Summary
מאמר זה מציג פרוטוקול המאפשר הערכה לא פולשנית ואוטומטית של ביצועי המוטוריקה העדינה, כמו גם למידה מוטורית אדפטיבית ואסוציאטיבית, על אתגרים, באמצעות מכשיר הנקרא סולם ארסמוס. קושי המשימה יכול להיות titrated כדי לזהות ליקוי מוטורי החל גדול עד עדינות.
Abstract
התנהגות מעוצבת על ידי פעולות, ופעולות דורשות מיומנויות מוטוריות כגון כוח, קואורדינציה ולמידה. אף אחת מההתנהגויות החיוניות לקיום החיים לא הייתה אפשרית ללא היכולת לעבור מעמדה אחת לאחרת. למרבה הצער, מיומנויות מוטוריות יכולות להיפגע במגוון רחב של מחלות. לכן, חקירת המנגנונים של תפקודים מוטוריים ברמה התאית, המולקולרית והמעגלית, כמו גם הבנת הסימפטומים, הגורמים וההתקדמות של הפרעות מוטוריות, היא חיונית לפיתוח טיפולים יעילים. מודלים עכבר משמשים לעתים קרובות למטרה זו.
מאמר זה מתאר פרוטוקול המאפשר ניטור של היבטים שונים של ביצועים מוטוריים ולמידה בעכברים באמצעות כלי אוטומטי שנקרא סולם ארסמוס. הבדיקה כוללת שני שלבים: שלב ראשוני שבו עכברים מאומנים לנווט בסולם אופקי הבנוי משלבים לא סדירים ("למידה מוטורית עדינה"), ושלב שני שבו מוצג מכשול בדרכה של החיה הנעה. ההפרעה יכולה להיות בלתי צפויה ("למידה מוטורית מאותגרת") או שקדמה לה צליל שמיעתי ("למידה מוטורית אסוציאטיבית"). המשימה קלה לביצוע ונתמכת באופן מלא על ידי תוכנה אוטומטית.
דו"ח זה מראה כיצד קריאות שונות מהמבחן, כאשר הן מנותחות בשיטות סטטיסטיות רגישות, מאפשרות ניטור עדין של מיומנויות מוטוריות של עכברים באמצעות קבוצה קטנה של עכברים. אנו מציעים כי השיטה תהיה רגישה מאוד להערכת התאמות מוטוריות המונעות על ידי שינויים סביבתיים, כמו גם ליקויים מוטוריים עדינים בשלב מוקדם בעכברים מוטנטיים עם תפקודים מוטוריים פגועים.
Introduction
מגוון בדיקות פותחו כדי להעריך פנוטיפים מוטוריים בעכברים. כל מבחן נותן מידע על היבט מסוים של התנהגות מוטורית1. לדוגמה, מבחן השדה הפתוח מודיע על תנועה כללית ומצב חרדה; בדיקות רוטרוד וקרן הליכה על קואורדינציה ושיווי משקל; ניתוח טביעת רגל עוסק בהליכה; הליכון או גלגל ריצה על פעילות גופנית מאולצת או מרצון; והגלגל המורכב עוסק בלמידת מיומנות מוטורית. כדי לנתח פנוטיפים מוטוריים של עכברים, החוקרים חייבים לבצע בדיקות אלה ברצף, מה שכרוך בהרבה זמן ומאמץ ולעתים קרובות כמה קבוצות של בעלי חיים. אם יש מידע ברמה התאית או המעגלית, החוקר בדרך כלל בוחר בבדיקה שמנטרת היבט קשור ועוקבת משם. עם זאת, פרדיגמות המפלות היבטים שונים של התנהגות מוטורית באופן אוטומטי חסרות.
מאמר זה מתאר פרוטוקול לשימוש בסולם ארסמוס 2,3, מערכת המאפשרת הערכה מקיפה של מגוון תכונות למידה מוטורית בעכברים. היתרונות העיקריים הם יכולת השחזור והרגישות של השיטה, יחד עם היכולת לטיטר קושי מוטורי ולהפריד בין ליקויים בביצועים מוטוריים לבין למידה מוטורית אסוציאטיבית לקויה. הרכיב העיקרי מורכב מסולם אופקי עם שלבים גבוהים (H) ונמוכים (L) לסירוגין המצוידים בחיישנים רגישים למגע המזהים את מיקום העכבר על הסולם. הסולם עשוי 2 x 37 שלבים (L, 6 מ"מ; גובה, 12 מ"מ) במרווחים של 15 מ"מ זה מזה וממוקמים בתבנית מתחלפת שמאל-ימין עם מרווחים של 30 מ"מ (איור 1A). ניתן להזיז שלבים בנפרד כדי ליצור רמות קושי שונות, כלומר, יצירת מכשול (העלאת השלבים הגבוהים ב -18 מ"מ). יחד עם מערכת הקלטה אוטומטית ושיוך שינויים של דפוס הצעד עם גירויים חושיים, סולם ארסמוס בודק למידה מוטורית עדינה והתאמה של ביצועים מוטוריים בתגובה לאתגרים סביבתיים (הופעת שלב גבוה יותר כדי לדמות מכשול, גירוי בלתי מותנה [US]) או קשר עם גירויים חושיים (טון, גירוי מותנה [CS]). הבדיקה כוללת שני שלבים נפרדים, שכל אחד מהם מעריך שיפור בביצועים המוטוריים במשך 4 ימים, שבמהלכם עכברים עוברים סשן של 42 ניסויים רצופים ביום. בשלב הראשוני, עכברים מאומנים לנווט בסולם כדי להעריך למידה מוטורית "עדינה" או "מיומנת". השלב השני מורכב מניסויים משולבים שבהם מוצג מכשול בצורת מדרגה גבוהה יותר בדרכה של החיה הנעה. ההפרעה יכולה להיות בלתי צפויה להעריך למידה מוטורית "מאותגרת" (ניסויים בארה"ב בלבד) או מוכרזת על ידי טון שמיעתי כדי להעריך למידה מוטורית "אסוציאטיבית" (ניסויים זוגיים).
