Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para o teste de evitação de local ativo, um paradigma de aprendizagem espacial dependente do hipocampo projetado para roedores. A alteração dos principais parâmetros permite novos testes dos animais antes e depois dos tratamentos ou ao longo do tempo.
Abstract
A aprendizagem espacial dependente do hipocampo em roedores foi testada usando uma variedade de métodos. Isso inclui as tarefas de labirinto aquático de Morris (MWM), labirinto em Y e localização de novos objetos (NOL). Mais recentemente, a tarefa de prevenção ativa de locais (APA) foi desenvolvida como uma alternativa a essas abordagens mais tradicionais. Na tarefa APA, os ratos devem usar pistas espaciais colocadas em torno de uma arena rotativa para evitar uma zona de choque estacionária. Devido aos múltiplos parâmetros que podem ser ajustados, a tarefa APA demonstrou ser uma abordagem muito versátil. Ele se presta a ser usado longitudinalmente e repetidamente para a mesma coorte de camundongos. Aqui, fornecemos um protocolo detalhado para conduzir com sucesso a tarefa APA. Também destacamos abordagens alternativas de APA que podem ser usadas para examinar diferentes componentes da aprendizagem espacial. Descrevemos os processos de coleta e análise de dados. As etapas críticas durante a tarefa APA são discutidas para aumentar a probabilidade de realizar o teste com sucesso. A tarefa APA tem várias vantagens sobre os testes de navegação espacial mais tradicionais. É apropriado usar com camundongos idosos ou com fenótipos de doenças, como a doença de Alzheimer. A complexidade da tarefa pode ser facilmente alterada, permitindo que uma ampla gama de cepas de camundongos seja testada. Além disso, a tarefa APA é adequada para testar animais que foram submetidos a cirurgia ou intervenções experimentais que podem ter afetado a função motora ou neural, como acidente vascular cerebral ou lesão cerebral traumática.
Introduction
A evitação ativa do local (APA) é uma ferramenta eficaz para testar o aprendizado espacial dependente do hipocampo em roedores 1,2,3,4. Durante a tarefa APA, o animal é colocado em uma arena giratória e é obrigado a usar pistas visuais para se orientar e evitar uma zona de choque aversiva5. A rotação da arena garante que o mouse não possa usar uma abordagem idiotética para navegação, nem marcas de cheiro podem ser usadas, pois essas pistas giram na plataforma enquanto a zona de choque permanece estacionária5. Alterar a velocidade e a direção da arena, bem como a localização da zona de choque e as pistas visuais, permite o novo teste de camundongos várias vezes 6,7,8. O APA oferece várias vantagens distintas em comparação com o labirinto aquático de Morris (MWM), um dos testes de aprendizagem espacial mais amplamente utilizados. É importante ressaltar que os ratos têm aversão à natação e acham a tarefa MWM extremamente estressante9. Além disso, foi relatado que camundongos idosos flutuam durante a tarefaMWM 10, tornando-a inadequada como uma tarefa de aprendizado espacial em muitos casos. Além disso, como a tarefa MWM requer uma plataforma oculta e submersa para os ratos localizarem durante o teste. Isso exige que a água seja opaca, o que normalmente é obtido por meio da adição de tinta branca. O rastreamento e a análise de animais durante tarefas comportamentais requerem contraste suficiente entre o sujeito e o ambiente, excluindo certas cepas de camundongos, como Swiss ou BALB/c, de serem testadas no MWM. Na tarefa APA, esse problema é contornado por meio da adição de plástico preto sob a grade.
