장 형성의 기초가 되는 정확한 메커니즘은 복잡하고 다인자적이며, 자외선, 산화 손상 및 당화와 같은 다양한 세포 및 분자 과정을 포함합니다 5,6. LEC는 백내장의 발병에 크게 기여하는 것으로 밝혀져 연구의 중요한 초점이 되고 있습니다 1,2,7,8,9.
또한 오늘날 안과에서 가장 시급한 문제 중 하나는 이차성 백내장이라고도 하는 후낭 혼탁(PCO)의 발생률이 상대적으로 높다는 것입니다. 다낭성 난소 증후군은 백내장 수술 후 가장 흔한 합병증으로, 수술 후 5년 이내에 성인 환자의 최대 20-40%, 소아 환자의 100%에 영향을 미친다10. PCO는 주로 백내장 적출 후 수정체 주머니에 남아 있는 잔류 LEC에 의해 발생합니다. 이 세포들은 상피에서 중간엽으로의 전이(EMT)뿐만 아니라 LEC에서 수정체 섬유로의 분화를 포함하는 다면적인 병태생리학적 변형을 겪으며, 그 결과 LEC, 섬유 및 근섬유아세포가 혼합된 세포 집단이 생성됩니다 11,12,13. 형질전환된 세포는 수정체 후낭을 가로질러 증식하고 이동하여 시각 장애를 일으킵니다. 배양 모델에서 LEC의 행동 및 제어 메커니즘을 이해하면 PCO의 예방 및 관리에 대한 귀중한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 따라서 LEC를 배양하는 이 프로토콜은 이 만연한 수술 후 합병증을 연구, 이해 및 궁극적으로 퇴치하는 것을 목표로 하는 안과 연구자에게 중요한 도구를 제공합니다.
LEC 생물학의 복잡성과 백내장 형성 및 PCO에서의 LEC 생물학의 역할을 밝히기 위해서는 견고하고 재현 가능한 in vitro 1차 세포 배양 시스템을 구축하는 것이 필수적입니다. 1차 LEC 배양은 연구자에게 LEC의 기능, 신호 전달 및 분자 특성을 연구할 수 있는 통제된 환경을 제공합니다. 또한 세포 과정과 다양한 실험 조건의 영향을 조사할 수 있어 수정체 생리학 및 병리학에 대한 귀중한 통찰력을 제공합니다.
선행 연구는 LEC 배양 기법에 대한 우리의 이해를 풍부하게 했다 14,15,16,17,18,19,20. 이러한 연구는 다양한 방법론을 사용하고 LEC 행동 및 특성에 대한 중요한 결과를 도출했지만 LEC 배양을 위한 포괄적이고 접근 가능한 비디오 녹화 프로토콜은 현재 문헌에 없습니다. 이러한 제한은 초보 연구자가 기술을 정확하게 재현하는 데 방해가 될 수 있으며 실험 결과의 불일치 및 변동으로 이어질 수 있습니다. 이 연구 논문은 비디오 녹화 프로토콜을 제공함으로써 이러한 격차를 해소하고 LEC 문화 분야에서 재현성을 높이고 지식 전달을 촉진할 수 있는 표준화된 리소스를 제공하는 것을 목표로 합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 백서에 제시된 프로토콜은 기본 LEC의 성공적인 격리, 배양 및 하위 배양에 대한 포괄적인 단계별 가이드를 제공하며 함께 제공되는 비디오 문서도 함께 제공됩니다. 서면 지침과 함께 상세한 시각적 가이드는 프로토콜의 명확성과 접근성을 향상시켜 해당 분야의 연구자들 사이에서 프로토콜의 사용과 재현성을 촉진합니다. 궁극적인 목표는 백내장 형성 및 백내장 수술 후 만연한 합병증인 PCO?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작업은 NEI R21EY033941(to Hongli Wu)의 지원을 받았습니다. 국방부 W81XWH2010896 (Hongli Wu에게); R15GM123463-02 (케일라 그린과 홍리 우에게)
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA | Thermo Fisher | #25300054 | For LECs dissociation |
| Alexa Fluor 488 Secondary Antibody | Jackson ImmunoResearch | #715-545-150 | For cell validation |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-605-003 | For cell validation |
| Antibody dilution buffer | Licor | #927-60001 | For cell validation |
| Beaver safety knife | Beaver-Visitec International | #3782235 | For lens dissection |
| Blocking buffer | Licor | #927-60001 | For cell validation |
| Capsulorhexis forceps | Titan Medical Instruments | TMF-124 | For lens capsule isolation |
| DMEM | Sigma Aldrich | D6429 | For LECs culture medium |
| DMSO | Sigma Aldrich | #D2650 | For making freezing medium |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Thermo Fisher | #J67802 | For lens dissection |
| Dumont tweezers | Roboz Surgical Instrument | RS-4976 | For lens capsule isolation |
| EpiCGS-a (optional) | ScienCell | 4182 | For LECs culture medium |
| FBS | Sigma Aldrich | F2442 | For LECs culture medium |
| Gentamicin (50 mg/mL) | Sigma-Aldrich | G1397 | For LECs culture medium |
| Hoechst 33342 solution | Thermo Fisher | #62249 | For cell validation |
| Micro-dissecting scissors | Roboz Surgical Instrument | RS-5983 | For lens dissection |
| Micro-dissecting tweezers | Roboz Surgical Instrument | RS5137 | For lens dissection |
| PROX1 antibody | Thermo Fisher | 11067-2-AP | For cell validation |
| Vannas micro-dissecting spring scissors | Roboz Surgical Instrument | RS-5608 | For lens capsule isolation |
| αA-crystallin antibody | Santa Cruz | sc-28306 | For cell validation |
| γ-crystallin antibody | Santa Cruz | sc-365256 | For cell validation |
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