סולם ארסמוס פותח יחסית לאחרונה 2,3. לא נעשה בו שימוש נרחב מכיוון שהגדרת הפרוטוקול ואופטימיזציה שלו דרשו מאמץ ממוקד ותוכנן במיוחד להעריך למידה אסוציאטיבית תלוית המוח הקטן מבלי לחקור בפירוט את הפוטנציאל שלה לחשוף ליקויים מוטוריים אחרים. עד כה, הוא אומת ביכולתו לחשוף ליקויים מוטוריים עדינים הקשורים לתפקוד לקוי של המוח הקטן בעכברים 3,4,5,6,7,8. לדוגמה, עכברי נוקאאוט מסוג connexin36 (Cx36), שבהם צמתי מרווחים נפגעים בתאי עצב אוליבאריים, מציגים ליקויי ירי עקב היעדר צימוד אלקטרוטוני, אך היה קשה לאתר את הפנוטיפ המוטורי. בדיקה באמצעות סולם ארסמוס הציעה כי תפקידם של נוירונים אוליבאריים נחותים במשימת למידה מוטורית במוח הקטן הוא לקודד קידוד זמני מדויק של גירויים ולהקל על תגובות תלויות למידה לאירועים בלתי צפויים 3,4. עכבר נוקאאוט Fragile X Messenger Ribonucleoprotein 1 (Fmr1), מודל לתסמונת X שביר (FXS), מציג ליקוי קוגניטיבי ידוע יחד עם פגמים קלים יותר ביצירת זיכרון פרוצדורלי. נוקאאוטים של Fmr1 לא הראו הבדלים משמעותיים בזמני צעדים, צעדים שגויים בכל ניסוי או שיפור בביצועים מוטוריים לעומת אימונים בסולם ארסמוס, אך לא הצליחו להתאים את דפוס ההליכה שלהם למכשול שהופיע לפתע בהשוואה לחבריהם לפסולת מסוג פרא (WT), ואישרו ליקויי זיכרון פרוצדורליים ואסוציאטיביים ספציפיים 3,5. יתר על כן, קווים מוטנטיים ספציפיים לתא של עכברים עם פגמים בתפקוד המוח הקטן, כולל תפוקה לקויה של תאי Purkinje, הגברה ופלט של תאי נוירון או גרגיר בשכבה המולקולרית, הציגו בעיות בתיאום המוטורי עם רכישה שונה של דפוסי צעדים יעילים ובמספר הצעדים שננקטו כדי לחצות את הסולם6. פגיעה מוחית בילוד גורמת לליקויי למידה במוח הקטן ולתפקוד לקוי של תאי Purkinje שניתן לזהות גם עם סולם ארסמוס 7,8.
בסרטון זה אנו מציגים מדריך מקיף שלב אחר שלב, המפרט את הגדרת חדר ההתנהגות, פרוטוקול המבחן ההתנהגותי וניתוח הנתונים לאחר מכן. דוח זה נועד להיות נגיש וידידותי למשתמש ותוכנן במיוחד כדי לסייע למצטרפים חדשים. פרוטוקול זה מספק תובנה לגבי שלבים שונים של אימון מוטורי ודפוסים מוטוריים צפויים שעכברים מאמצים. לבסוף, המאמר מציע זרימת עבודה שיטתית לניתוח נתונים באמצעות גישת רגרסיה לא ליניארית רבת עוצמה, עם המלצות והצעות יקרות ערך להתאמה ויישום של הפרוטוקול בהקשרים מחקריים אחרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
במחקר הנוכחי נעשה שימוש בעכברים בוגרים (בני 2-3 חודשים) C57BL/6J משני המינים. בעלי החיים שוכנו שניים עד חמישה בכל כלוב עם גישה למזון ומים ביחידת בעלי חיים תחת תצפית והוחזקו בסביבה מבוקרת טמפרטורה במחזור חושך/אור של 12 שעות. כל ההליכים נערכו בהתאם לתקנות האירופיות והספרדיות (2010/63/UE; RD 53/2013) ואושרו על ידי הוועדה האתית של Generalitat Valenciana והוועדה לרווחת בעלי חיים של Universidad Miguel Hernández.