Vários paradigmas da APA foram projetados para testar a aprendizagem espacial, demonstrando sua utilidade como uma ferramenta comportamental eficaz. Por exemplo, a aquisição, retenção e consolidação do aprendizado espacial são normalmente realizadas por testes diários de animais que podem variar de 3 a 5 dias 6,7,11,12. A memória e o aprendizado são quantificados comparando o número de choques recebidos a cada dia de aquisição. O tempo para a primeira entrada e o tempo máximo para evitar a zona de choque também são parâmetros importantes que podem ser usados para determinar mudanças na capacidade de aprendizado durante a tarefa. Alternativamente, a memória de trabalho espacial pode ser testada conduzindo uma única sessão APA de 30 minutos 2,13, onde o aprendizado espacial é medido como mudanças dentro da sessão, comparando o desempenho, como o número de choque, em caixas de 5 minutos.
Neste artigo, descrevemos a tarefa APA e destacamos os principais recursos que devem ser considerados ao realizar este teste de aprendizagem espacial.
Protocol
Todos os procedimentos em animais foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal da Universidade de Queensland sob as diretrizes do Conselho Nacional de Saúde e Pesquisa Médica da Austrália (número de aprovação: QBI/189/15).
1. Configuração da sala APA
NOTA: O aparelho APA compreende uma arena elevada com um piso de grade metálica cercado por um limite circular transparente de 32 cm de altura. As barras de metal são espaçadas uniformemente (0,5 cm de distância) e têm 0,3 cm de diâmetro.
- Certifique-se de que o aparelho APA esteja dentro da moldura da câmera montada no teto. Rastreie o mouse usando um software de rastreamento de animais disponível comercialmente.
- A arena APA geralmente gira a uma velocidade de 1 rpm, e uma zona de choque estacionária pré-designada de 60 ° é definida dentro da arena rotativa. Quando o mouse entrar na zona de choque, aplique um leve choque no pé de 0,5 mA (60 Hz, 500 ms).
- Certifique-se de que a localização da zona de choque permaneça constante durante o teste e seja definida eletronicamente dentro da configuração experimental. A arena giratória carrega o mouse para a zona de choque, a menos que o mouse se mova ativamente para evitá-lo.
- Coloque quatro novas dicas visuais em quatro paredes de salas diferentes na mesma altura da plataforma giratória, normalmente a 30-50 cm de distância da arena. Certifique-se de que as dicas sejam cores neutras, como símbolos ou formas em preto e branco impressos em papel A3 e laminados para facilitar a limpeza (Figura 1A).
- Certifique-se de que a intensidade da luz da sala esteja entre 30-70 Lux. O aumento da intensidade da luz induz um comportamento semelhante à ansiedade e reduz a exploração.
- Antes de começar, abra o programa Tracker e selecione a tarefa APA.
- Em Opções para Rastreador 2D, selecione a guia Experimento . Aqui, certifique-se de que a opção Evitar local - Apenas um quadro - Posição esteja selecionada. Isso permitirá configurar os parâmetros necessários. Salve o arquivo de configuração e ajuste conforme necessário.
- Na guia Experimento , defina a duração do experimento na caixa Tempo do Experimento . A duração típica de um experimento é de 600 s ou 10 min.
- Certifique-se de que a opção Ativar temporizador está selecionada. Altere os parâmetros de choque na região do temporizador, conforme discutido acima.
- Insira os detalhes experimentais comuns no espaço fornecido na região Moldura do ambiente da guia Experimento . Por exemplo, certifique-se de que o nome do arquivo de saída padrão seja preenchido com a data, um identificador experimental simples e o dia do teste. Termine o nome com um sublinhado "_" para permitir a adição de um ID de mouse exclusivo durante o experimento.
- Na região Moldura do ambiente também está a guia Alvos . Clique no botão Editar para garantir que toda a arena seja incluída na região de interesse. Em seguida, selecione Arc para fornecer os parâmetros ajustáveis para o tamanho e a localização da zona-alvo de choque (Figura 1B).
- Abra a guia Rastreamento para ajustar os parâmetros para garantir o rastreamento bem-sucedido dos mouses. A caixa de contraste tem opções escuras ou claras para permitir camundongos escuros (por exemplo, C57Bl/6) ou claros (por exemplo, BALB/c). Isso cria um contraste eficaz entre o fundo e os ratos. Ao usar linhagens albinas de camundongos, coloque um pedaço de plástico preto sob a arena para permitir que esse contraste seja alcançado (Figura 2).
