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方法文章

利用高维单细胞质谱流式技术在急性骨骼肌损伤过程中体内鉴定与分析成肌祖细胞

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DOI：

10.3791/65944

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2023年12月1日

 ,  ,  , 
1Department of Biomedicine, Aarhus University, 2Aarhus Institute of Advanced Studies, Aarhus University

本文内容

摘要

本文所述方案可通过单细胞质谱流式细胞术对肌肉干细胞和祖细胞进行鉴定和高维分析，并通过荧光激活细胞分选（FACS）对其进行纯化，以深入研究其功能。该方法可用于研究疾病模型中的再生动态，并评估药物干预的效果。

摘要

骨骼肌再生是由成体肌肉干细胞及其子代细胞驱动的动态过程。在稳态下，成体肌肉干细胞大多处于静息状态，但在肌肉损伤后会被激活。激活后，这些细胞开始增殖，其大部分子代细胞分化为具有融合能力的肌细胞，而其余部分则通过自我更新以补充干细胞库。尽管肌肉干细胞的身份早在十余年前即已通过细胞表面标志物的共表达得以确定，但肌源性前体细胞直到最近才借助高维单细胞技术被鉴定出来。本文介绍一种单细胞质谱流式技术（飞行时间质谱流式，CyTOF），用于分析急性肌肉损伤中的干细胞与前体细胞，以解析肌肉再生过程中发生的细胞与分子动态变化。该方法基于同时检测新型细胞表面标志物和关键的肌源性转录因子，这些因子的动态表达有助于识别处于激活状态的干细胞及前体细胞群体，从而揭示肌生成过程中的关键节点。尤为重要的是，本文描述了一种基于检测细胞表面标志物CD9和CD104的分选策略，可利用荧光激活细胞分选（FACS）对肌肉干细胞和前体细胞进行前瞻性分离，以便深入研究其功能。肌肉前体细胞为研究肌肉干细胞命运调控、发现肌肉疾病的新治疗靶点以及开发再生医学中的细胞治疗应用提供了关键的缺失环节。本文所提出的方法可用于研究肌肉干细胞与前体细胞 体内 在应对特定信号通路的药理学干预等扰动时，该方法可用于研究肌肉疾病动物模型中肌肉干细胞与前体细胞的动态变化，从而加深对干细胞相关疾病的理解，并加速治疗策略的开发。

引言

骨骼肌是人体中质量最大的组织，调控多种功能，从视力到呼吸，从姿势维持到运动，以及新陈代谢1。因此，维持骨骼肌的完整性和功能对健康至关重要。骨骼肌组织由紧密排列的多核肌纤维束构成，肌纤维周围分布着复杂的神经和血管网络，具有显著的再生潜能1,2。

骨骼肌再生的主要驱动因素是成体肌肉干细胞（MuSCs）。由于其独特的解剖位置位于肌纤维质膜旁且基底膜下方，这类细胞也被称为卫星细胞，于1961年首次被发现3。MuSCs表达一种独特的分子标志物——转录因子Pax7（paired box 7）4。在健康成人体内，这些细胞大多处于静息状态，但在肌肉损伤后会被激活，增殖并产生子代细胞，这些子代细胞将（i）分化为具有融合能力的肌细胞，形成新的肌纤维以修复肌肉损伤，或（ii）自我更新以补充干细胞库5。

在细胞和分子水平上，再生过程具有高度动态性，涉及细胞状态的转变，其特征是关键成肌转录因子（也称为成肌调节因子，MRFs）的协调表达。6,7之前 体内 发育研究、谱系示踪实验以及利用成肌细胞进行的细胞培养工作 研究表明，这些转录因子的顺序表达可驱动成肌作用：成肌因子5（Myf5）在细胞激活时表达，成肌分化因子1（MyoD1）的表达标志着向成肌程序的定向，而肌源性生成素（MyoG）的表达则标志着细胞分化8,9,10,11,12,13,14尽管已有这些认知以及发现可用于纯化肌肉干细胞（MuSCs）的细胞表面标志物，但仍缺乏有效的策略和工具来鉴定和分离肌源性分化途径中各个明确的细胞群体，并解析肌源性发育的连续过程 体内 一直缺乏15,16,17,18.

在此，我们介绍一种基于近期已发表研究的创新方法，该方法能够识别骨骼肌中的干细胞和前体细胞，并分析其在急性肌肉损伤背景下的细胞、分子及增殖动态。19. 该方法依赖于单细胞质谱流式技术（又称飞行时间质谱流式细胞术 [CyTOF]），可同时检测关键的细胞表面标志物（α7 整合素、CD9、CD44、CD98 和 CD104）、细胞内成肌转录因子（Pax7、Myf5、MyoD 和 MyoG）以及核苷类似物（5-碘-2′-脱氧尿苷，IdU），用于监测处于 S 期的细胞19,20,21,22,23此外，该方案提出了一种基于检测两种细胞表面标志物CD9和CD104的策略，通过荧光激活细胞分选（FACS）来纯化这些细胞群体，从而为今后深入研究其在损伤及肌肉疾病背景下的功能提供了可能。尽管原代成肌细胞在过去已被广泛用于研究成肌分化后期阶段 体外目前尚不清楚它们是否重现了体内肌肉前体细胞的分子状态 体内24,25,26,27,28,29,30成肌细胞的制备过程繁琐且耗时，且该原代培养物的分子状态在传代过程中迅速改变。31因此，通过该方法分离纯化的原代肌源性前体细胞将为研究肌生成过程以及遗传或药物干预的影响提供一个更接近生理状态的实验体系 离体.