1. סידור חדר התנהגותי
- הזמינו את חדר הבדיקות ההתנהגותיות בכל יום באותה שעה וקבעו את רשימת וסדר העכברים שישמשו, כמו גם סידורים לאירוח שלהם.
- שמור את עכברי הניסוי מחוץ לחדר הבדיקה כדי שלא ישמעו את קולות מדחס האוויר וצלילי סולם ארסמוס כאשר אינם נבדקים.
- בדוק שכל רכיבי מערכת סולם ארסמוס תקינים ומוכנים לשימוש: נתב הרשת, המחשב עם התוכנה (ראה טבלת חומרים), מדחס האוויר, שתי תיבות מטרה, והסולם עם השלבים ממוקמים כראוי.
- נקו בהרחבה את קופסאות המטרה, הסולם והשלבים עם מים אחרי כל חיה ועם מים ו-70% אתנול בסוף כל יום אימון.
2. פרוטוקול מבחן התנהגותי
- צור ניסוי והזן את הפרוטוקול לתוך התוכנה (איור משלים S1).
- הפעל את התוכנה.
- כדי ליצור ניסוי, בחר קובץ | ניסוי חדש | חדש או הגדרה | פרוטוקול ניסוי.
הערה: פרוטוקול ברירת המחדל, המשמש במחקר זה, נקרא EMC ותוכנן במרכז הרפואי האוניברסיטאי ארסמוס, רוטרדם. - תן שם לניסוי ולחץ על אישור.
- בדקו שפרוטוקול EMC המוגדר כברירת מחדל שנבחר מורכב מ-4 ימים של הפעלות ללא הפרעה (42 ניסויים ללא הפרעה ביום) ו-4 ימים של מפגשי אתגר (42 ניסויים מעורבים יומיים: ללא הפרעה, CS בלבד (טון), US בלבד (מכשול), זוגי (מכשול שהוכרז על-ידי טון) (ראו איור 1B). בלוח הימני, בדוק גם את רמז האור (משך זמן מרבי של 3 שניות), רמז האוויר (משך מרבי של 45 שניות) והרוח הגבית (כן בכל סוגי הניסויים), המשמשים לעידוד העכבר לחצות את הסולם, ואת הטון (250 אלפיות השנייה, כן רק בניסויי CS בלבד ו- Paired).
- כדי ליצור פרוטוקול אחר, בחר הגדר | פרוטוקול ניסוי | חדש | מאפס או העתק מפרוטוקול EMC ופשוט לשנות אותו, עריכת שורות הטבלה הקשורות למספר הפעלות (ימי ניסוי) ומספר וסוג הניסויים ביום.
הערה: ניתן להתאים גם את זמן המנוחה, סוג הרמזים והפעלתם, משך, עוצמה ומרווח בהתאם לשאלות הניסוי. - כדי לפתוח את רשימת ההפעלות ולתת שם לנושאים, בחר הגדרה | רשימת הפעלות.
- לחץ על הוסף נושאים ומשתנים.
- הזן כל מזהה עכבר ספציפי, תאריך לידה, מין, גנוטיפ וקטגוריות רלוונטיות, בהתאם לרשימת העכברים המסודרת.
- התחל את ההפעלה (איור משלים S2).
- לפני שתתחיל, בדוק שהתוכנה פתוחה, ולאחר מכן הפעל את הסולם.
- בדקו שמדחס האוויר מחובר ומופעל.
- כדי לפתוח את החלון רכישה, פתח את הניסוי שנוצר.
- בחר רכישה | רכישה פתוחה.
- מקם את העכבר עם המזהה המצוין על ידי התוכנה בתיבת המטרה ההתחלתית (בצד ימין של הסולם).
- בחר את מזהה העכבר שברצונך לרכוש בהפעלה הראשונה.
- לחץ על התחל רכישה.
- לחץ על ידית תפריט הסולם האדום 3x. ודא שההפעלה מתחילה ושולטת ומתעדת באופן אוטומטי תנועות עכבר עד לסוף תקופת הניסיון האחרונה של ההפעלה.
- סיים את ההפעלה.
- בדוק שבסוף גירסת הניסיוןה-42, התצוגה מציגה את ההודעות שליחת נתונים ורכישה.
- החזירו את העכבר לכלוב הביתי.
- נקו את הסולם ואת קופסאות המטרה.
- מקם את העכבר הבא וחזור על הפעולה משלב 2.2.6 ואילך.
- בצע את סוג ההפעלה שנבחר מדי יום עד סוף הפרוטוקול. חזור על שלבים 2.2 ו- 2.3 מדי יום בהתאם לפרוטוקול שנבחר.
- ייצוא הנתונים (איור משלים S2).
- כדי להציג באופן חזותי את הנתונים המוקלטים, בחר מתפריט ניתוח , סטטיסטיקת ניסיון, סטטיסטיקת הפעלה וסטטיסטיקה ותרשימים קבוצתיים.