- Defina o tamanho do mouse e os intervalos de área nesta região. Defina esses parâmetros para reconhecer efetivamente o mouse quando estiver na arena. Como alternativa, defina-os depois de pressionar o botão Do calibrador .
- Selecione o botão Do calibrador para garantir que a arena esteja completamente na máscara da região de interesse.
- Inicie a arena nesta guia para garantir que, quando a arena girar, a arena permaneça na máscara. Essa guia também é crítica para selecionar o limite de contraste apropriado. Mova a linha vermelha no painel Limite para ajustar o limite de contraste.
NOTA: A Figura 3A mostra uma seleção de limite ideal, conforme evidenciado por uma região laranja sólida e um "X" azul onde o mouse está localizado. Um limite ruim é mostrado na Figura 3B e mostra apenas laranja salpicado e nenhum "X".
- Inicie a arena nesta guia para garantir que, quando a arena girar, a arena permaneça na máscara. Essa guia também é crítica para selecionar o limite de contraste apropriado. Mova a linha vermelha no painel Limite para ajustar o limite de contraste.
- Use a guia Dispositivos e defina a direção de rotação e a velocidade da arena usando o botão de velocidade. Selecione as velocidades positivas e negativas, representando as rotações no sentido horário e anti-horário. Defina a intensidade do choque na seção Fonte de Corrente . A configuração mais comum para mouses é uma rotação de 1 rpm e um choque de 0,5 mA.
- Altere como ou quando aplicar os choques na guia Fonte atual .
- Certifique-se de que o modo atual esteja selecionado para Rastrear dependente. Isso fornecerá um choque elétrico quando o mouse se mover para a zona de choque.
- Selecione Tempo para dar choques em um intervalo de tempo definido pelo usuário. Use faixas gravadas anteriormente para dar choque em um mouse selecionando Do arquivo. Isso é para fornecer um mouse de controle unido submetido a um número idêntico de choques com a mesma duração e intensidade, independentemente do aprendizado espacial.
NOTA: As guias Saída de arquivo e Janela permitem que dados e arquivos de vídeo sejam salvos em um diretório específico. O botão Da imagem na guia Saída do arquivo também permite que a região de interesse capture toda a arena a ser selecionada.
- Retire-se para trás da cortina e comece o julgamento. A presença do experimentador perto da arena e qualquer ruído desnecessário podem afetar o desempenho do animal.
- Certifique-se de que qualquer ruído e odor sejam limitados durante o teste, o que pode fornecer ao mouse outra pista, afetando seu desempenho. Exemplos para minimizar isso incluem garantir uma lixeira clínica fechada, usar salas removidas de espaços de laboratório barulhentos e limpar completamente o equipamento entre os camundongos. Os pesquisadores podem considerar o uso do gerador de ruído branco para mascarar ruídos externos não relacionados.
- Deixe a cama da gaiola doméstica permanecer a mesma durante todo o período de teste comportamental, pois isso pode fornecer novos estímulos e afetar o comportamento.
- Para evitar variações diurnas, realize testes em um horário consistente todos os dias.
2. Habituação ao manuseio do experimentador
- Manuseie cada mouse diariamente por 30 s a 1 min por pelo menos 2-3 dias antes do teste. O manuseio de animais reduz significativamente o estresse e o comportamento relacionado à ansiedade durante os testes.
- Use o mesmo jaleco e evite usar desodorantes, colônias ou perfumes fortes durante a habituação e o teste.
3. Habituação à arena APA (1 dia)
- Traga o rato para a antessala ou sala de testes para habituação. Deixe o mouse se habituar por no mínimo 30 min. Defina a intensidade da luz na antessala ou na sala de testes antes que os ratos sejam trazidos para se habituar.
- Configure o software Tracker.