本方案可用于解决多种研究问题，例如研究肌源性区室的动力学变化 体内 在肌肉疾病的动物模型中，针对急性基因操作或药物干预的反应，从而加深我们对不同生物学背景下肌肉干细胞功能障碍的理解，并促进新型治疗干预措施的开发。

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方案

动物实验已获得丹麦动物实验监察局批准（方案编号 # 2022-15-0201-01293），并按照奥胡斯大学的机构指南进行。在损伤前24小时，将镇痛药（布托啡诺）加入饮水中，使小鼠适应其味道。损伤后继续在饮水中提供布托啡诺24小时。在急性肌肉损伤时，联合皮下（s.c.）注射布托啡诺，并在注射竹节蛇毒蛋白（notexin）后继续通过饮水给予布托啡诺，可缓解与损伤相关的疼痛。尽管建议在急性肌肉损伤时给予皮下注射布托啡诺，随后通过饮水给予布托啡诺，但损伤前通过饮水给予布托啡诺为可选步骤。然而，研究人员必须遵守相应监管机构制定的动物福利标准和指南。

注意：对于受损后肢肌肉的单细胞质谱流式细胞术（CyTOF）实验，应从第1节开始：在肌肉损伤前24小时至损伤后24小时期间，通过饮水给予镇痛处理。对于从未受伤小鼠中分选肌肉干细胞和前体细胞，需执行第5和第6节：安乐死及骨骼肌的分离与解离，并继续进行第11节：使用荧光素偶联抗体进行FACS染色。 实验设计与操作流程的总体概述见图1。

1. 肌肉损伤前24小时至损伤后24小时期间在水中进行镇痛处理

  1. 向一个避光或用铝箔包裹的饮水瓶中加入 3 mL 丁丙诺啡（0.3 mg/mL），再用过滤水定容至 100 mL，使终浓度为 0.009 mg/mL，在损伤前 24 小时给予。将饮水瓶连接至小鼠笼具。
  2. 损伤后 24 小时移除饮水瓶，并将小鼠笼具重新连接至饮水阀系统。

2. 急性损伤操作的准备工作

注意：使用70%乙醇对工作台、鼻锥装置和诱导箱进行消毒。

  1. 准备一个1.5 mL离心管，内含用PBS稀释的notexin（5 µg/mL）。在避光的1.5 mL离心管中，将丁丙诺啡（0.3 mg/mL）用无菌0.9%生理盐水稀释至0.015 mg/mL。置于冰上保存。准备用于丁丙诺啡注射的胰岛素注射器（28 G，0.5 mL）和用于notexin注射的胰岛素注射器（29 G，0.3 mL）。
  2. 配置基于异氟烷的麻醉装置：
    1. 在诱导箱中进行麻醉时，使用3%异氟烷，气体流速为1.5 L/min（50% O2，50%大气空气）。
    2. 使用鼻罩装置进行维持麻醉时，使用1.5%异氟烷，气体流速为0.6 L/min（50% O2，50%大气空气）。

3. 通过注射notexin造成急性损伤

警告：Notexin 具有磷脂酶 A2 活性，是澳大利亚虎蛇（Notechis scutatus）毒液的主要成分，在小鼠中的静脉注射半数致死量（LD50）为 5–17 mg notexin/kg32,33。在本实验方案中，每侧后肢的胫骨前肌（TA）注射 10 µL 浓度为 5 mg/mL 的 notexin，每侧后肢的腓肠肌（GA）分两次注射（每次注射肌肉的一个头），每次 15 µL 浓度为 5 mg/mL 的 notexin。正确实施肌肉内（i.m.）注射至关重要，以尽量减少组织损伤，并需频繁检查注射后的动物，确保其疼痛程度最小化。