הערה: ניתן להוריד נתונים כגיליון אלקטרוני עם נתונים עבור גירסאות ניסיון בודדות והאמצעים של אותם סוגי ניסיון בתוך הפעלה. ניתן גם לסנן הפעלות לפי משתנים שנבחרו לניתוח ספציפי. - לחץ על יצוא כפתור בפינה השמאלית העליונה, בחירת פורמט הקובץ (גיליון אלקטרוני) ומיקום התיקייה.
- לחץ לחיצה ימנית על התרשימים שנוצרו באופן אוטומטי ובחר שמור לקובץ כ - *.jpg.
- כדי להציג באופן חזותי את הנתונים המוקלטים, בחר מתפריט ניתוח , סטטיסטיקת ניסיון, סטטיסטיקת הפעלה וסטטיסטיקה ותרשימים קבוצתיים.
3. ניתוח נתונים
הערה: רשימת פרמטרים נמדדת באופן אוטומטי על ידי סולם ארסמוס בהתבסס על הקלטה מיידית של פעילויות החיישנים הרגישים למגע. לצורך ניתוח, פרמטרי פלט שנבחרו על ידי המשתמש מאורגנים ומעובדים בגיליונות האלקטרוניים. יחד עם הגרפים שנוצרו על ידי תוכנה, משתמשים יכולים ליצור גרפים באמצעות תוכנת הגרפים הנבחרת כדי לדמיין שינויים ספציפיים בפרמטרים שונים במהלך הפעלות.
- בחר פרמטרים ספציפיים לניתוח מוטיבציה בסיסית או מצבי חרדה, תגובות חושיות, ביצועים מוטוריים ולמידה מוטורית עדינה במהלך 4 הימים הראשונים.
- בחירת פרמטרים והתוויית שליטה, כולל זמן מנוחה בתיבת המטרה וזמן יציאה מקופסת המטרה לאחר תקופת המנוחה בתגובה לרמזי אור ואוויר (איור 2A).
הערה: זמני מנוחה או תגובה לרמזים קבועים יחסית בעכברי WT. פרמטרים אחרים, כגון תדירות היציאות, הם זניחים ביסודם בעכברי WT - בעלי החיים לעיתים רחוקות עוזבים את תיבת המנוחה ללא הרמזים או חוזרים פעם אחת בסולם, וכתוצאה מכך תדירות היציאה שווה ל-1 לכל ניסוי. אם בעל חיים יוצא החוצה לפני החלת רמזים, זרימת אוויר מופעלת שמאלצת את העכבר לחזור לקופסת המטרה; פעולה זו אינה נספרת כגירסת ניסיון על-ידי התוכנה. - בחרו והתוו את הזמן בסולם אחר רמזים, שנמדד כזמן שהוקדש לחציית הסולם ברגע שהעכבר עוזב את תיבת המטרה (איור 2B).
הערה: רגרסיה לא ליניארית חזקה היא שיטה חזקה להערכת למידה. מקדמי פירסון או ספירמן (R) יספקו מדד האם התאמת הנתונים טובה (ערכי R קרובים לאחד כאשר החיות לומדות/משתפרות במהלך הפעלות; ערכי R קרובים ל-0 מרמזים על כך שהנתונים קבועים ועכברים אינם לומדים). - בחר והתווה פרמטרים של תבנית צעדים , כגון אחוז הניסויים עם שלבים שגויים כפרמטר למידה רגיש (איור 2C).
- הגדר צעד נכון כצעד מדרגה גבוהה לדרגה גבוהה אחרת (H-H), ללא קשר לאורך המדרגה. שקול סוגי שלבים הכוללים שלב נמוך יותר כשלבים שגויים.
- חלקו צעדים נכונים וצעדים שגויים לצעדים קצרים וארוכים, צעדים לאחור וקפיצות בהתאם לאורך ולכיווניות של המדרגה בין השלבים שנלחצו (ראו איור 1A).
- בחירת פרמטרים והתוויית שליטה, כולל זמן מנוחה בתיבת המטרה וזמן יציאה מקופסת המטרה לאחר תקופת המנוחה בתגובה לרמזי אור ואוויר (איור 2A).
- בחר והתווה פרמטרים ספציפיים כדי להעריך למידה מוטורית מאותגרת (ניסויים בארה"ב בלבד) ולמידה אסוציאטיבית (ניסויים זוגיים) במהלך 4 הימים האחרונים.
- בחרו והתוו את הזמן בסולם אחרי רמזים (איור 3).
- בחר והתווה את אחוז הניסויים עם שלבים שגויים (איור 4A).
- בחר והתווה את זמני השלבים לפני ואחרי ההפרעה, המוגדרים כהפרש דיוק של ms בין הפעלת השלב ממש לפני (שלב הבקרה) ואחרי המכשול (צעד מותאם) באותו צד של הסולם (איור 4B).
הערה: יש לבצע ניתוח זמני שלבים לפני לעומת לאחר הפרעה כדי להשוות נתונים בתוך כל סוג של הפעלה. הפרמטר מודד את יכולתם של העכברים לחזות ולהתגבר על המכשולים במהלך למידה אסוציאטיבית.
