Summary
Denne protokollen beskriver en arbeidsflyt fra ex vivo eller in vitro cellekulturer til transkriptomiske data forbehandling for kostnadseffektiv transkriptombasert legemiddelscreening.
Abstract
Transkriptomikk gjør det mulig å få omfattende innsikt i cellulære programmer og deres respons på forstyrrelser. Til tross for en betydelig nedgang i kostnadene ved bibliotekproduksjon og sekvensering i det siste tiåret, er anvendelse av disse teknologiene i den skalaen som er nødvendig for narkotikascreening, fortsatt uoverkommelig dyrt, og hindrer det enorme potensialet i disse metodene. Vår studie presenterer et kostnadseffektivt system for transkriptombasert legemiddelscreening, som kombinerer miniatyriserte perturbasjonskulturer med mini-bulk transkriptomikk. Den optimaliserte minibulkprotokollen gir informative biologiske signaler ved kostnadseffektiv sekvenseringsdybde, noe som muliggjør omfattende screening av kjente legemidler og nye molekyler. Avhengig av valgt behandlings- og inkubasjonstid, vil denne protokollen resultere i sekvensering av biblioteker innen ca. 2 dager. På grunn av flere stopppunkter i denne protokollen kan bibliotekforberedelsen, samt sekvenseringen, utføres tidsuavhengig. Samtidig behandling av et høyt antall prøver er mulig; Måling av opptil 384 prøver ble testet uten tap av datakvalitet. Det er heller ingen kjente begrensninger i antall tilstander og/eller legemidler, til tross for at man vurderer variasjon i optimale inkubasjonstider.
Introduction
Utviklingen av nye legemidler er en kompleks og tidkrevende prosess som innebærer å identifisere potensielle legemidler og deres mål, optimalisere og syntetisere legemiddelkandidater og teste deres effekt og sikkerhet i prekliniske og kliniske studier1. Tradisjonelle metoder for narkotikascreening, dvs. systematisk vurdering av biblioteker av kandidatforbindelser for terapeutiske formål, involverer bruk av dyremodeller eller cellebaserte analyser for å teste effektene på spesifikke mål eller veier. Selv om disse metodene har vært vellykkede i å identifisere legemiddelkandidater, ga de ofte ikke tilstrekkelig innsikt i de komplekse molekylære mekanismene som ligger til grunn for legemiddeleffektivitet og også toksisitet og mekanismer for potensielle bivirkninger.
Vurdering av genombrede transkripsjonstilstander presenterer en kraftig tilnærming for å overvinne nåværende begrensninger i narkotikascreening, da det muliggjør omfattende vurderinger av genuttrykk som respons på medikamentelle behandlinger2. Ved å måle RNA-transkripter på en genombred måte uttrykt på et gitt tidspunkt, har transkriptomikk som mål å gi et helhetlig syn på transkripsjonsendringene som oppstår som respons på legemidler, inkludert endringer i genuttrykksmønstre, alternativ spleising og ikke-kodende RNA-uttrykk3. Denne informasjonen kan brukes til å bestemme narkotikamål, forutsi legemiddeleffektivitet og toksisitet, og optimalisere doserings- og behandlingsregimer.
En av de viktigste fordelene ved å kombinere transkriptomikk med objektiv legemiddelscreening er potensialet til å identifisere nye legemiddelmål som ikke tidligere er vurdert. Konvensjonelle narkotikascreeningsmetoder fokuserer ofte på etablerte målmolekyler eller veier, hindrer identifisering av nye mål og potensielt resulterer i stoffer med uforutsette bivirkninger og begrenset effektivitet. Transkriptomikk kan overvinne disse begrensningene ved å gi innsikt i molekylære endringer som oppstår som respons på medikamentell behandling, avdekke potensielle mål eller veier som kanskje ikke tidligere har blitt vurdert2.
I tillegg til identifisering av nye legemiddelmål, kan transkriptomikk også brukes til å forutsi legemiddeleffekt og toksisitet. Ved å analysere genuttrykksmønstrene assosiert med legemiddelrespons, kan biomarkører utvikles som kan brukes til å forutsi pasientens respons på et bestemt legemiddel eller behandlingsregime. Dette kan også bidra til å optimalisere doseringen av legemidler og redusere risikoen for uønskede bivirkninger4.
Til tross for de potensielle fordelene, er kostnaden for transkriptomikk fortsatt en betydelig barriere for sin utbredte anvendelse i narkotikascreening. Transkriptomisk analyse krever spesialisert utstyr, teknisk ekspertise og dataanalyse, noe som kan gjøre det utfordrende for mindre forskerteam eller organisasjoner med begrenset finansiering å bruke transkriptomikk i legemiddelscreening. Imidlertid har kostnaden for transkriptomikk vært jevnt avtagende, noe som gjør den mer tilgjengelig for forskningsmiljøene. I tillegg har fremskritt innen teknologi og dataanalysemetoder gjort transkriptomikk mer effektiv og kostnadseffektiv, noe som ytterligere øker tilgjengeligheten2.