  1. 将小鼠放入诱导箱中进行麻醉（3% 异氟烷）。当小鼠失去意识后，将诱导箱中的异氟烷浓度降至 1.5%。
  2. 根据机构批准的操作规程，称重并单独标记每只小鼠。在鼻罩装置下，使用修剪器剃除后肢毛发，然后将其放回诱导箱中。
  3. 计算每只小鼠的布托啡诺用量：体积计算公式，用于根据体重通过质量换算确定体积（µL）的方程。
  4. 通过反复吹打混匀notexin溶液。准备2支胰岛素注射器（29 G，0.3 mL），每支装有10 µL notexin溶液（5 µg/mL），用于胫骨前肌（TA）注射；另准备4支胰岛素注射器，每支装有15 µL notexin溶液（5 µg/mL），用于腓肠肌（GA）注射。
    注意：胫骨前肌（TA）位于小鼠后肢前侧，从膝部延伸至踝部。腓肠肌（GA）为双头肌肉，位于后肢后侧，位于比目鱼肌浅层，从其两个头（内侧头和外侧头）靠近膝部上方起始，延伸至足跟，跨越三个关节（膝关节、踝关节和距下关节）。
  5. 进行肌肉内注射
    1. TA注射（共2次注射）
      1. 将小鼠置于鼻罩装置下，呈仰卧位，用无菌酒精棉片（70%乙醇或异丙醇）消毒注射部位。将针头斜面朝下，以30°角插入TA肌腹（中段肌腹远端）。沿肌肉推进针头，使其与胫骨平行，到达TA肌的中段肌腹。缓慢且持续地注射notexin，在拔出针头前保持针头原位10秒。初始插入时切勿过深（以避免将notexin注入TA肌下方的趾长伸肌），推进针头时也切勿过于靠近近端（以避免注射位置过于接近膝部）。
    2. GA注射（共4次注射）
      1. 将针头斜面朝下，以约45°角插入GA肌外侧头的中段肌腹。缓慢且持续地注射notexin，在拔出针头前保持针头原位10秒。旋转后肢，按照上述方法对GA肌内侧头进行注射。应注意避免将针头插入过深。
  6. 将小鼠翻转，使用胰岛素注射器（28 G，0.5 mL）皮下注射布托啡诺。将小鼠转移至加热板上的空恢复笼中。仅将笼底的一半置于加热板上，以便小鼠在恢复期间能够自主调节体温34。对剩余小鼠重复步骤3.3–3.6。
  7. 当恢复笼中的小鼠完全清醒后，将其移回原始笼中。将其送回动物房，并提供湿润饲料。在注射后24小时移除布托啡诺饮水瓶。
  8. 在notexin注射后监测小鼠6小时，随后每12小时监测一次，持续2天，观察疼痛、活动能力受损及摄食量减少等表现35,36。

4. 5-碘-2'-脱氧尿苷注射

警告：5-碘-2'-脱氧尿苷（IdU）可能引起遗传缺陷，并对生育能力或未出生胎儿造成损害。操作前请阅读安全数据表（SDS）。操作时应穿戴个人防护装备。称量 IdU 粉末时应在通风橱中进行。接触过 IdU 的材料应根据当地安全规定进行废弃处理。

注意：IdU 标记 体内 用于监测损伤时间过程中细胞分裂，因为碘代脱氧尿苷（IdU）作为一种碘化胸苷类似物，可掺入处于S期细胞的DNA中。在处死小鼠前8小时，以20 mg/kg体重剂量经腹腔注射（i.p.）给予IdU。

  1. 使用超声波破碎仪在 37 °C 下将 IdU 溶于无菌 PBS 中，配制浓度为 2 mg/mL 的储存液。IdU 对光敏感，需当日使用，或于 -20 °C 冻存最多 3 个月。若使用冻存的 IdU：解冻后涡旋混匀，以 10,000 × g 离心 30 秒，取上清液用于后续注射。
  2. 将小鼠置于诱导箱中麻醉（异氟烷浓度为 3%）。记录耳标信息，称量小鼠体重，并计算 IdU 溶液注射体积：微克单位下的体积计算公式：(体重(g) × 20μg/g)/(2μg/μL) = 体积(μL)。
  3. 使用胰岛素注射器（28 G，0.5 mL）进行腹腔注射，并将小鼠转移至加热板上的空恢复笼中。待小鼠清醒后，将其放回原笼。对剩余小鼠重复步骤 4.2–4.3，并将其送回动物房饲养。

5. 安乐死

注意：缓冲液配方见表1。配制洗涤液（Ham's F-10 营养混合物，10% 马血清，1×青霉素-链霉素），并通过聚醚砜（PES）膜过滤至聚苯乙烯容器中。配制消化缓冲液（在洗涤液中添加 650 U/mL II 型胶原酶），并置于冰上保存。CyTOF 质谱流式细胞术检测对污染物极为敏感。因此，样品处理过程中必须使用最高分析纯度的试剂。为防止金属污染，建议使用无菌塑料器皿以及从未用洗涤剂清洗过的新玻璃器皿，因为许多实验室用皂含有较高浓度的钡。建议使用经双重过滤的蒸馏去离子水配制试剂。磷酸盐缓冲液（PBS）为实验室自制，将 10× 储存液稀释至 1× 后，用 0.2 μm 滤膜过滤。每次实验开始前需再次过滤 1× PBS。由于钡的存在，解剖器械不得使用洗涤剂清洗。

  1. 准备电子天平、容器以及带有诱导箱的异氟烷麻醉装置。对合适的解剖器械进行消毒。
  2. 为每只小鼠准备并标记含有5 mL消化缓冲液的50 mL离心管，并准备好培养皿。将消化缓冲液置于冰上保存。
  3. 在诱导箱中使用异氟烷（3%浓度诱导，意识丧失后增至5%）麻醉小鼠，随后实施颈椎脱臼处死。