- נתח את הנתונים באמצעות תוכנה סטטיסטית ייעודית (למשל, SigmaPlot). בצע ניתוח רגרסיה לא ליניארית של נתונים שנאספו מאותו סוג ניסוי בין הפעלות כדי לתאר את תהליך הלמידה בצורה יעילה יותר והשתמש ב- Two-Way Repeat Measures (RM) ANOVA כדי להשוות בין סוגי הניסויים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מכשיר סולם ארסמוס, ההתקנה והפרוטוקול שיושמו מוצגים באיור 1. הפרוטוקול מורכב מארבעה מפגשי אתגר ללא הפרעה וארבעה מפגשי אתגר (42 ניסויים כל אחד). כל ניסוי הוא ריצה אחת בסולם שבין תיבת המטרה המתחילה ותיבת הסיום. בתחילת ההפעלה, עכבר ממוקם באחת מתיבות ההתחלה. לאחר זמן מוגדר של 15 ± 5 שניות (מצב "מנוחה"), האור נדלק (רמז 1, עבור מקסימום של 3 שניות). לאחר מכן מופעל רמז אוויר קל (רמז 2, 45 שניות לכל היותר) כדי לעודד את העכברים לעזוב את הקופסה וללכת לקצה השני. הזמן להגיב לרמז האוויר יכול להשתנות בין עכברים למפגשים, והוא יכול לשמש כפרמטר להשוואת מצבי מוטיבציה או חרדה בין קבוצות. ניסוי חדש מתחיל מיד לאחר שהעכבר מגיע לתיבת המטרה הסופית.
לא נצפו הבדלים בזמן המנוחה ובזמן התגובה לרמז האור בעכברי WT בין הימים 1-4, אולם הזמן להגיב לרמז האוויר ירד מעט בין ימים 1 ו-2 (איור 2A). מדידות של הזמן לחציית הסולם הניבו עקומת למידה משמעותית מימים 1 עד 4 שניתן היה להתאים לה עקומת רגרסיה חזקה (R = 0.50, *p = 0.047, איור 2B). פרמטר מרכזי הקובע את הזמן שלוקח לחצות את הסולם הוא התרחשות של טעויות. בהתאם לקיצור הזמנים בסולם, מספר הניסויים שבהם עכברים טעו ירד במהלך מפגשים ללא הפרעה, כאשר עכברים למדו ללכת על השלבים העליונים (מדרגות H-H) ולהימנע מהשלבים התחתונים כתבנית יעילה יותר לחצות את הסולם (R = 0.90, ***p < 0,0001, איור 2C).
מימים 5 עד 8, העכברים היו נתונים למפגשי אתגר שבהם הוצג מכשול בלתי צפוי (US) (שלב אחד מורם באופן אקראי על ידי 18 מ"מ מעל משטח הדריכה). בחלק מהניסויים, טון (CS, 90 dB, טון של 15 קילוהרץ שנמשך 250 מילישניות) מוצג 250 מילישניות לפני ההפרעה בארה"ב (ראו איור 1B).
עם תחילת מפגשי האתגר ביום 5, בעלי חיים נזקקו לזמן רב יותר כדי לחצות את הסולם במהלך ניסויים בארה"ב בלבד בגלל הצגתו הבלתי צפויה של המכשול (יום 4: 5.01 שניות; איור 2B; יום 5: 7.84 שניות; איור 3; מבחן T זוגי,*P < 0.039). ביצועי העכבר השתפרו מימים 5 עד 8, והניבו עקומת למידה משמעותית על פני הפעלות בארה"ב בלבד (R = 0.50, *p = 0.045, איור 3, כתום). בניסויי למידה אסוציאטיבית, שבהם המכשול הוצמד לצליל, חיות השלימו את המפגשים היומיים מהר יותר באופן משמעותי בהשוואה לניסויים בארה"ב בלבד (R = 0.63, איור 3, סגול; RM ANOVA דו-כיווני, *p = 0.028). לבסוף, בניסויי ביקורת כאשר הטון הוצג לבד (CS-בלבד), דווחה עקומת למידה משמעותית שדמתה למפגשים ללא הפרעה (R = 0.82, ***p < 0.001, איור 3, כחול).
ניתוח דפוסי השלבים סיפק אישוש נוסף ורגישות מוגברת באיתור הבדלים בין ניסויים בארה"ב בלבד לבין ניסויים אסוציאטיביים. איור 4A מראה כיצד אחוז הניסויים עם צעדים שגויים נשאר קבוע במהלך ניסויים בארה"ב בלבד (R = 0.01, p = 0.90, כתום), בעוד ירידה משמעותית בניסויים עם צעדים שגויים נצפתה במהלך מפגשים זוגיים (R = 0.61, *p = 0.01, סגול). איור 4B מראה הבדל משמעותי בין זמני השלבים לפני ואחרי ההפרעה בניסויים בארה"ב בלבד (RM ANOVA דו-כיווני, *p = 0.05), אולם לא בניסויים זוגיים שבהם עכברים למדו מהר יותר להתגבר על המכשול. כל המשתנים שנחקרו והמבחנים הסטטיסטיים המיושמים מדווחים בלוח המשלים S1.