I denne protokollen beskriver vi et høydimensjonalt og eksplorativt system for transkriptombasert legemiddelscreening, som kombinerer miniatyriserte perturbasjonskulturer med mini-bulk transkriptomikkanalyse 5,6. Med denne protokollen er det mulig å redusere kostnaden per prøve til 1/6av dagens kostnad for kommersielle løsninger for full lengde mRNA-sekvensering. Protokollen krever bare standard laboratorieutstyr, det eneste unntaket er bruk av kortlest sekvenseringsteknologi, som kan outsources hvis sekvenseringsinstrumenter ikke er tilgjengelige internt. Den optimaliserte minibulkprotokollen gir informasjonsrike biologiske signaler ved kostnadseffektiv sekvenseringsdybde, noe som muliggjør omfattende screening av kjente legemidler og nye molekyler.
Målet med forsøket er å screene for legemiddelaktivitet på PBMC i ulike biologiske sammenhenger. Denne protokollen kan brukes på ethvert biologisk spørsmål der flere legemidler bør testes med en transkriptomisk avlesning, noe som gir et transkriptom-bredt syn på den cellulære effekten av behandlingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokollen følger retningslinjene til de lokale etiske komiteene ved Universitetet i Bonn.
1. Klargjøring av buffere, løsninger og utstyr
- Forbered løsningene og samle materialene som er beskrevet i materialfortegnelsen.
- Varm opp vannbadet til 37 °C og varm opp hele vekstmediet (RPMI-1640 + 10 % kalveserum (FCS) + 1 % penicillin/streptomycin).
- For cellehøsting, bruk iskald fosfatbufret saltvann (PBS).
MERK: Hold et rent miljø mens du arbeider med celler for å opprettholde steriliteten.
2. Cellehåndtering
MERK: En detaljert protokoll for kryopreservering av mononukleære celler i perifert blod (PBMC) fra humant blod finnes i7.
- Celletining og telling
- Fjern kryovialene fra flytende nitrogen og tine dem i et vannbad ved 37 °C i 2 - 3 minutter mens du snur dem forsiktig.
- Overfør de tinte cellene til et 50 ml konisk rør.
- Skyll kryovialet med 1 ml varmt, komplett vekstmedium og tilsett denne oppløsningen dråpevis til cellene i røret (1.fortynningstrinn ).
- Gjenta fortynningen 1:1 til det når et volum på 32 ml (5 fortynninger totalt med henholdsvis 1, 2, 4, 8 og 16 ml varmt, komplett vekstmedium). Tilsett mediet dråpevis for å redusere celleforstyrrelser mens du rører det koniske røret litt.
- Sentrifuger cellesuspensjonen i 5 minutter (300 x g, 20 °C) og fjern supernatanten ved å tippe det koniske røret forsiktig i én flytende bevegelse.
- Resuspender cellene i 3 ml varmt, komplett vekstmedium og fortsett med celletelling.
- For telling, bland 10 mikrol cellesuspensjon med Trypan Blue (1:2 til 1:10 fortynning avhengig av tettheten av cellesuspensjonen) for å skille levende fra døde celler mens du teller. Døde eller skadede celler vil vises blå på grunn av opptaket av fargestoffet, mens vitale celler ikke er farget.
MERK: Trypan Blue er lett cytotoksisk, fargede celler skal ikke lagres i mer enn 5 minutter. - Telle cellene med enten en automatisert celleteller eller tellekammer ved å bruke 10 μL farget celleoppløsning.
- Når du bruker det Neubauer-forbedrede cellekammeret, teller du alle cellene i de fire store firkantene i hjørnene og bruker følgende ligning for å beregne konsentrasjonen av cellesuspensjonen.
- Når du bruker det Neubauer-forbedrede cellekammeret, teller du alle cellene i de fire store firkantene i hjørnene og bruker følgende ligning for å beregne konsentrasjonen av cellesuspensjonen.
- Fortynn cellene til en endelig konsentrasjon på 1 x 106 celler/ml med varmt, komplett vekstmedium. Sentrifuge bare hvis ønsket volum er lavere enn 3 ml og resuspender cellepelleten til riktig volum.
- Cellesåing og behandling
- Frø 100 μL cellesuspensjon per brønn i en 96-brønns cellekulturplate (1 x 105 celler / brønn).
MERK: Cellenummeret for såing ble optimalisert for PBMC-kulturer. Mens lave cellekonsentrasjoner ikke vil gi tilstrekkelig mengde RNA for sekvensering, vil et for stort antall celler øke risikoen for suboptimal cellelyse og inhibering av revers transkripsjonsreaksjon. - Forbered legemiddelfortynninger i en konsentrasjon to ganger den som brukes til behandling (2x). Velg løsningsmidlet i henhold til oppløseligheten av forbindelsen, helst komplett vekstmedium.