6. 骨骼肌解剖与解离

  1. 解剖双侧后肢的胫骨前肌（TA）和腓肠肌（GA），转移至培养皿盖中。使用剪刀将组织剪成细碎浆状（约 1 mm3 大小的组织块），转移至含有 5 mL 冰冷解离缓冲液的 50 mL 离心管中，置于冰上保存。
  2. 重复安乐死操作（步骤 5.3）以及骨骼肌解剖与解离操作（步骤 6.1），直至所有小鼠均处理完毕。
  3. 将所有样本管在 37 °C 水浴中预热（2 分钟），然后在旋转培养箱中 37 °C 孵育 45 分钟。
  4. 涡旋振荡，并加入 10 mL 洗涤液进行洗涤。离心（380 × g，10 分钟，室温 [RT]），弃上清液至剩余 4 mL。
  5. 加入 0.5 mL 胶原酶（1000 U/mL）和 0.5 mL 中性蛋白酶（dispase，11 U/mL）。涡旋混匀后，在 37 °C 旋转条件下孵育 20 分钟（例如置于培养箱中）。离心（380 × g，1 分钟，室温），用 5 mL 移液器重悬细胞沉淀。
  6. 将 40 µm 细胞筛网置于 50 mL 离心管上，并用 5 mL 洗涤液预润湿。使用带 20 G 针头的 5 mL 注射器吸取细胞悬液并吹打 10 次。将细胞悬液经预润湿的 40 µm 细胞筛网过滤。用 10 mL 洗涤液冲洗 50 mL 离心管，将冲洗液转移至 40 µm 细胞筛网，然后离心（380 × g，10 分钟，4 °C）收集细胞。

7. 使用顺铂进行活/死染色及多聚甲醛固定

警告：顺铂和多聚甲醛（PFA）具有致癌性。操作前请阅读安全数据说明书（SDS）。多聚甲醛（PFA；16%）对皮肤、眼睛和呼吸道具有刺激性。操作时应佩戴个人防护装备，并在通风橱中进行。细胞固定过程中，PFA 的终浓度为 1.6%。应采取适当的防护措施，废弃物须根据当地法规进行处理。

注意：准备冷的（4 °C）无血清 DMEM 和温的（37 °C）无血清 DMEM。将添加了 10% FBS 的 DMEM 通过 PES 膜过滤至聚苯乙烯容器中，并置于冰上保存。在专用于 CyTOF 的玻璃瓶中配制 PBS 和细胞染色缓冲液（CSM；PBS、0.5% BSA、0.02% 叠氮化钠），并通过 PES 膜过滤。CSM 可在 4 °C 下保存长达 6 个月。

  1. 吸弃上清液，轻弹沉淀，用 1 mL 冷的无血清 DMEM 重悬。计数细胞，并用无血清 DMEM 调整细胞密度至 1 × 106 个细胞/mL。
  2. 加入顺铂储备液（25 mM），使其终浓度为 25 µM。涡旋 10 秒，准确孵育 1 分钟（该反应对时间极为敏感）。用冰浴预冷的含 10% FBS 的 DMEM（体积为样品体积的 3 倍）终止反应，并将样品置于冰上。离心（380 × g，10 分钟，4 °C），吸弃上清液，充分重悬沉淀（在 CSM 中重悬至最多 10 × 106 个细胞/mL）。通过 35 µm 细胞筛过滤悬液。
  3. 用过滤后的 PFA 储备液（16%）固定细胞悬液，并通过上下吹打（在通风橱内操作）使 PFA 终浓度达到 1.6%（例如，向 900 µL 细胞悬液中加入 100 µL 16% PFA）。涡旋 30 秒，在冰上孵育 10 分钟，然后用 2 mL CSM 洗涤两次，每次离心（800 × g，5 分钟，室温）。
    注意：此时样品可立即在干冰上速冻并保存于 -80 °C，或直接用于抗体染色。若需冷冻细胞，请将细胞转移至 5 mL 聚丙烯管中，因为聚苯乙烯管在低温下可能破裂。若使用新鲜固定的细胞进行染色，请继续执行步骤 8.2。

8. 使用金属偶联抗体进行染色

警告：甲醇（MeOH）具有高度易燃性，且对呼吸道具有腐蚀性。操作前请阅读安全数据表（SDS）。佩戴个人防护装备，并在通风橱中操作该物质。废弃物应按照当地法规进行处理。

注意：针对表面标志物和细胞内标志物的抗体（Ab）列表见表2。

抗体偶联：本方案中使用的大多数抗体均为实验室自行偶联，因为这些抗体无法商业获取。金属偶联抗体的操作流程已有文献报道，目前也有商业化偶联试剂盒可供使用37,38。免疫球蛋白G（IgG）类型抗体适用于现有的偶联方法。用于金属偶联的抗体制剂必须不含含半胱氨酸的载体蛋白（例如牛血清白蛋白（BSA）），因为这些蛋白会与聚合物上的游离马来酰亚胺基团竞争，影响偶联效率，并可能干扰金属偶联抗体的定量分析。明胶中的半胱氨酸含量远低于BSA。然而，建议如果抗体制剂中含有载体蛋白，则应在偶联前将其去除。目前可向生产商定制不含BSA和明胶的抗体。小分子防腐剂（例如叠氮化钠、甘油和海藻糖）不影响金属偶联反应，可与金属偶联方案兼容37,38。

抗体滴定：每次金属偶联后，应对抗体进行滴定，以确定可提供最佳信噪比的最适抗体浓度。进行抗体滴定时，需进行6步两倍倍比稀释，并同时对已知表达目标蛋白的样本（如肌细胞，阳性对照）和不表达目标蛋白的样本（阴性对照）进行染色19,21,37,38。

通过将原液用 PBS/1.6% PFA 稀释至 0.1 μM，配制新鲜的 Cell-ID Intercalator-Ir（原液浓度 = 500 μM；intercalator-ir 溶液）工作液。