- Crie uma pasta específica do experimento. Dependendo do paradigma experimental, tenha pastas separadas para cada dia ou teste. Defina as configurações do experimento conforme descrito acima e salve essas configurações para usar no futuro.
- Antes de iniciar uma avaliação, abra a configuração salva clicando na guia Arquivo e, em seguida, clique no símbolo Salvar , adicione um ID de mouse exclusivo na janela recém-aberta e execute a avaliação pressionando a guia Reproduzir .
- Habitue o mouse ao aparelho APA expondo-o à arena rotativa por 5 min sem aplicar choques.
- Remova o mouse da gaiola doméstica levantando-o da base da cauda e colocando-o suavemente na mão enluvada. Transporte o mouse para o aparelho APA e coloque-o longe da zona de choque, de frente para a parede.
- Retire-se para trás da cortina e comece o julgamento.
- No final do teste, remova o mouse e retorne à gaiola inicial.
- Colete toda a urina e fezes e limpe bem a grade com etanol a 80% (v / v).
- Repita as etapas 3.4 a 3.7 para todos os mouses.
4. Treinamento de aquisição usando APA (1-6 dias)
- Defina a iluminação da sala para condições idênticas às do dia de habituação.
- Traga o mouse para a antessala ou sala de teste e deixe-o se habituar por um mínimo de 30 minutos.
- Configure o software Tracker conforme descrito acima.
- Defina a duração do teste.
- Certifique-se de que a fonte atual esteja ligada e definida (ou seja, 0.5 mA).
- Coloque o mouse na arena longe da zona de choque e de frente para a parede.
- Retire-se para trás da cortina e comece o teste pressionando o botão Play . Monitore o mouse na tela do computador e intervenha, se necessário. Por exemplo, o mouse não está recebendo choques ou parece excessivamente estressado, como evidenciado por saltos ou vocalizações excessivas.
- No final do teste, remova o mouse e retorne à gaiola inicial.
NOTA: Certifique-se de que os ratos estão recebendo e reagindo aos choques. Os ratos respondem ao choque recuando e vocalizando. Se não for esse o caso, eles podem não estar recebendo o choque. Isso pode ser devido a fezes na grade ou devido ao rastreamento inadequado. Portanto, limpar a grade após cada tentativa e otimizar o rastreamento do mouse, conforme discutido acima, é essencial.
5. Treinamento de aquisição reversa (opcional, 1-6 dias)
- Na tarefa de reversão, reposicione a zona de choque em um novo local, geralmente 180° da posição anterior. Avalie a capacidade do mouse de aprender com flexibilidade um novo local de zona de choque. As dicas da sala normalmente não são alteradas durante o aprendizado reverso.
- Repita as etapas 3.4 a 3.7 para todos os mouses.
6. Teste de sonda (opcional, 1 dia)
- No teste de sonda, meça o tempo até a primeira entrada e/ou o tempo máximo evitando a zona de choque.
NOTA: Isso indica consolidação de memória após a fase de aquisição. Um camundongo bem treinado evitará entrar na zona de choque por um período prolongado (>60 segundos), mostrando evidências de aprendizado espacial. - Defina a intensidade da luz da sala como no dia do treinamento de aquisição.
- Habituar o rato na sala de testes ou antessala por 30 min.
- Configure o software Tracker.
- Defina a duração do teste para o mesmo tempo que o período de teste realizado anteriormente (por exemplo, 10 min ou 30 min, dependendo dos parâmetros do teste).
- Não aplique choques para este teste.
- Coloque o mouse no lado oposto da zona de choque aversivo, de frente para a parede.
- Comece o teste e retire-se para trás da cortina.
- Certifique-se de que o mouse seja rastreado com eficiência.
- Monitore o mouse na tela do computador e pare o teste quando ele entrar na zona de choque. Alguns pesquisadores preferem continuar o teste por 5 minutos para ver se o camundongo continua a retornar à zona de choque.
- Pegue o mouse com cuidado e volte para a gaiola inicial.