MERK: PBS eller dimetylsulfoksid (DMSO) kan brukes hvis tilstrekkelig løselighet ikke kan nås på annen måte. Maksimal konsentrasjon av DMSO i det resulterende inkubasjonsvolumet bør ikke overstige 0,5 % for å forhindre cytotoksisitet indusert av oppløsningsvæsken. - Tilsett 100 μL av 2x legemiddelfortynning (endelig konsentrasjon i brønn 1X) og inkuber ved 37 °C i den definerte tiden.
MERK: Komplementære undersøkelser bør utføres for å fastslå optimal inkubasjonstid og for å utelukke potensielle cytotoksisitetsmekanismer.
- Frø 100 μL cellesuspensjon per brønn i en 96-brønns cellekulturplate (1 x 105 celler / brønn).
- Cellehøsting og lysis
- Sentrifuger cellekulturplaten i 10 minutter (300 x g, 20 °C). Fjern supernatanten forsiktig med en vakuumpumpe som holder platen i en vinkel (30°-45°) mens du retter spissen mot det lave hjørnet av brønnen for å fjerne så lite celler som mulig.
- Vask cellene ved å tilsette 200 μL iskald PBS til hver brønn og sentrifuger platen i 5 minutter (300 x g, 4 °C). Fjern supernatanten med en vakuumpumpe igjen, og hold platen i skarp vinkel for å fjerne så mye PBS som mulig.
- Klargjør lysisbufferen som beskrevet i tabell 1 for antall reaksjoner (rxn) som trengs, og legg til 10 % overforbruk.
- Tilsett 15 μL lysisbuffer til hver brønn og forsegle platen med selvklebende tetningsfilm for å beskytte prøvene mot forurensning. Virv platen før sentrifugering i 1 min (1000 x g, 4 °C) og rug i 5 min på is.
- Samle 6 μL lysert celleoppløsning i en PCR-plate og frys cellelysatet kort ved -80 °C for å sikre optimal cellelyse. Pass på å unngå flere frysesykluser av platene.
MERK: STOPPPUNKT: Hvis cDNA-produksjon ikke utføres senere, kan cellelysatet lagres ved -80 °C i opptil flere måneder uten betydelig reduksjon av RNA-kvaliteten.
3. Bibliotekforberedelse for sekvensering
- Revers transkriptase (RT) reaksjon
MERK: Når du arbeider med RNA, legg alle prøvene på is og sørg for å bruke nukleasefritt utstyr (sterilt, engangs plastikk) og vann.- Klargjør RT-reaksjonsblandingen som beskrevet i tabell 2 for antall reaksjoner som trengs, og legg til 10 % overforbruk. Virv blandingen kort og spinn den kort ned. Hold blandingen på is til bruk.
- Tine cellelysatet ved romtemperatur (RT) og spinn det kort ned for å samle alt cellelysat i bunnen av platen.
- Utfør mRNA-denaturering på en termosyklist i henhold til tabell 3.
- Ta platen ut av termosyklisten og spinn den kort ned for å samle potensielt kondensat. Tilsett 6 μL RT-reaksjonsblanding i hver brønn for et endelig volum på 12 μL. Forsegl platen for å beskytte platen og for å unngå fordampning, virvel og spinn den ned.
- Plasser platen på termosyklisten og start RT-reaksjonsprogrammet i henhold til tabell 3.
- Forforsterker
- Tine high-fidelity DNA-polymerase og in-situ PCR (ISPCR) primer ved romtemperatur.
- Forbered forsterkningsblandingen i henhold til tabell 4 for antall reaksjoner som trengs, og legg til 10 % overforbruk. Virv blandingen kort og spinn den ned.
MERK: Enzymblandingen er stabil ved romtemperatur i flere timer. - Spinn ned PCR-platen, tilsett 15 μL av forsterkningsblandingen til hver brønn og forsegl platen.
- Plasser den på termosyklisten og start forforsterkerreaksjonen i henhold til tabell 5.
- Juster antall sykluser på grunn av RNA-innhold. Start med et lavere tall og øk hvis cDNA-utbyttet ikke er tilstrekkelig.
MERK: Etter vår erfaring bør optimalt antall sykluser etableres for hver celletype, eksperimentell tilstand og behandling vil ikke påvirke det optimale antall sykluser. Vi anbefaler derfor å etablere det optimale antall sykluser eksperimentelt når du etablerer denne protokollen for en ny celletype. Generelt vil primære celler kreve et høyere antall sykluser sammenlignet med cellelinjer. STOPPESTED: Forforsterkningsproduktet kan oppbevares ved -20 °C.
- Juster antall sykluser på grunn av RNA-innhold. Start med et lavere tall og øk hvis cDNA-utbyttet ikke er tilstrekkelig.