  1. 将冻存样品在室温下解冻5分钟，离心（800 × g，1分钟，室温）。用2 mL CSM重悬，离心（800 × g，5分钟，室温）。 
  2. 在 CSM 中配制 2.5x 表面抗体（Ab）染色混合液。吸除上清液至约60 µL 并充分重悬沉淀。通过加入染色剂对细胞进行染色 40 µL 表面抗体染色混合物，室温孵育1小时。 
  3. 每20分钟轻敲样品管以混匀。用1 mL CSM溶液通过离心洗涤两次（800 × g，5 min，室温）。吸除上清液，轻敲沉淀物。 
    注意：如果不需要进行细胞内染色，则无需甲醇透化。然而，如果仅进行表面染色，则必须将Intercalator-ir溶液稀释在含有透化剂的缓冲液中（例如Maxpar fix and perm buffer），以穿透核膜。此时请进入步骤8.5，将Cell-ID Intercalator-Ir稀释在含有透化剂和1.6% PFA的缓冲液中。否则，请继续进行以下细胞内染色步骤。
    警告：铱具有危害性，必须采取安全操作预防措施。铱易燃，对眼睛/皮肤具有刺激性。避免产生并吸入粉尘或烟雾。避免与皮肤和眼睛接触。然而，嵌入剂-铱溶液混合物的提供浓度为 <1% 的水溶液，根据化学品分类和标签全球协调系统（GHS）被视为非危险物质。操作前请阅读Standard Biotools提供的安全数据表（SDS）。操作时应佩戴个人防护装备。接触过嵌入剂-ir溶液的材料应根据当地安全法规进行处置。
  4. 为了透化细胞，边涡旋边逐滴加入0.5 mL预冷的甲醇。在冰上孵育15分钟，置于通风橱内。离心（800 × g，5分钟，室温），然后用1 mL CSM洗涤两次，每次洗涤均通过离心（800 × g，5分钟，室温）完成。最后一次洗涤后，吸除上清液至约60 µL 并充分重悬沉淀。
  5. 在CSM中配制2.5倍浓度的胞内抗体染色液。通过加入该染色液对细胞进行染色 40 µL 加入细胞内Ab染色混合液，室温孵育1 h。每20 min轻弹样品管以混匀。
  6. 以1 mL CSM溶液通过离心洗涤两次（800 × g，5 min，室温）。吸除上清液后轻弹管底沉淀。将样品重悬于0.5 mL嵌入剂-铱溶液中（表1）并涡旋。将样品在室温下孵育1小时，或在4℃过夜（O/N） 4 °C （见下文注释）。
    注意：样品可在嵌入剂-铱溶液中保存 4 °C 最长可保存48小时。本研究中使用的染色方案基于Nolan实验室的开创性工作{C}23进行开发，与Standard Biotools的标准方案有所不同，主要差异包括：（i）使用实验室自制缓冲液进行洗涤和染色，（ii）在表面抗原染色前先对细胞进行固定，（iii）采用甲醇对细胞进行透化处理，以便使用针对转录因子或信号分子的抗体进行胞内染色。研究人员在开发新方案时，必须充分验证其抗体组合与甲醇作为透化试剂的兼容性。在向抗体组合中添加新抗体时，建议在进行金属标记和滴定之前，先利用阳性和阴性对照样本通过流式细胞术检测抗体的特异性。

9. 质谱流式细胞仪上样前的样品制备

注意：在 CAS 缓冲液（材料表）中，细胞沉淀非常松散。用 CAS 缓冲液洗涤时，切勿将液体完全吸干。应如下所述保留一定残余体积。

  1. 涡旋并离心（800 x g，10 分钟，室温）处理样品。倒掉上清液（按 PFA 废物处理）并涡旋。
  2. 通过离心（800 x g）用1 mL CSM洗涤 g，10 分钟，室温）。吸去上清液并轻弹沉淀。
  3. 用1 mL CAS缓冲液通过离心洗涤（800 × g，10 min，室温）。吸弃上清至约~200 µL涡旋并加入1 mL CAS缓冲液。取出 5 µL 分装用于细胞计数。离心（800 × g） g，10 分钟，室温）并小心抽吸至 ≤50 µL不要扰动沉淀。
  4. 重悬沉淀至 1–2 x 106 细胞/mL，加入校准微球（1倍； 材料表) 至终浓度为 0.1x（例如，加入 100 µL 1x 校准微球 900 µL 细胞悬液的量） 
  5. 将样品上机至质谱流式细胞仪，以每秒400–500个细胞的流速采集数据。
  6. 使用CyTOF软件或先前开发的归一化工具对FCS文件进行数据归一化39.
    注意：CyTOF 质谱流式细胞仪的操作因仪器型号而异40,41建议在操作前查阅CyTOF用户手册。校准珠为含有已知浓度金属同位素的金属掺杂聚苯乙烯标准化微球，所含同位素包括铈（140/142Ce）、铕（151/153Eu）、钬（165Ho）和镥（175/176Lu）。校准珠可用于监控仪器灵敏度，该灵敏度可能随时间发生变化，主要原因包括生物材料的积累以及等离子体电离效率随时间产生的波动。

10. CyTOF 数据分析

注意：对于后续分析，标准化的 FCS 文件可在本地进行分析，或上传至基于云的软件解决方案，如 Cytobank、Cell Engine、OMIQ 或 FCS Express42。