- Certifique-se de que toda a urina e fezes sejam coletadas e que a grade seja completamente limpa com etanol a 80% (v/v).
7. Análise de pista
NOTA: O desempenho da tarefa pode ser alcançado por meio de diferentes softwares de rastreamento. Abaixo está como o software incluído é usado para determinar o desempenho durante a tarefa APA. Nesse caso, os dados são analisados usando o programa Análise de Trilha .
- Para analisar os dados, abra o programa Análise de Rastreamento e selecione Prevenção no menu suspenso na janela principal.
- Clique em Adicionar tarefa para carregar os arquivos de dados salvos durante a fase de aquisição em uma nova janela. Em Nome do grupo, crie um grupo para analisar, por exemplo, Dia 1 ou hora da análise.
- Clique no Diretório de saída para selecionar o local para salvar os dados analisados.
- Adicione os arquivos a serem analisados clicando na guia Adicionar arquivos e selecionando os arquivos da unidade local.
- Defina o tempo a ser analisado clicando na guia Definir Tempo . Isso permite definir o período que será analisado, ou seja, de 0 a 600 s. Como alternativa, analise os dados em caixas, ou seja, 60 s.
- Depois que todas as faixas forem adicionadas, clique na guia Análise e selecione Executar Análise para analisar os dados. A análise produzirá várias pastas. Os dados para análise estarão na pasta TBLfiles . Abra esses arquivos de dados em uma planilha e use-os para análises posteriores, ou seja, comparação em pares ou ANOVA de medidas repetidas.
NOTA: A análise também produzirá outras pastas, incluindo arquivos PS que terão uma descrição de uma única página dos mouses durante o teste, mostrando um mapa de rastreamento e onde os choques foram recebidos.
Representative Results
Camundongos com capacidade de aprendizado espacial intacta mostrarão uma diminuição no número de choques durante sucessivas tentativas de aquisição (Figura 4A). Da mesma forma, o tempo máximo evitando a zona de choque aumentará à medida que o mouse aprender a navegar com sucesso para longe da zona de choque (Figura 4B). No entanto, os camundongos que não conseguem aprender uma estratégia de evitação eficaz mostrarão um número constante de choques para cada tentativa de aquisição (Figura 4A). Freqüentemente, os camundongos que não conseguem identificar a zona de choque recebem vários choques durante cada entrada na zona. Os mapas de rastreamento são úteis para fornecer exemplos de camundongos que aprendem a evitar a zona de choque (Figura 4C) e aqueles que são incapazes de evitar a zona de choque (Figura 4D). Em ambos os casos, esses mapas de rastreamento representam o último dia de aquisição. O mouse na Figura 4C recebeu apenas 2 choques, representados pelos dois círculos. Além disso, observe que o mapa de rastreamento mostra o mouse passando a maior parte do tempo no lado oposto da zona de choque, que é representada pela cunha vermelha. Por outro lado, o camundongo na Figura 4D recebeu mais choques e o mapa de rastreamento revela um padrão desordenado. Exemplos de camundongos que são incapazes de aprender com sucesso a evitar a zona de choque são aqueles que reduziram a neurogênese do hipocampo devido à idade avançada, como mostrado pelos camundongos de 18 meses (Figura 4A, B- modificada de Blackmore et al., 20217), ablação química de neurônios imaturos6 ou lesões do hipocampo (ver Codd et al., 2020)8.
