Monitorización del aprendizaje motor fino y asociativo en ratones mediante la escalera Erasmus
Summary
En este artículo se presenta un protocolo que permite una evaluación no invasiva y automatizada del rendimiento de la motricidad fina, así como el aprendizaje motor adaptativo y asociativo ante retos, utilizando un dispositivo denominado Escalera Erasmus. La dificultad de la tarea se puede ajustar para detectar el deterioro motor que va desde grados mayores hasta sutiles.
Abstract
El comportamiento está moldeado por las acciones, y las acciones requieren habilidades motoras como la fuerza, la coordinación y el aprendizaje. Ninguno de los comportamientos esenciales para mantener la vida sería posible sin la capacidad de hacer la transición de una posición a otra. Desafortunadamente, las habilidades motoras pueden verse comprometidas en una amplia gama de enfermedades. Por lo tanto, investigar los mecanismos de las funciones motoras a nivel celular, molecular y de circuito, así como comprender los síntomas, las causas y la progresión de los trastornos motores, es crucial para desarrollar tratamientos efectivos. Los modelos de ratón se emplean con frecuencia para este propósito.
En este artículo se describe un protocolo que permite monitorizar diversos aspectos del rendimiento motor y el aprendizaje en ratones mediante una herramienta automatizada llamada Escalera Erasmus. El ensayo consta de dos fases: una fase inicial en la que se entrena a los ratones para que naveguen por una escalera horizontal construida con peldaños irregulares (“aprendizaje de la motricidad fina”), y una segunda fase en la que se presenta un obstáculo en el camino del animal en movimiento. La perturbación puede ser inesperada (“aprendizaje motor desafiado”) o precedida por un tono auditivo (“aprendizaje motor asociativo”). La tarea es fácil de llevar a cabo y está totalmente respaldada por un software automatizado.
Este informe muestra cómo las diferentes lecturas de la prueba, cuando se analizan con métodos estadísticos sensibles, permiten un seguimiento fino de las habilidades motoras del ratón utilizando una pequeña cohorte de ratones. Proponemos que el método será altamente sensible para evaluar las adaptaciones motoras impulsadas por modificaciones ambientales, así como los déficits motores sutiles en etapa temprana en ratones mutantes con funciones motoras comprometidas.
Introduction
Se han desarrollado una variedad de pruebas para evaluar los fenotipos motores en ratones. Cada prueba proporciona información sobre un aspecto específico del comportamiento motor1. Por ejemplo, la prueba de campo abierto informa sobre el estado general de locomoción y ansiedad; las pruebas de coordinación y equilibrio con rotarod y viga de marcha; El análisis de la huella tiene que ver con la marcha; la cinta de correr o la rueda de correr en el ejercicio físico forzado o voluntario; Y la rueda compleja tiene que ver con el aprendizaje de habilidades motoras. Para analizar los fenotipos motores de los ratones, los investigadores deben realizar estas pruebas de forma secuencial, lo que implica mucho tiempo y esfuerzo y, a menudo, varias cohortes de animales. Si hay información a nivel celular o de circuitos, el investigador normalmente opta por una prueba que monitorea un aspecto relacionado y sigue a partir de ahí. Sin embargo, faltan paradigmas que discriminen diferentes aspectos de la conducta motora de forma automatizada.
En este artículo se describe un protocolo para utilizar la Escalera Erasmus 2,3, un sistema que permite una evaluación exhaustiva de una variedad de características de aprendizaje motor en ratones. Las principales ventajas son la reproducibilidad y sensibilidad del método, junto con la capacidad de valorar la dificultad motora y separar los déficits en el rendimiento motor de la alteración del aprendizaje motor asociativo. El componente principal consiste en una escalera horizontal con peldaños altos (H) y bajos (L) alternados equipados con sensores sensibles al tacto que detectan la posición del mouse en la escalera. La escalera está hecha de 2 x 37 peldaños (L, 6 mm; H, 12 mm) espaciados 15 mm entre sí y colocados en un patrón alterno izquierda-derecha con espacios de 30 mm (Figura 1A). Los peldaños se pueden mover individualmente para generar varios niveles de dificultad, es decir, crear un obstáculo (elevando los peldaños altos en 18 mm). Junto con un sistema de registro automatizado y asociando las modificaciones del patrón de peldaños con estímulos sensoriales, la escalera Erasmus evalúa el aprendizaje de la motricidad fina y la adaptación del rendimiento motor en respuesta a los desafíos ambientales (aparición de un peldaño más alto para simular un obstáculo, un estímulo incondicionado [US]) o la asociación con estímulos sensoriales (un tono, un estímulo condicionado [CS]). Las pruebas implican dos fases distintas, cada una de las cuales evalúa la mejora en el rendimiento motor durante 4 días, durante los cuales los ratones se someten a una sesión de 42 ensayos consecutivos por día. En la fase inicial, los ratones son entrenados para navegar por la escalera y evaluar el aprendizaje motor “fino” o “hábil”. La segunda fase consiste en ensayos intercalados en los que se presenta un obstáculo en forma de peldaño superior en el camino del animal en movimiento. La perturbación puede ser inesperada para evaluar el aprendizaje motor “desafiado” (ensayos solo en EE. UU.) o anunciada por un tono auditivo para evaluar el aprendizaje motor “asociativo” (ensayos emparejados).