  1. 如有必要，将每个样本的单独 FCS 文件合并为一个文件。
  2. 通过门控选择铱（Iridium）嵌入染料阳性事件，以区分单个有核细胞与碎片或双联体细胞。
  3. 通过选择顺铂（cisplatin）阴性事件来门控活细胞。顺铂可共价结合细胞蛋白，对膜完整性受损的死亡和濒死细胞的标记程度高于活细胞43。
  4. 门控目标细胞群，例如肌源性细胞群（Live/CD45-/CD31-/Sca1-/α7整合素+/CD9+）（图 2A），并量化干细胞与前体细胞的相对比例。该方法需要预先了解细胞表面或细胞内标志物的表达情况，以定义各个细胞亚群。
  5. 为进行高维分析，以识别复杂细胞群体中先前未被认知的稀有细胞亚群，导出目标细胞群，并使用专为 CyTOF 数据分析开发的聚类算法44。
    注：先前研究采用 X-shift 算法，该算法在高维空间中利用加权 k 近邻密度估计（kNN-DE）方法，基于预设参数进行无监督聚类19。研究表明，X-shift 在识别稀有细胞群体方面具有高度有效性45。
  6. 进行 X-shift 分析时，请下载 vortex 软件包（来自 Nolan 实验室 GitHub 页面 [https://github.com/nolanlab/vortex]）和 64 位 Java46。操作说明请参见：https://github.com/nolanlab/vortex/wiki/Getting-Started。
  7. 将导出的细胞群上传至本地数据库，并设定聚类参数。用户可自定义的参数包括：(i) 用于聚类的标志物，(ii) k 值范围（例如 5 至 150），以及 (iii) 聚类步数。
    注：先前研究中，聚类标志物包括已知在肌肉干细胞中表达的表面标志物、通过高通量流式细胞术筛选肌肉细胞和成肌细胞所鉴定出的新表面标志物，以及已知可定义肌生成不同阶段的肌源性转录因子（TFs）。该方法成功识别出两个细胞表面标志物 CD9 和 CD104，其共表达模式可区分先前未被认知的前体细胞群体19。谨慎选择聚类标志物可帮助研究人员回答特定科学问题。例如，若需识别并随时间分析分裂中的细胞亚群，建议将 IdU 作为聚类标志物之一。X-shift 可在多个 k 值下进行聚类，并通过计算“肘点”自动识别产生最优聚类数量的 k 值，从而避免聚类不足或过度分割。建议计算肘点，并采用由最优 k 值定义的聚类结果进行数据可视化及后续分析。
  8. 为可视化 X-shift 聚类中各细胞群之间的空间关系，可执行力导向布局，生成一张二维图，其中聚类间的距离反映其在高维表型空间中标志物表达的相似性。通过逐个标志物对图谱进行着色，可发现新的细胞群并追踪其动态变化。建议在 Cytobank 或 Cell Engine 等软件中通过手动设门进行后续定量分析。
  9. 进行热图分析，以量化多个表面及细胞内蛋白在时间序列中的动态表达，并揭示新的趋势。
    注：在进行损伤时间序列实验时，可将所有时间点的数据合并聚类，生成再生过程的图谱。此外，也可将该图谱按各个时间点进行拆分，以追踪再生过程中细胞与分子动态的演变19。

11. 使用荧光染料偶联抗体进行 FACS 染色

注意：用于未染色单色对照和荧光减一（FMO）对照的细胞可来自额外小鼠的TA和GA组织，若有条件。或者，也可取股四头肌（大腿前侧上部肌肉），按照上述TA+GA组织的相同方法进行解离并消化成单细胞悬液，用于对照实验。配制FACS缓冲液（PBS，2.5% 小牛血清，2 mM EDTA），经PES膜过滤至聚苯乙烯容器中，置于冰上保存。FACS缓冲液可在4 °C保存最多1个月。用于FACS的抗体列表见表3。