- cDNA-opprydding og kvalitetskontroll (QC)
MERK: Prøveopprydding kan utføres sekvensielt for hver plate, da prøvene er ganske stabile på dette stadiet. Å øke antall prøver vil føre til lengre varighet av protokollen, men vil ikke begrense antall prøver som kan behandles samtidig.- Før du starter, bring de magnetiske rensekulene til romtemperatur og virvel på høy hastighet i 1 min for å resuspendere perlene helt.
- Tilsett 0,8x v/v (20 μL) magnetiske renseperler til hver brønn og inkuber ved romtemperatur i 5 minutter.
- Plasser PCR-platen på et magnetstativ i 5 minutter til perlene er helt separert. Fjern supernatanten forsiktig.
- Hold platen på magnetstativet, tilsett forsiktig 100 μL nylaget 80% etanol for å vaske perlene og inkubere i 30 s. Bruk en pipette med lite volum til å fjerne supernatanten. Gjenta for et ekstra vasketrinn. Sørg for å fjerne så mye etanol som mulig.
- Lufttørk perlene på magnetstativet ved romtemperatur i opptil 5 minutter til etanolen er helt fordampet og kulene ikke lenger ser blanke ut.
- Fjern platen fra magnetstativet, resuspender perlene i 20 μL nukleasefritt vann og inkuber i 2 minutter.
- Plasser platen igjen på magnetstativet til perlene er skilt.
- Gjenopprett eluatet i en ny PCR-plate for cDNA QC og tagmentering.
- Utfør en TapeStation- eller FragmentAnalyser-analyse for å evaluere størrelsen, fordelingen og konsentrasjonen av cDNA-biblioteket (Anbefalt: TapeStation D5000-analyse). For detaljer, se produsentens instruksjoner. Et typisk utbytte på 20 ng er å forvente.
- Tagging med sett
MERK: Andre Tagmentation-protokoller kan brukes hvis de allerede er etablert.- Fortynn cDNA til en endelig konsentrasjon på 150 - 300 pg / μL ved bruk av nukleasefritt vann.
- Forprogrammer termosyklisten i henhold til tabell 6 for å sikre en umiddelbar start av tagmenteringsreaksjonen etter tilsetning av cDNA til enzymblandingen.
- Forbered tagmenteringsblandingen i henhold til tabell 7 for antall reaksjoner som trengs, og legg til 10 % overforbruk.
- Dispenser 3 μL av tagmentasjonsblandingen per reaksjon på en ny PCR-plate og tilsett 1 μL cDNA til hver reaksjon.
- Start tagmentasjonsreaksjonen umiddelbart etter tilsetning av cDNA.
- Inaktiver reaksjonen ved å tilsette 1 μL nøytraliserende tagmentbuffer (NT; alternativt kan 0,2% natriumdodecylsulfat (SDS) brukes).
- Berikelse PCR
- Forbered anriknings-PCR-blandingen Tabell 7 for antall reaksjoner, og legg til 10% overforbruk. (Anbefalt: Nextera UDI satt til å forhindre indekshopping på mønstrede strømningsceller (f.eks. Illumina NovaSeq 6000)).
- Tilsett 9 μL av anriknings-PCR-blandingen til hver reaksjon for et totalt volum på 14 μL.
- Kjør anriknings-PCR-programmet i henhold til tabell 8.
MERK: For anriknings-PCR er 16 sykluser standard. Hvis cDNA-kvaliteten er dårlig, kan ytterligere sykluser legges til.
- Opprydding og QC
- Før du starter, ta magnetiske renseperler til romtemperatur og virvel på høy hastighet i 1 min for å resuspendere perlene helt.
- Tilsett 1,0x v/v (14 μL) magnetiske renseperler og inkuber ved romtemperatur i 5 minutter.
- Plasser platen på et magnetstativ og vent i 5 minutter til perlene er helt atskilt. Fjern supernatanten forsiktig.
- Hold platen på magnetstativet, tilsett forsiktig 100 μL nylaget 80% etanol for å vaske perlene og inkubere i 30 s. Bruk en pipette med lite volum til å fjerne supernatanten. Gjenta for et ekstra vasketrinn. Sørg for å fjerne så mye etanol som mulig.
- Lufttørk perlene ved romtemperatur i 3 minutter eller til de ikke lenger ser blanke ut.
- Fjern platen fra magnetstativet, resuspender perlene i 20 μL nukleasefritt vann og inkuber i 2 minutter.
- Plasser platen igjen på magnetstativet til perlene skiller seg og gjenvinn eluatet i en ny PCR-plate for bibliotek QC.
- Utfør en TapeStation- eller Fragment Analyzer-analyse for å evaluere størrelsen, fordelingen og konsentrasjonen av cDNA-biblioteket (Anbefalt: TapeStation D1000 høysensitivitetsanalyse). For detaljer, se produsentens instruksjoner. I gjennomsnitt er et utbytte på 10 ng å forvente.
MERK: STOPPPUNKT: PCR-produktet kan oppbevares ved - 20 °C.