איור 1: מערכת, פרוטוקול ופרמטרים. (A) סולם ארסמוס מורכב מסולם אופקי שמשני צדדיו שתי תיבות מטרה. הקריקטורה מייצגת את הסולם עם שלבים גבוהים ונמוכים לסירוגין ואת הפרמטרים העיקריים שנרשמו, כולל סוגי צעדים (צעדים רגילים, קו מלא; או צעדים שגויים, קו מקווקו) וזמן צעד לפני ואחרי הפרעה המוגדר כזמן שבו העכבר צריך להתגבר על מכשול (גירוי בלתי מותנה; שלב גבוה יותר) שהוכרז או לא הוכרז על ידי טון (גירוי מותנה). (B) הפרוטוקול מורכב מארבעה מפגשי אתגר ללא הפרעה וארבעה מפגשי אתגר (מפגש אחד ביום, 42 ניסויים/מפגש) המאפשרים ניתוח נפרד של למידה מוטורית עדינה (ללא הפרעה ו-CS בלבד בכחול), למידה מוטורית מאותגרת (בארה"ב בלבד, בכתום) ולמידה מוטורית אסוציאטיבית (CS + US, בסגול). קיצורים: H = גבוה; L = נמוך; CS = גירוי מותנה; US = גירוי בלתי מותנה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: ביצועים מוטוריים של עכברי WT במהלך הפעלות ללא הפרעה. (A) זמן מנוחה בתיבת המטרה (קבוע, 15 שניות), זמן להגיב לרמזים: אור (קבוע, 3 שניות) ואוויר (משתנה); במשך ימים 1-4 של מפגשים ללא הפרעה. (B) זמן לחצות את הסולם אחר רמז (אור ואוויר) במהלך הפעלות ללא הפרעה. (C) אחוז הניסויים בכל מפגש ללא הפרעה שבו בעל החיים החמיץ צעד. ניתוח רגרסיה של כוח שימש לחקר התקדמות הלמידה (R= 0.50: *p = 0.047, R= 0.90 ***p < 0.0001, בהתאמה, n = 4 עכברים). קיצור: WT = סוג פראי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: ביצועים של עכברי WT במהלך מפגשי אתגר. זמן ממוצע בסולם לאחר רמזים בימים 5-8 עבור ניסויים בארה"ב בלבד (כתום), זוגות (סגול) וניסויי CS בלבד (תכלת). ניתוח רגרסיה לא ליניארית בעוצמה שימש לחקר התקדמות הלמידה (*p = 0.047, **p = 0.0093, ***p < 0.001, n = 4 עכברים). RM ANOVA דו-כיווני להשוואה בין סוגי ניסוי (*p = 0.028, **p = 0.008, n = 4 עכברים, שני זכרים ושתי נקבות, ממוצע ± SEM). קיצורים: CS = גירוי מותנה; US = גירוי בלתי מותנה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: שינויים בדפוסי צעדי עכבר במהלך מפגשי אתגר. (A) אחוז הניסויים בכל מפגש שבו בעל החיים החמיץ צעד במהלך מפגשים זוגיים וזוגיים בארה"ב בלבד. ניתוח רגרסיה של כוח שימש לחקר תהליך הלמידה (*p = 0.013) ו- RM ANOVA דו-כיווני להשוואה בין סוגי ניסוי (*p = 0.032, n = 4 עכברים). (B) זמן שלב לפני ואחרי הפרעה (ים) בארה"ב בלבד ומפגשים זוגיים לאורך כל המפגשים. אמצעים חוזרים דו-כיווניים ANOVA, *p < 0.05, n = 4 עכברים, שני זכרים ושתי נקבות, ממוצע ± SEM. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור משלים S1: ממשק תוכנה: כיצד ליצור ניסוי ולבחור פרוטוקול. צילומי מסך מהתוכנה הממחישים את זרימת העבודה המתוארת בשלב 2.1 של הפרוטוקול, המכסים את שלבים 2.1.4 עד 2.1.8. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
איור משלים S2: ממשק תוכנה: כיצד להתחיל את ההפעלה ולייצא את הנתונים. צילומי מסך מהתוכנה הממחישים את זרימת העבודה המתוארת בשלבי פרוטוקול 2.2 ו- 2.5, המכסים את שלבים 2.2.4 עד 2.2.7 ו- 2.5.1 עד 2.5.3. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
טבלה משלימה S1: טבלה סטטיסטית. תיאור כל המשתנים שנחקרו והמבחנים הסטטיסטיים שיושמו, שדווחו באיור 2B,C, איור 3 ואיור 4A,B. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
סולם ארסמוס מציג יתרונות גדולים להערכת פנוטיפ מוטורי מעבר לגישות הנוכחיות. הבדיקה קלה לביצוע, אוטומטית, ניתנת לשחזור, ומאפשרת לחוקרים להעריך היבטים שונים של התנהגות מוטורית בנפרד באמצעות קבוצת עכברים יחידה. במחקר הנוכחי, יכולת השחזור אפשרה יצירת נתונים חזקים עם מספר קטן של עכברי WT המנצלים את תכונות המכשיר, תכנון הניסוי ושיטות הניתוח. לדוגמה, בהשוואה למבחני הליכת אלומות מסורתיים, הוספת רמזי מוטיבציה (אוויר ואור) לכניסה לנתיב הסולם והרוח הגבית להשלמת הניסוי מגבירה את העקביות ומדלגת על הצורך בהתערבות נסיין המהווה מקור עיקרי לשונות.