  1. 制备谱系混合物。对每个对照进行染色 50 µL （含有约 3–5 x 105 细胞）。计算所需谱系混合抗体的用量，制备时增加20%–30%的体积余量。谱系混合抗体所用抗体的储存浓度为0.2 mg/mL。
    1. 在0.5 mL离心管中，加入抗-CD45 APC-Cy7、抗-CD31 APC-Cy7、抗-Sca1 APC-Cy7和抗-CD11b APC-Cy7，使其终浓度达到 1 µg/mL, 2.5 µg/mL, 2.5 µg/mL，以及 0.63 µg/mL分别。
  2. 配制全染液。将每个全染样品进行染色 500 µL （含有约 3–5 x 106 细胞）。所有染色混合液的配制体积需过量10%。
    1. 在1.5 mL离心管中，加入如上所述的谱系混合抗体 + anti-α7 整合素PE、抗CD9 APC和抗CD104 FITC，使其达到最终浓度 2 µg/mL, 1.2 µg/mL，以及 3 µg/mL分别。
  3. 配制含DAPI的FACS缓冲液：在10 mL FACS缓冲液中加入 1 µL 加入DAPI（储存液浓度 = 1 mg/mL），使终浓度为100 ng/mL。
    警告：DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐）被归类为可能的皮肤和呼吸道刺激物。然而，浓度为 <1% 被认为是非危险性的，依据 GHS 标准。操作前请阅读安全数据表（SDS）。操作时应佩戴个人防护装备。接触过 DAPI 的材料应根据当地安全法规进行处置。
  4. 重悬第6部分：骨骼肌解剖与解离所得细胞
    1. 对于全染色样本，将来自同一只小鼠的TA组和GA组重新悬浮 500 µL 加入FACS缓冲液，并转移至15 mL离心管中用于染色。
    2. 对照组请使用TA和GA组织或股四头肌组织。若仅使用1只小鼠作为对照，将细胞重悬于 750 µL FACS缓冲液中。若涉及多只小鼠，将每只小鼠的TA、GA或股四头肌组织分别重悬于 500 µL 加入FACS缓冲液，并从每个样本中取一部分合并为一个总体积为1 mL的样品。添加 50 µL 对照细胞（3–5 x 105 细胞）转移至5 mL聚丙烯管中用于染色。
  5. 如所述进行染色 表4 45 分钟 4 °C 在暗处。
  6. 用5 mL FACS缓冲液洗涤所有染色样本。用1 mL FACS缓冲液洗涤对照样本，然后离心（380 × g10 分钟， 4 °C).
  7. 将所有染色后的样品用 1 mL FACS 缓冲液 + DAPI 重悬。将对照样品用 300 µL 含或不含 DAPI 的 FACS 缓冲液。
  8. 保持细胞在 4 °C 避光直至使用配备4个激光器（405 nm、488 nm、561 nm、633 nm）的流式细胞仪进行分选。
  9. 在分选仪上运行对照样本和待测样本，并使用相关软件设置分选门。对于未染色/单色对照和FMO对照，记录1 x 104 以及 0.3–1 x 105 事件。对于全染色样本，记录多达 1 x 106 事件。根据下游实验的要求，对所有染色样本或所需部分进行分选。对于本实验所用的流式细胞仪（FACSAria III），进行分选时选择 纯度模式 使用70 mm喷嘴。
  10. 参见 图4 用于门控策略。
    1. 使用未染色和单色对照设置所有检测器的电压。
    2. 使用单色对照设置补偿矩阵。
    3. 使用FMO对照设置分选门。
  11. 将不同的肌肉干细胞和前体细胞群体分选至预冷的FACS缓冲液中。
  12. 离心机（380 × g） g，10 分钟， 4 °C重悬细胞群体于适当的缓冲液中，计数后继续进行后续分析。

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结果

本文介绍了采用该联合方法的实验设计概览，包括：（i）通过注射notexin构建急性损伤时间序列，利用高维CyTOF技术分析骨骼肌中干细胞与前体细胞的细胞及分子动态变化（图1，上图方案）；以及（ii）利用两种细胞表面标志物CD9和CD104对干细胞与前体细胞进行FACS分选，以分离这些细胞群体并深入研究其功能（图1，下图方案）。本研究所述实验均使用8至10周龄的雌性C57BL/6小鼠。

用于急性损伤过程中识别骨骼肌干细胞与祖细胞及其细胞与分子动态研究的CyTOF分析
我们重新分析了已公开发布的、通过注射notexin诱导急性损伤时间过程的CyTOF数据集，其中骨骼肌样本使用一组包含21种金属偶联的、适用于CyTOF的抗体进行染色19 (图2 和 图3

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讨论

骨骼肌再生是一个依赖成体干细胞功能的动态过程。尽管以往的研究主要关注肌肉干细胞在再生过程中的作用，但其子代细胞的功能 体内 由于缺乏用于识别和分离这些细胞群体的工具，该领域研究尚不充分15,16,17,18在此，我们介绍一种可同时鉴定并分离肌肉干细胞与前体细胞的方法 体内 在骨骼肌中，并解析其在急性肌肉损伤背景下的细胞与分子动态变化19.

本文介绍的方法结合了高维质谱流式细胞术（CyTOF）分析与细胞分选技术，为深入理解细胞状态转变如何驱动有效的组织再生提供了工具，并揭示了在衰老及肌肉疾病过程中干细胞功能的改变52。在遗传性小鼠模型中或药物干预后，不同细胞群体相对比例的变化可为肌生成过程提供机制性见...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