4. Sekvensering og forhåndsbehandling av data
- Sekvensering
MERK: Følgende retningslinjer vil gjelde for alle Illumina-instrumenter for kortlest sekvensering. Hvis instrumenteringen ikke er tilgjengelig, kan sekvenseringen utføres av et eksternt sekvenseringsanlegg. Andre sekvenseringsmetoder kan også brukes. For enkelhets skyld valgte vi å kun rapportere om den mest brukte sekvenseringsteknologien.
MERK: Følgende trinn relatert til programvarebruk beskriver prosedyren på en Illumina NovaSeq6000 sequencer.- Pool unikt indekserte biblioteker i et ekvimolær forhold i henhold til resultatene oppnådd i trinn 3.6.8.
- Mål konsentrasjonen av det endelige bassenget med en høysensitivitetsanalyse for å beregne prøvemolariteten som følger:
- Last inn flytcellen i henhold til instrumentets spesifikasjoner og eksperimentell optimalisering. Eksempler på belastning av konsentrasjoner av vanlige instrumenter er vist i tabell 9.
- Ved å berøre skjermen velger du Sekvens for å starte kjøreoppsettet.
- Følg instruksjonene på skjermen og lastflytcellen, sekvens-for-syntese-kassetten, klyngekassetten, bufferpatronen og sørg for at avfallsbeholderne er tomme.
- Når alle reagensene er gjenkjent av instrumentet, klikker du på Kjør oppsett. Definer her kjørenavnet og utdatamappen for å lagre dataene.
- Definer sekvenseringsdetaljene som sammenkoblede ender med begge avlesningene på 51 bp. To indeksavlesninger er også sekvensert med 8 bp hver.
- Trykk på Review og etter å ha sjekket om alle sekvenseringsdetaljer er riktige, trykk Start Run.
MERK: Den anbefalte sekvenseringsdybden er 5 x 106 lesninger/prøver, med minimum 1 x 106 lesninger/utvalg.
- Forhåndsbehandling av data
- Transformer rå sekvenseringsdata til FASTQ-format og demultipleks, i henhold til eksempelindeksene med verktøyet Bcl2Fastq2. Utfør demultipleksing med standardinnstillinger. For detaljerte instruksjoner om Bcl2Fastq2, se referansehåndboken.
MERK: FASTQ-konvertering og demultipleksing utføres vanligvis av sekvenseringsanlegget hvis sekvensering ikke utføres internt. Sekvenseringsanlegg vil vanligvis gi demultiplekset FASTQ for videre behandling. - Flere alternativer er tilgjengelige for datajustering og mengdekvantifisering av sekvenseringsavlesninger (Anbefalt: nf-core RNA-seq pipeline (https://nf-co.re/rnaseq)). Rørledningen gir flere alternativer, bruk standardinnstillingen med STAR8 som justert og Salmon9 for å kvantifisere transkripsjonsmengden.
- MERK: For ytterligere bioinformatikkanalyse er flere metoder tilgjengelige. Det er ikke innenfor rammen av denne protokollen å dekke alle (Anbefalt: DEseq2 pipeline10). Et standardskript basert på DEseq2-arbeidsflyten utviklet av oss finner du på GitHub (https://github.com/jsschrepping/RNA-DESeq2).
- Transformer rå sekvenseringsdata til FASTQ-format og demultipleks, i henhold til eksempelindeksene med verktøyet Bcl2Fastq2. Utfør demultipleksing med standardinnstillinger. For detaljerte instruksjoner om Bcl2Fastq2, se referansehåndboken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Etter rapportert protokoll ble humane PBMCer sådd, behandlet med ulike immunmodulerende medikamenter og, etter ulike inkubasjonstider, høstet for bulktranskriptomisk analyse ved hjelp av sekvenseringsprotokollen (figur 1).
Ideelle legemiddelkonsentrasjoner og inkubasjonstider for testforbindelser bør identifiseres oppstrøms denne protokollen ved hjelp av komplementære eksperimentelle strategier og basert på det spesifikke vitenskapelige spørsmålet. I de fleste tilfeller bør inkubasjon på 2-4 timer og 24 timer gi en representasjon av tidlig og sen transkripsjonell respons på behandlingen.
De viktigste resultatene for å evaluere korrekte utførelser av protokollen er cDNA og bibliotekets QC (figur 2 og figur 3). cDNA-profilen bør ha en bred fordeling med en gjennomsnittlig størrelse på > 1000 bp (figur 2), en lavere gjennomsnittlig størrelse eller akkumulering av molekyler ved lav molekylvekt (figur 4) kan indikere lav RNA-inngang eller RNA-nedbrytning.
Utarbeidelsen av et godt sekvenseringsbibliotek er også et viktig steg i protokollen; post-tagmentation biblioteker bør ha en ganske smal fordeling på rundt 250 bp (figur 3); lengre fragmenter vil fungere dårlig under sekvensering (figur 5).