La escala Erasmus se ha desarrollado hace relativamente poco tiempo 2,3. No se ha utilizado ampliamente porque la configuración y optimización del protocolo requirió un esfuerzo específico y fue diseñado específicamente para evaluar el aprendizaje asociativo dependiente de cerebelos sin explorar en detalle su potencial para revelar otros déficits motores. Hasta la fecha, ha sido validado por su capacidad para revelar alteraciones motoras sutiles relacionadas con la disfunción cerebelosa en ratones 3,4,5,6,7,8. Por ejemplo, los ratones knockout de conexina36 (Cx36), donde las uniones gap están deterioradas en las neuronas olivarias, muestran déficits de disparo debido a la falta de acoplamiento electrotónico, pero el fenotipo motor había sido difícil de precisar. Las pruebas realizadas con la escalera de Erasmus sugirieron que el papel de las neuronas olivareras inferiores en una tarea de aprendizaje motor cerebeloso es codificar con precisión la codificación temporal de los estímulos y facilitar las respuestas dependientes del aprendizaje a eventos inesperados 3,4. El ratón knockout de ribonucleoproteína 1 mensajero del cromosoma X frágil (Fmr1), un modelo para el síndrome del cromosoma X frágil (SXF), exhibe un deterioro cognitivo bien conocido junto con defectos más leves en la formación de la memoria de procedimiento. Los knockouts de Fmr1 no mostraron diferencias significativas en los tiempos de paso, los pasos en falso por ensayo o la mejora del rendimiento motor durante las sesiones de la Escalera Erasmus, pero no lograron ajustar su patrón de marcha al obstáculo que aparece repentinamente en comparación con sus compañeros de camada de tipo salvaje (WT), lo que confirma déficits específicos de memoria asociativa y de procedimiento 3,5. Además, las líneas mutantes de ratón específicas de células con defectos en la función cerebelosa, incluida la alteración de la producción de células de Purkinje, la potenciación y la producción de interneuronas o células granulosas de la capa molecular, mostraron problemas en la coordinación motora con la adquisición alterada de patrones de pasos eficientes y en el número de pasos dados para cruzar la escalera6. El daño cerebral neonatal provoca déficits de aprendizaje cerebelosos y disfunción de las células de Purkinje que también podrían detectarse con la Escalera Erasmus 7,8.
En este video, presentamos una guía completa paso a paso, que detalla la configuración de la sala de comportamiento, el protocolo de prueba de comportamiento y el posterior análisis de datos. Este informe está elaborado para ser accesible y fácil de usar y está diseñado específicamente para ayudar a los recién llegados. Este protocolo proporciona información sobre las diferentes fases del entrenamiento motor y los patrones motores esperados que adoptan los ratones. Por último, el artículo propone un flujo de trabajo sistemático para el análisis de datos utilizando un potente enfoque de regresión no lineal, con valiosas recomendaciones y sugerencias para adaptar y aplicar el protocolo en otros contextos de investigación.
Protocol
Representative Results
Discussion
La Escalera Erasmus presenta grandes ventajas para la evaluación del fenotipo motor más allá de los enfoques actuales. Las pruebas son fáciles de realizar, automatizadas, reproducibles y permiten a los investigadores evaluar varios aspectos del comportamiento motor por separado utilizando una sola cohorte de ratones. En el presente estudio, la reproducibilidad permitió la generación de datos robustos con un pequeño número de ratones WT aprovechando las características del dispositivo, el diseño experimental y l…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a la técnica audiovisual y productora de video Rebeca De las Heras Ponce, así como al veterinario jefe Gonzalo Moreno del Val, por la supervisión de buenas prácticas durante la experimentación con ratones. El trabajo ha sido financiado por ayudas del Programa de Excelencia GVA (2022/8) y de la Agencia Española de Investigación (PID2022143237OB-I00) a Isabel Pérez-Otaño.
Materials
| C57BL/6J mice (Mus musculus) | Charles Rivers | ||
| Erasmus Ladder device | Noldus, Wageningen, Netherlands | ||
| Erasmus Ladder 2.0 software | Noldus, Wageningen, Netherlands | ||
| Excel software | Microsoft | ||
| Sigmaplot software | Systat Software, Inc. |
References
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