感谢奥胡斯大学生物医学系FACS核心设施的成员提供的技术支持。感谢生物医学系质谱流式细胞术单元负责人Alexander Schmitz给予的讨论和帮助。科学插图使用Biorender.com制作。本研究由奥胡斯大学研究基金会（AUFF）启动资助以及诺和诺德基金会启动包资助（0071113）支持，资助对象为E.P。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
15 mL 离心管Fisher Scientific07-200-886
20 G 针头KDMKD-fine 900123
28 G，0.5 mL 胰岛素注射器 BD329461
29 G，0.3 mL 胰岛素注射器BD324702
3 mL 注射器泰尔茂医疗MDSS03SE
40 µm细胞滤筛Fisher Scientific11587522
5 mL聚丙烯管 Fisher Scientific352002
5 mL 聚苯乙烯试管，含 35 µm细胞滤筛Falcon352235
5 mL 注射器泰尔茂医疗SS05LE1
50 mL 离心管Fisher Scientific05-539-13
5-碘-2-脱氧尿苷（IdU）默克I7125-5g
抗CD104 FITC（克隆号：346-11A）Biolegend123605储备液 = 0.5 mg/mL
抗CD11b APC-Cy7（克隆：M1/70）Biolegend101226储备液 = 0.2 mg/mL
抗CD31 APC-Cy7（克隆号：390）Biolegend102440储备液 = 0.2 mg/mL
抗CD45 APC-Cy7（克隆：30-F11）Biolegend103116储备液 = 0.2 mg/mL
抗CD9 APC（克隆：KMC8）赛默飞世尔科技17-0091-82储备液 = 0.2 mg/mL
抗Sca1（Ly6A/E）APC-Cy7（克隆：D7）Biolegend108126储备液 = 0.2 mg/mL
抗-α7整合素 PE（克隆：R2F2）不列颠哥伦比亚大学抗体实验室67-0010-05储备液 = 1 mg/mL
BD FACS Aria III（4 激光）仪器BD 生物科学N/A405、488、561 和 633 nm 激光器
牛血清白蛋白Sigma AldrichA7030-50G
布托啡诺 0.3 mg/mLCevaVnr 054594
CD104（克隆号：346-11A）BD 生物科学553745Dy162；实验室自制偶联物
CD106/VCAM-1（克隆：429 MVCAM.A）Biolegend105701Er170；实验室自制偶联物
CD11b（克隆：M1/70）BD 生物科学553308Nd148；实验室内部偶联
CD29/整合素 β1（克隆：9EG7）BD 生物科学553715Tm169；实验室内部偶联
CD31（克隆：MEC 13.3）BD 生物科学557355Sm154；实验室内部偶联
CD34（克隆：RAM34）BD 生物科学551387Lu175；实验室内部偶联
CD44（克隆：IM7）BD 生物科学550538Yb171；实验室内部偶联
CD45（克隆：MEC 30-F11）BD 生物科学550539Sm147；实验室自制偶联物
CD9（克隆：KMC8）赛默飞世尔科技14-0091-85Yb174；实验室内部偶联
CD90.2/Thy1.2（克隆：30-H12）BD 生物科学553009Nd144；实验室自制偶联物
CD98（克隆：H202-141）BD 生物科学557479Pr141；实验室内部偶联
细胞获取溶液/Maxpar CAS缓冲液标准生物工具201240
Cell-ID 插入剂-铱标准生物工具201192B阳离子核酸嵌入剂
顺铂默克P4394Pt195
顺铂（cis-二氨合铂(II)二氯化物）默克P4394
1.5 mL 透明离心管Fisher Scientific11926955
胶原酶 II 型Worthington Biochemical CorporationLS004177
计数室默克BR718620-1EA
CXCR4/SDF1（克隆：2B11/CXCR4）BD 生物科学551852Gd158；实验室内部偶联
DAPI（1 mg/mL）BD 生物科学564907
暗色1.5 mL离心管Fisher Scientific15386548
Dispase II赛默飞世尔科技17105041
解剖剪Fine Science Tools14568-09
DMEM（低糖，含丙酮酸钠）赛默飞世尔科技11885-092
EDTA（乙二胺四乙酸二钠盐）默克E5134Na2EDTA-2H20
EQ四元素校准微球（EQ微球）标准生物工具201078校准微球
胎牛血清，经鉴定，巴西来源赛默飞世尔科技10270106
Dumont #5SF 镊子Fine Science Tools11252-00
Dumont #7 镊子Hounisen.com1606.3350
山羊血清赛默飞世尔科技16210-072
Helios CyTOF 系统Standard BiotoolsN/A
马血清，热灭活，新西兰来源赛默飞世尔科技26-050-088
IdU默克I7125I127
铱-嵌入剂标准生物工具201240Ir191/193
异氟烷/Attane VetScanVetVnr 055226
甲醇Fisher ScientificM/3900/17
Myf5（克隆：C-20）Santa Cruz BiotechnologySc-302Yb173；实验室内部偶联
MyoD（克隆号：5.8A）BD 生物科学554130Dy164；实验室自制偶联物
MyoG（克隆：F5D）BD 生物科学556358Gd160；实验室内部偶联
Nalgene 快速流速无菌一次性瓶顶滤器 0.20 μM PES 滤膜赛默飞世尔科技595-4520
NotexinLatoxanL8104重悬至 50 µ微克/毫升，溶于无菌 PBS。保存储备液（如 50） µl) 在 -20 °C
营养混合物 F-10（Ham's）赛默飞世尔科技31550031
pAkt（克隆：D9E）标准生物工具3152005ASm152
Pax7（克隆：PAX7）Santa Cruz BiotechnologySc-81648Eu153；实验室内部偶联
青霉素-链霉素（10,000 U/mL）（Pen/Strep）赛默飞世尔科技15140122
PES 滤器单元 0.20 μMFisher Scientific15913307
PES注射器滤器Fisher Scientific15206869
培养皿Sarstedt82.1472.001
PFA 16% 电镜级MP Biomedicals219998320
氯化钾（KCl）Fisher Scientific10375810
磷酸二氢钾 无水（KH2PO4)Fisher Scientific10573181
pRb（克隆：J112-906）标准生物工具3166011AEr166
pS6激酶（克隆：N7-548）标准生物工具3172008AYb172
Sca-1（克隆：E13-161.7）BD 生物科学553333Nd142；内部偶联
叠氮化钠Sigma AldrichS2002
氯化钠（NaCl）Fisher Scientific10553515
磷酸氢二钠七水合物（Na2HPO4-6H2O默克S9390
0.9% 无菌生理盐水溶液FreseniusB306414/02
α7整合素（克隆号：3C12）MBL国际K0046-3Ho165；实验室自制偶联物

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