Etter sekvensering justeres rå FASTQ-filer mot det aktuelle referansegenomet (f.eks. Menneske eller mus) og transkripsjonsmengden kvantifiseres for hver prøve (se nf-core RNA-seq pipeline (https://nf-co.re/rnaseq)). Utforskende dataanalyse vil nå bli utført for å sjekke den generelle kvaliteten på dataene. Justerte data skal fange et høyt antall proteinkodende gener, da bare polyadenylert RNA vil bli fanget med denne protokollen (figur 6A). I menneskelige prøver forventer vi å fange mellom 15000 og 20000 transkripsjoner (denne verdien er basert på GENCODE 27-referansen menneskelig genomannotasjon11). Videre utforskende dataanalyse kan omfatte prinsipal komponentanalyse (PCA). Her kan den underliggende strukturen av dataene visualiseres i et todimensjonalt plott. I figur 6B viser vi et eksemplarisk PCA-plott; Prikker her er farget av behandling, og viser tre forskjellige klynger av eksperimentelle forhold som fører til lignende transkriptomiske profiler. Det kan også sees her at biologiske replikater (prikker med samme farge) er transkripsjonelt like, noe som viser en god robusthet av protokollen. Resultatene som vises i denne figuren, ble generert med pipeline tilgjengelig på GitHub basert på DESeq2-arbeidsflyten (https://github.com/jsschrepping/RNA-DESeq2).
Figur 1: Tidsestimeringer og arbeidsflyt. (A) Tidsestimeringer av denne protokollen for en kjøring med 96 prøver. (B) Diagram over hvert trinn i protokollen fra tining av cellene til forhåndsbehandling av data. Diagrammet skal leses fra topp til bunn etter pilene. Sirklede piler beskriver en repetisjon av trinnet. Røde prikker representerer stopppunkter som er nærmere beskrevet i protokollen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Eksempler på resultater for cDNA-biblioteker. Resultater av en miniatyrisert elektroforese som viser størrelsesfordelingen av eksemplarisk cDNA-bibliotek. Øvre og nedre signaler representerer markører som brukes til å justere prøven. Blå linjer angir gjennomsnittlige fragmentstørrelser (blå parenteser). cDNA-profilen viser en bred fordeling med en gjennomsnittlig størrelse på > 1000 bp. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Eksempler på sekvenseringsresultater for sekvensering av bibliotek. Resultater av en miniatyrisert elektroforese som viser størrelsesfordelingen av vellykket forberedte sekvenseringsbiblioteker med en smal fordeling og en gjennomsnittlig størrelse på rundt 250 bp. Øvre og nedre signaler representerer markører som brukes til å justere prøven. Blå linjer angir gjennomsnittlige fragmentstørrelser (blå parenteser). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Eksempler på suboptimale resultater for cDNA-biblioteker. Resultater av en miniatyrisert elektroforese som viser størrelsesfordelingen av et suboptimalt cDNA-bibliotek med en gjennomsnittlig størrelse på < 200 bp. Øvre og nedre signaler representerer markører som brukes til å justere prøven. Blå linjer angir gjennomsnittlige fragmentstørrelser (blå parenteser). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Eksempler på suboptimale resultater for sekvensering av bibliotek. Resultater av en miniatyrisert elektroforese som viser størrelsesfordelingen av et suboptimalt sekvenseringsbibliotek som inneholder lengre fragmenter på 200 - 1000 bp. Øvre og nedre signaler representerer markører som brukes til å justere prøven. Blå linjer angir gjennomsnittlige fragmentstørrelser (blå parenteser). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Utforskende dataanalyse. Representative resultater fra eksplorativ dataanalyse som viser effekten av utvalgte immunmodulerende medikamenter på PBMC. (A) Søylediagram over antall påviste gener (Y-akser) separert etter gentype (X-akser). (B) PCA av alle gener i datasettet farget av de forskjellige medikamentelle behandlingene. Prikker med samme farge er biologiske replikater. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Reagent | Konsentrasjon | Volum [μL] /rxn |
| Guanidinhydroklorid | 80 mM | 7.50 |
| Deoksynukleotidtrifosfater (dNTP) | 10 mM hver | 6.52 |
| SMART dT30VN-primer | 100 μM | 0.33 |
| Nukleasefritt vann | 0.65 | |
| Totalt volum | 15.00 |
Tabell 1: Lysisbuffer.
| Reagent | Volum [μL] /rxn |
| SSRT II-buffer (5x) | 2.00 |
| DTT (100 mM) | 0.50 |
| Betaine (5 M) | 2.00 |
| MgCl2 (1 M) | 0.14 |
| SSRT II (200 U/μL) | 0.25 |
| RNAse-hemmer (40 E/μL) | 0.25 |
| TSO-LNA (100 μM) | 0.20 |
| Nukleasefritt vann | 0.66 |
| Totalt volum | 6.00 |
Tabell 2: Revers transkriptase (RT) reaksjonsblanding.