É importante distinguir entre uma tentativa malsucedida devido à falha do mouse em aprender e uma falha na configuração do equipamento. As duas causas mais comuns de resultados ruins devido à falha do equipamento são o rastreamento inadequado do mouse (Figura 5A) ou o mouse não receber um choque. O rastreamento ruim pode impedir que o mouse receba um choque quando estiver na zona de choque. Alternativamente, o rastreamento ruim pode induzir um choque de forma imprecisa quando o mouse não está na zona. Em ambos os casos, isso impedirá que o mouse desenvolva uma estratégia eficaz de evitação. O rastreamento ruim pode ser resolvido ajustando o limite na guia "Do calibrador". O rastreamento ruim é normalmente definido como mais de 1000 quadros inválidos durante um período de 10 minutos e ocorre muito raramente. O rastreamento deficiente pode se tornar um problema com camundongos idosos, onde a alopecia pode se desenvolver. Ao receber um choque, o mouse reagirá tensionando ou, ocasionalmente, vocalizando. O mouse normalmente se move, mesmo que ligeiramente, e pode ser visto no software de rastreamento ao vivo. Quando o mouse ficar perfeitamente imóvel dentro da zona de choque, uma linha clara de choques será mostrada (Figura 5B). Isso pode ser devido à caixa de choque não estar ligada ou ao scat preso entre as barras, reduzindo a amplitude do choque aplicado ao animal.
Figura 1: Aparelho APA, sala de comportamento e configuração da zona de choque. (A) Um exemplo da arena de teste e configuração da sala. O aparelho APA é elevado e colocado no centro da sala, cercado por novas pistas visuais. Dicas visuais em preto e branco são usadas na mesma altura da plataforma. (B). A função Alvo na guia Experimento permite o mascaramento de toda a arena e cria um local da zona de choque. Uma zona de choque, representada pela cunha vermelha, foi criada a 270° neste exemplo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Configuração da APA para cepas de camundongos albinos. A arena APA pode ser configurada para linhagens albinas de camundongos, como BALB/c, selecionando a opção Light na guia Tracking e criando um fundo de arena preto. Um mouse albino em um fundo preto atinge alto contraste e oferece melhor rastreamento do mouse. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Ajustar o limite para rastreamento do mouse é essencial. O limiar deve ser ajustado de forma adequada para garantir um bom acompanhamento dos animais durante o ensaio. O limite é ajustado movendo a linha vermelha no painel de limite na guia Do calibrador . (A) Um exemplo de uma boa seleção de limite com uma região laranja sólida e um X azul no objeto. (B) Um limite ruim com laranja salpicado. O rastreamento deficiente leva à perda de um animal na arena ou impede que o rato receba um choque quando estiver na zona de choque. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Comparação do desempenho entre camundongos jovens (10 semanas) e mais velhos (18 meses) em um paradigma de aprendizado de 5 dias e mapas Trace. (A) Os camundongos de 10 semanas receberam significativamente menos choques em comparação com os camundongos de 18 meses durante 5 dias de teste; Observe que a diferença no número de choques recebidos foi mínima no primeiro dia de testes entre os grupos, mas camundongos jovens com memória intacta aprenderam a evitar a entrada na zona de choque mais rapidamente do que o grupo mais velho. (B) O tempo máximo de prevenção foi calculado como o tempo máximo gasto evitando o choque durante o teste de 10 minutos. Os camundongos mais jovens aprenderam rapidamente a evitar a entrada na zona de choque em comparação com os camundongos mais velhos, sugerindo que os camundongos jovens estão aprendendo de forma eficaz. (C) O camundongo neste mapa de rastreamento recebeu apenas dois choques, conforme representado pelos dois círculos neste teste de aquisição. Este rato também passou mais tempo na arena oposta à zona de choque, que é representada pela cunha vermelha. (D) Este camundongo recebeu mais choques e passou mais tempo perto da zona de choque, sugerindo que o aprendizado espacial não foi alcançado neste camundongo. ANOVA de medida repetida de duas vias com testes post hoc de Bonferroni foram usados para testar a significância. p<0,0001. Os painéis A e B foram modificados a partir de Blackmore et al.7. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Os mapas de rastreamento fornecem informações importantes para cada camundongo durante cada tentativa. (A) Observe as linhas retas que estão presentes neste exemplo de rastreamento. Isso ocorre porque o software de rastreamento identificou incorretamente um mouse durante a tarefa. (B) Um exemplo de bom rastreamento durante o julgamento. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Visualização de rastreamento e mapa de calor em diferentes programas de rastreamento de animais. Tanto o (A) Programa 1 quanto o (B) Programa 2 detectam a localização e o movimento do animal para criar gráficos de trilha para inspecionar visualmente se o animal aprende a tarefa ou o efeito do tratamento experimental. Ambos os programas mostram gráficos de trilhas idênticos de um animal que aprendeu a tarefa com eficiência. (C) Também pode ser criado um mapa de calor, o que facilita a identificação de hotspots e o agrupamento dos pontos de dados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
Em conclusão, o teste de evitação de lugar ativo é uma tarefa de aprendizado espacial eficaz que pode ser usada em uma variedade de linhagens de camundongos e condições experimentais. A tarefa APA supera as limitações associadas a outros paradigmas de aprendizagem espacial14, como o MWM, que é estressante para os camundongos medidos pelos níveis de cortisol9. O MWM também é inadequado para camundongos idosos, onde eles flutuam durante a tarefa10. Embora outros testes de aprendizado espacial, como o labirinto de Barnes e o teste de localização de novos objetos, sejam menos estressantes, eles são limitados pela frequência com que os testes repetidos podem ser realizados na mesma coorte de camundongos. Portanto, a principal vantagem da tarefa APA é que ela pode ser usada várias vezes, pois vários parâmetros podem ser ajustados para manter a novidade. De fato, usamos a tarefa APA até 5 vezes na mesma coorte de camundongos para examinar o efeito da ablação do hipocampo e o efeito subsequente do exercício8. Em cada caso, os parâmetros, incluindo a rotação da arena, a zona de choque e as pistas espaciais, foram alterados entre os testes. Isso foi eficaz para garantir que os camundongos usassem dicas de navegação espacial para reaprender a tarefa, conforme evidenciado pelos animais de controle, começando com um grande número de choques e diminuindo durante os dias de teste subsequentes para cada período de teste8. Normalmente, no final de um paradigma de teste de 5 dias, consideramos que qualquer animal que recebeu mais de 10 choques no último dia ou tem uma evitação máxima de menos de 60 s não aprendeu o paradigma.
Além da capacidade de modificar facilmente as configurações para permitir várias rodadas de testes espaciais, a tarefa APA garante que os mouses usem a navegação espacial para evitar efetivamente a zona de choque. Por exemplo, os animais devem usar pistas externas para localizar e evitar entrar na zona de choque estacionária navegando para longe dela5. Como a arena está girando, os animais não são capazes de usar uma abordagem idiotética para navegação, nem podem usar pistas exteroceptivas, como odor, porque essas pistas giram com a arena enquanto a zona de choque e as pistas espaciais permanecem estacionárias5.
Também é importante garantir que os camundongos estejam adequadamente habituados à arena do pesquisador e da APA. A intensidade do choque do pé também precisa ser otimizada, pois tanto a intensidade do choque muito baixa quanto a muito alta podem comprometer a capacidade dos camundongos de aprender e realizar a tarefa5. A intensidade do choque é normalmente definida para 0.5 mA e não deve exceder 0.7 mA. Para animais que têm maior comportamento semelhante à ansiedade, considere reduzir a intensidade da luz e a intensidade do choque nas patas. O aumento da ansiedade durante a tarefa APA pode se apresentar como salto excessivo, corrida descontrolada dentro da arena ou congelamento prolongado. O protocolo aqui descrito utilizou uma intensidade de choque de 0,5 mA, a mesma intensidade que foi usada anteriormente com BALB/c, que é conhecido por ter maior comportamento semelhante à ansiedade15.