מערכת מדחס אוויר נדרשת כדי לייצר זרימת אוויר שניתן להתאים לכיוון ולמיקום של העכבר. זרימת האוויר יוצרת רוח נגדית של 30 קמ"ש מהכיוון הנגדי כאשר עכבר מנסה לעזוב את תיבת המטרה לפני תחילת הניסוי המתוכנן, מה שגורם לעכברים לחזור לקופסת המטרה. הוא גם מייצר רוח גבית קבועה (1 עד 16 קמ"ש) במהלך הניסוי עד שהעכבר חוצה לחלוטין את הסולם ונכנס לתיבת המטרה הנגדית. ללא האוויר הלחוץ כתמריץ לחצות את הסולם, עכברים עוצרים לעתים קרובות על השלבים והופכים כיוונים בקצב נינוח, מה שמציג משתנה גישוש שאינו מועיל לניתוח.
הפרוטוקול הסטנדרטי המתואר כאן מספק מדידות של קואורדינציה מוטורית עדינה בסיסית ולמידה (מפגשים ללא הפרעות), כמו גם של הסתגלות לאתגרים ולמידה מוטורית אסוציאטיבית (מפגשי אתגר) על פני טווח זמן של 8 ימים. המשימה קלה עבור זני עכברי WT המשמשים בדרך כלל למחקרים במדעי המוח כגון עכברי C57Bl6J המשמשים כאן, והיא בטוחה, ללא פציעות שנצפו באף אחד ממפגשי הבדיקה. בנוסף, לא זיהינו סימני עייפות בהשוואה לבדיקות מוטוריות אחרות כמו רוטרוד או הליכון.
במהלך השלב הראשוני בן 4 הימים, עכברי WT שולטים במיומנות וחוצים את הסולם על-ידי למידה לאמץ את דפוס הריצה היעיל ביותר (צעדי H-H), וצעדים שגויים מתרחשים לעתים רחוקות ביום 4 (איור 2B,C). ביום 5 של השלב השני, עכברים איטיים יותר כשהם נתקלים לראשונה במכשול, אבל מסתגלים במהירות (איור 3, בארה"ב בלבד). צימוד המכשול עם גירוי התניה (טון) מאפשר למידה במידה שמשך הניסיון שווה לניסויים שבהם המכשול אינו מוצג (איור 3, זוגי). יש לציין שמספר הניסויים עם צעדים שגויים נשאר קבוע לאורך כל הניסויים בארה"ב בלבד (איור 4A), בעוד ירידה משמעותית נצפתה במפגשים זוגיים (איור 4A), מה שאישר את היעילות של תהליך הלמידה האסוציאטיבית.
אנו מציעים זרימת עבודה לניתוח פרמטרים מייצגים המסופקים על ידי תוכנת סולם ארסמוס. ניתוח רגרסיה של כוח אפשר לנו לרשום עקומות למידה משמעותיות ולזהות הבדלים בלמידה מאותגרת לעומת אסוציאטיבית באמצעות ארבעה עכברי WT. בהתבסס על ספרות נוספת וניסויי פיילוט, תכנוני ניסוי הכוללים עכברים מוטנטיים או מטופלים עשויים לדרוש הגדלת מספר העכברים ל-7-10 עכברים 4,5,6. בידינו, 42 ניסויים בכל מפגש היה מספר אופטימלי להשגת נתונים חזקים עם קבוצת עכברים קטנה, מכיוון שממוצע של מספר ניסויים מקטין את השונות. בעוד שהמספר עשוי להיראות גבוה, כל 42 מפגשי ניסיון אורכים בין 15 דקות ל -35 דקות, וניתן לבדוק 12-16 עכברים באופן סביר ביום. משך הניסיון (כולל זמן המנוחה והתגובה לרמזים בתוספת הזמן לחצות את הסולם) נע בין 20 שניות ל-50 שניות, בהתאם ליום האימון ולסוג הניסוי.