| mRNA-denaturering | ||
| Skritt | Temperatur | Varighet |
| mRNA-denaturering | 95 °C | 2 min |
| på is | 2 min | |
| Omvendt transkripsjon | ||
| Skritt | Temperatur | Varighet |
| Omvendt transkripsjon | 42 °C | 90 min |
| Inaktivering av enzymer | 70 °C | 15 min |
| 4 °C | holde | |
Tabell 3: Termosyklistprogram for mRNA-denaturering og revers transkriptase (RT).
| Reagent | Volum [μL] /rxn |
| High-fidelity DNA-polymerase | 12.50 |
| ISPCR-primer (10 μM) | 0.15 |
| Nukleasefritt vann | 2.35 |
| Totalt volum | 15.00 |
Tabell 4: Forforsterkerblanding.
| Trinn | Temperatur | Varighet | |
| Første denaturering | 98 °C | 3 min | |
| Denaturering | 98 °C | 20 s | 16 – 18 sykluser |
| Annealing | 67 °C | 20 s | |
| Forlengelse | 72 °C | 6 min | |
| 4 °C | holde |
Tabell 5: Program for termosykling før forsterkning.
| Trinn | Temperatur | Varighet |
| Stagnement | 55 °C | 8 min |
| 4 °C | holde |
Tabell 6: Tagmentation thermocycler program.
| Tagmentation mix | |
| Reagent | Volum [μL] /rxn |
| Amplicon Tagment Mix (ATM) | 1.0 |
| Tagment DNA-buffer (TD) | 2.0 |
| Totalt volum | 3.0 |
| Berikelse PCR-blanding | |
| Reagent | Volum [μL] /rxn |
| High-fidelity DNA-polymerase | 7.0 |
| Nextera-kompatibel indekseringsprimer | 2.0 |
| Totalt volum | 9.0 |
Tabell 7: Tagmenteringsblanding og anriknings-PCR-blanding.
| Trinn | Temperatur | Varighet | |
| Varm start | 72 °C | 5 min | |
| Første denaturering | 98 °C | 30 s | |
| Denaturering | 98 °C | 10 s | 16 sykluser |
| Annealing | 60 °C | 30 s | |
| Forlengelse | 72 °C | 1 min | |
| Endelig forlengelse | 72 °C | 5 min | |
| 4 °C | holde |
Tabell 8: Berikelse PCR termosyklist program.
| Instrument | Laster konsentrasjon |
| MiSeq v2 | 10 pst. |
| NextSeq 500/550 | 1,4 pst. |
| NovaSeq 6000 | 1250 pst. |
Tabell 9: Eksempler på belastning av konsentrasjoner av vanlige sekvenseringsinstrumenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Narkotikaforskning og stoffutvikling kan ha stor nytte av det helhetlige synet på cellulære prosesser som bulktranskriptomikk kan gi. Likevel er denne tilnærmingen ofte begrenset av de høye kostnadene ved eksperimentet med standard bulk RNA-seq-protokoll, som forbyr anvendelsen i akademiske omgivelser, samt potensialet for industriell skalerbarhet.
De mest kritiske trinnene i protokollen er celletining og de første trinnene i bibliotekforberedelsen. Å sikre høy levedyktighet av cellene etter tining er kritisk for vellykkede behandlinger og transkriptomisk analyse. De første trinnene i cellehøsting og bibliotekforberedelse til cDNA-syntese er kritiske for å bevare RNAs integritet. Det er avgjørende på dette stadiet å holde cellelysatet på is til enhver tid og behandle prøvene så raskt som mulig. Hvis overdreven RNA-nedbrytning observeres, bør laboratorieoverflater og utstyr rengjøres med spesifikke produkter for å hemme eventuell RNase-aktivitet.
Protokollen beskrevet her er for tiden optimalisert for medikamentell behandling på PBMC fra friske donorer i maksimalt 24 timer. For å utføre eksperimentet med en annen celletype eller for lengre inkubasjonstid, kan det hende at cellenumre for såings- og dyrkingsforhold må optimaliseres tilsvarende.
Med denne protokollen tilbyr vi en arbeidsflyt for transkriptomisk analyse ved medikamentell behandling på PBMC ved bruk av standard laboratorieutstyr og uten behov for kommersielle sett. Med denne tilnærmingen og ved å unngå trinnet med RNA-rensing, reduserte vi kostnadene betydelig, noe som muliggjorde parallell analyse av et høyt antall forbindelser.