Aqui, descrevemos o software de rastreamento de animais fornecido pela empresa que forneceu o equipamento de prevenção de local ativo usado. O software alternativo de rastreamento de vídeo também é adequado para analisar o desempenho comportamental. Esses programas também podem medir e analisar com precisão o desempenho do mouse durante as tarefas da APA. Esses programas permitem a criação de várias zonas e locais dentro da arena da APA para avaliar o comportamento. A configuração da arena para um APA consiste em uma zona de choque triangular, onde o número de entradas, o tempo para entrar pela primeira vez e o tempo gasto na zona de choque são medidos. Zonas adicionais também podem ser adicionadas dentro da arena. Por exemplo, podemos adicionar uma zona central ou uma zona oposta à zona de choque para medir o tempo gasto e a distância percorrida nessas zonas como uma estratégia animal para evitar a zona aversiva. Esses programas rastreiam o centro de massa do mouse, que é salvo e exibido acima do quadro de referência para inspeção visual (Figura 6A, B). Por fim, também é possível criar um mapa de calor de densidade para o desempenho individual e em grupo (Figura 6C).
Ao conduzir a tarefa APA, há possíveis problemas que precisam ser resolvidos. Ocasionalmente, os camundongos precisarão ser excluídos da análise devido à falta de resposta à zona de choque. Como sempre, a exclusão só deve ser considerada quando atender a condições discrepantes predefinidas, por exemplo, ficando fora de 2 desvios padrão da média. Tarefas comportamentais complexas, como a APA, normalmente exigem altos valores de N dos animais. Sugerimos a realização de uma análise de poder para calcular o tamanho da amostra apropriada antes de realizar a APA. Isso dependerá da cepa usada e dos grupos de tratamento. Por experiência, descobrimos que um valor n de 10 ou mais para cada grupo fornece energia suficiente ao conduzir experimentos de APA. O principal problema com essa tarefa é garantir o rastreamento de alta qualidade do mouse durante a tarefa. O estágio de habituação da tarefa deve ser usado para confirmar que isso está ocorrendo. Os ratos que não respondem a um choque geralmente são devidos a fezes entre as barras da grade. É, portanto, essencial limpar o equipamento após cada animal e remover qualquer fezes ou urina. Isso também reduzirá o estresse para os animais que seguem. A tarefa APA normalmente envolve um paradigma de 5 dias, o que pode apresentar algumas limitações para estudos envolvendo intervenções efetivas em menos de 5 dias; no entanto, a memória de curto prazo ou a aquisição de aprendizagem espacial ainda podem ser avaliadas para esses estudos usando a abordagem de sessão única de 30 minutos.
Em resumo, este artigo fornece uma descrição detalhada de como configurar e usar o paradigma de evitação de lugar ativo para testar o aprendizado espacial de camundongos. A capacidade de alterar as condições para que várias linhagens de camundongos de cores variadas possam ser testadas é uma vantagem distinta sobre outros testes espaciais mais tradicionais, como o MWM. Além disso, a modificação de vários parâmetros permite a repetição de testes para que as mudanças no aprendizado espacial possam ser comparadas com precisão durante vários paradigmas experimentais ou durante o envelhecimento fisiológico. Em um curto período de tempo, o teste APA demonstrou ser uma alternativa precisa e eficaz para o aprendizado espacial dependente do hipocampo. No futuro, a tarefa APA pode ser usada como um método confiável para avaliar intervenções terapêuticas ou de exercícios no comportamento cognitivo e espacial em camundongos selvagens e transgênicos.
Disclosures
Os autores não têm nada a divulgar.
Acknowledgments
Agradecemos ao Queensland Brain Institute (QBI) Animal Behavior Facility pelo desenvolvimento e manutenção do aparelho descrito neste manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Constant Current Source CS02 | BioSignal Group | N/A | Acton, Massachusetts, United States |
| Control Box | BioSignal Group | N/A | Acton, Massachusetts, United States |
| Ethovision | Noldus | version 16 | Wageningen, Netherlands |
| Shock Scrambler | BioSignal Group | N/A | Acton, Massachusetts, United States |
| Track Analysis | BioSignal Group | version 2.2 | Acton, Massachusetts, United States |
| Tracker Programme | BioSignal Group | version: 2.36 | Acton, Massachusetts, United States |
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