עם זאת, הרבגוניות של המערכת תאפשר לחוקרים לתכנן פרוטוקולים מותאמים אישית על ידי התאמת הגדרות שונות, כולל מספר המפגשים והניסויים ביום, עוצמת ומשך הרמזים ומדעי המחשב, כמו גם האופי של ארה"ב. לדוגמה, הנתונים שלנו הראו עקומת למידה מהירה בעכברי WT, במיוחד בין היום הראשון ליום השני לאחר שהביצועים מגיעים לרמה (איורים 2B,C). זה הציע כי 2 ימים נוספים לא יכול להיות הכרחי בהחלט לבדיקת למידה מוטורית בסיסית במפגשים ללא הפרעה, ושינויים בפרוטוקול הסטנדרטי ניתן ליישם על ידי קיצור משך האימון רק 2 ימים. עם זאת, ייתכן שהתאמה זו אינה מתאימה לשלב השני של הפרוטוקול, המשלב ניסויים משולבים ללא הפרעה, בארה"ב בלבד, CS בלבד וניסויים זוגיים. הגירויים מוצגים באופן אקראי ובלתי צפוי כדי להעריך התנהגויות ספציפיות, והצורך לחלק את הניסויים לארבע קטגוריות אלה הופך את 42 למספר מתאים של ניסויים הדרושים לכוח סטטיסטי. לפיכך, ארגון מחדש של הפרוטוקול יצטרך להעריך את ההיתכנות של הפחתת מספר הניסויים ללא הפרעה או הגדלת משפטי אתגר ספציפיים. מרווח הגירוי הבין-גירוי (ISI) בין CS (90 dB, 15 kHz טון) ו-US, כאן מוגדר על 250 ms, יכול להיות מגוון גם כדי לחקור את הקשר בין גירוי לתגובה. התאמה מסוג זה תאפשר לחוקרים להעלות את רמת הקושי או להתמקד בהתנהגויות שונות בהתאם לשאלה המדעית.
עד כה, סולם ארסמוס שימש בעיקר כדי לזהות פגמים עדינים בתיאום מוטורי ממוצא המוח הקטן. לדוגמה, צעדים שגויים הם מדד לתיאום תנועתי של כל הגוף. במחקר זה נעשה שימוש בעכברים בוגרים צעירים, אך עכברים צעירים כמו P23 שימשו אחרים כדי לחקור את ההבשלה של תפקודים מוטוריים 7,8. פתולוגיות איפסילטרליות ממוצא מרכזי ניתן ללמוד באמצעות ניתוח מפלה של המיקום של כפות ימין ושמאל של העכבר. לבסוף, שליטה במיומנויות מוטוריות בסולם ארסמוס מערבת ככל הנראה מעגלי בקרה מוטוריים אחרים, המערבים את גרעיני הבסיס, קליפת המוח המוטורית ונתיבי חיבור, כולל כפיס המוח. שילוב פרדיגמה התנהגותית זו עם טכניקות תאיות, מולקולריות ומעגלים יהיה שימושי לחקר מנגנוני מעגלים המתווכים הסתגלות מוטורית וניתן לרתום אותם להגברת הלמידה המוטורית. דוגמה אחת כזו תהיה לחקור את ההשפעה על מיאלינציה אקסונלית, שהיא רגישה מאוד לרכישת מיומנויות מוטוריות עדינות במודלים עכבריים של דמיאלינציה 9,10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים לטכנאי האודיו-ויזואלי ומפיק הווידיאו רבקה דה לאס הראס פונסה, כמו גם לווטרינר הראשי גונזלו מורנו דל ואל, על הפיקוח על שיטות עבודה טובות במהלך ניסויים בעכברים. העבודה מומנה על ידי מענקים מתוכנית המצוינות GVA (2022/8) וסוכנות המחקר הספרדית (PID2022143237OB-I00) לאיזבל פרז-אוטניו.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6J mice (Mus musculus) | Charles Rivers | ||
| Erasmus Ladder device | Noldus, Wageningen, Netherlands | ||
| Erasmus Ladder 2.0 software | Noldus, Wageningen, Netherlands | ||
| Excel software | Microsoft | ||
| Sigmaplot software | Systat Software, Inc. |
References
- Brooks, S. P., Dunnett, S. B. Tests to assess motor phenotype in mice: a user's guide. Nat. Rev. Neurosci. 10 (7), 519-529 (2009).
- Noldus. , https://www.noldus.com/erasmusladder (2023).
- Cupido, A., et al. Detecting cerebellar phenotypes with the Erasmus ladder[dissertation]. , Erasmus University Rotterdam PhD dissertation. (2009).
- Van Der Giessen, R. S. Role of olivary electrical coupling in cerebellar motor learning. Neuron. 58 (4), 599-612 (2008).
- Vinueza Veloz, M. F. The effect of an mGluR5 inhibitor on procedural memory and avoidance discrimination impairments in Fmr1 KO mice. Genes Brain Behav. 11 (3), 325-331 (2012).
- Vinueza Veloz, M. F. Cerebellar control of gait and interlimb coordination. Brain Struct. Funct. 220 (6), 3513-3536 (2015).
- Sathyanesan, A., Kundu, S., Abbah, J., Gallo, V. Neonatal brain injury causes cerebellar learning deficits and Purkinje cell dysfunction. Nat. Commun. 9 (1), 3235 (2018).
- Sathyanesan, A., Gallo, V. Cerebellar contribution to locomotor behavior: A neurodevelopmental perspective. Neurobiol. Learn Mem. 165, 106861 (2019).
- McKenzie, I. A. Motor skill learning requires active central myelination. Science. 346 (6207), 318-322 (2014).
- Xiao, L. Rapid production of new oligodendrocytes is required in the earliest stages of motor-skill learning. Nat. Neurosci. 19 (9), 1210-1217 (2016).