Fordi denne protokollen er basert på en in vitro-analyse, er den største begrensningen at den ikke kan evaluere noen metabolsk behandling av legemidlene som kan føre til forskjellig bioaktivitet. I tillegg vil antall fangede transkripsjoner og sekvenseringsdybde være lavere enn i standard bulk fulllengde transkriptomikkmetoder, og forhindrer bruk av disse dataene for applikasjoner som krever høyere informasjonsinnhold, for eksempel differensialskjøting eller kvantifisering av enkeltnukleotidpolymorfismer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
J.L.S. støttes av German Research Foundation (DFG) under Tysklands Excellence Strategy (EXC2151-390873048), samt under SCHU 950/8-1; GRK 2168, TP11; CRC SFB 1454 Metaflammation, IRTG GRK 2168, WGGC INST 216/981-1, CCU INST 217/988-1, det BMBF-finansierte excellence-prosjektet Diet-Body-Brain (DietBB); og EU-prosjektet SYSCID under tilskuddsnummer 733100. M.B. støttes av DFG (IRTG2168-272482170, SFB1454-432325352). L.B. støttes av DFG (ImmuDiet BO 6228/2-1 - Prosjektnummer 513977171) og Tysklands Excellence Strategy (EXC2151-390873048). Bilder opprettet med BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mL conical tube | fisher scientific | 10203001 | |
| Adhesive PCR Plate Seals | Thermo Fisher Scientific | AB0558 | |
| Amplicon Tagment Mix (ATM) | Illumina | FC-131-1096 | Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 samples) |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A 63881 | |
| Betaine | Sigma-Aldrich | 61962 | |
| Cell culture grade 96-well plates | Thermo Fisher Scientific | 260860 | |
| Cell culture vacuum pump (VACUSAFE) | Integra Bioscience | 158300 | |
| Deoxynucleotide triphosphates (dNTPs) mix 10 mM each | Fermentas | R0192 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 276855 | |
| DTT (100 mM) | Invitrogen | 18064-014 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 798681 | for adherent cells |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 51976 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
| Filter tips (10 µL) | Gilson | F171203 | |
| Filter tips (100 µL) | Gilson | F171403 | |
| Filter tips (20 µL) | Gilson | F171303 | |
| Filter tips (200 µL) | Gilson | F171503 | |
| Guanidine Hydrochloride | Sigma-Aldrich | G3272 | |
| ISPCR primer (10 µM) | Biomers.net GmbH | SP10006 | 5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG T-3′ |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X) | KAPA Biosystems | KK2601 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Magnetic stand 96 | Ambion | AM10027 | |
| Neutralize Tagment (NT) Buffer | Illumina | FC-131-1096 | Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 samples), alternatively 0.2 % SDS |
| Nextera-compatible indexing primer | Illumina | ||
| Nuclease-free water | Invitrogen | 10977049 | |
| PBS | Thermo Fisher Scientific | AM9624 | |
| PCR 96-well plates | Thermo Fisher Scientific | AB0600 | |
| PCR plate sealer | Thermo Fisher Scientific | HSF0031 | |
| Penicillin / Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15070063 | |
| Qubit 4 fluorometer | Invitrogen | 15723679 | |
| Recombinant RNase inhibitor (40 U/ul) | TAKARA | 2313A | |
| RPMI-1640 cell culture medium | Gibco | 61870036 | If not working with PBMCs, adjust to cell type |
| SMART dT30VN primer | Sigma-Aldrich | 5' Bio-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACT30VN-3 |
|
| Standard lab equipment | various | various | e.g. centrifuge, ice machine, ice bucket, distilled water, water bath |
| SuperScript II Reverse Transcriptase (SSRT II) | Thermo Fisher Scientific | 18064-014 | |
| SuperScript II Reverse Transcriptase (SSRT II) buffer (5x) | Thermo Fisher Scientific | 18064-014 | |
| Tagment DNA Buffer (TD) | Illumina | FC-131-1096 | Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 samples) |
| TapeStation system 4200 | Agilent | G2991BA | |
| Thermocycler (S1000) | Bio-Rad | 1852148 | |
| TSO-LNA (100 uM) | Eurogentec | 5' Biotin AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACAT(G)(G){G |
|
| Vortex-Genie 2 Mixer | Sigma-Aldrich | Z258415 |
References
- Hughes, J. P., Rees, S., Kalindjian, S. B., Philpott, K. L.
- Yang, X., et al. High-throughput transcriptome profiling in drug and biomarker discovery. Front Genet. 11, 19 (2020).
- Bonaguro, L., et al. A guide to systems-level immunomics. Nat Immunol. 23 (10), 1412-1423 (2022).
- Carraro, C., et al. Decoding mechanism of action and sensitivity to drug candidates from integrated transcriptome and chromatin state. ELife. 11, 78012 (2022).
- Picelli, S., et al. Smart-seq2 for sensitive full-length transcriptome profiling in single cells. Nat Methods. 10 (11), 1096-1098 (2013).
- Picelli, S., et al. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nat Protoc. 9 (1), 171-181 (2014).
- De Domenico, E., et al. Optimized workflow for single-cell transcriptomics on infectious diseases including COVID-19. STAR Protoc. 1 (3), 100233 (2020).
- Dobin, A., et al.
- Patro, R., et al. Salmon provides fast and bias-aware quantification of transcript expression. Nat Methods. 14 (4), 417-419 (2017).
- Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol. 15 (12), 550 (2014).
- Frankish, A., et al. GENCODE reference annotation for the human and mouse genomes. Nucleic Acids Res. 47, D766-D773 (2019).
