Verwendung des CUT&Tag-Assays (Cleavage under Targets and Tagmentation) in der Maus-Myoblastenforschung
Summary
Forscher, die neu auf dem Gebiet der Epigenetik sind, werden in CUT&Tag eine deutlich einfachere Alternative zu ChIP-Assays finden. CUT&Tag hat die epigenetischen Studien an seltenen und primären Zellpopulationen enorm begünstigt und qualitativ hochwertige Daten von sehr wenigen Zellen generiert. Dieses Protokoll beschreibt die Durchführung von H3K4me1 CUT&Tag-Assays an Mausmyoblasten, die aus den Hintergliedmaßenmuskeln der Maus isoliert wurden.
Abstract
Dieses Protokollpapier soll den neuen Forschern alle Einzelheiten zur Verwendung von Cleavage Under Targets and Tagmentation (CUT&Tag) zur Erstellung eines Profils der genomischen Positionen von Chromatinbindungsfaktoren, Histonmarkierungen und Histonvarianten liefern. CUT&Tag-Protokolle funktionieren sehr gut mit Maus-Myoblasten und frisch isolierten Muskelstammzellen (MuSCs). Sie können problemlos auf viele andere Zelltypen angewendet werden, solange die Zellen durch Concanavalin-A-Kügelchen immobilisiert werden können. Im Vergleich zu CUT&Tag sind Chromatin-Immunpräzipitations-Assays (ChIP) zeitaufwändige Experimente. ChIP-Assays erfordern eine Vorbehandlung des Chromatins, bevor das chromatische Material für die Immunpräzipitation verwendet werden kann. Bei der Vernetzung von ChIP (X-ChIP) umfasst die Vorbehandlung des Chromatins die Vernetzung und Beschallung, um das Chromatin zu fragmentieren. Im Falle von nativem ChIP (N-ChIP) werden die fragmentierten Chromatine normalerweise durch den Verdau der Mikrokokken-Nuklease (MNase) erreicht. Sowohl die Beschallung als auch der MNase-Aufschluss führen zu einer gewissen Verzerrung der ChIP-Experimente. CUT&Tag-Assays können in weniger Schritten abgeschlossen werden und benötigen im Vergleich zu ChIPs viel weniger Zellen, liefern aber unvoreingenommenere Informationen über Transkriptionsfaktoren oder Histonmarkierungen an verschiedenen genomischen Stellen. CUT&Tag kann mit nur 5.000 Zellen auskommen. Aufgrund der höheren Empfindlichkeit und des geringeren Hintergrundsignals als bei ChIPs können Forscher nach der Sequenzierung mit zuverlässigen Spitzendaten von nur wenigen Millionen Reads rechnen.
Introduction
Der CUT&Tag-Assay wurde entwickelt, um einige offensichtliche Fehler von ChIPs1 zu kompensieren. Die beiden Hauptnachteile von ChIPs sind 1) die Verzerrung bei der Fragmentierung des Chromatins und 2) die Inkompetenz, mit niedrigen Zellzahlen zu arbeiten. X-ChIP-Assays beruhen entweder auf Ultraschall oder MNase-Verdau, um Chromatinfragmente zu erhalten, während N-ChIP hauptsächlich den MNase-Verdau verwendet, um Nukleosomen zu gewinnen. Die Beschallung zeigt eine Tendenz zu entspannten Chromatinstellen wie den Promotorregionen2, und anscheinend funktioniert der MNase-Verdau auch auf entspannten Chromatinfasern effizienter. Darüber hinaus berichteten einige, dass der MNase-Verdau auch eine DNA-sequenzabhängige Verzerrung aufweist3. Daher ist es bei der Eingangsvorbereitung von ChIP-Assays unmöglich, Chromatinfragmente von allen möglichen genomischen Stellen auf völlig zufällige Weise zu gewinnen. Darüber hinaus erzeugen ChIP-Assays im Vergleich zu CUT&Tag in der Regel höhere Hintergrundsignale und erfordern mehr als 10-mal mehr Lesevorgänge als CUT&Tag, um zu betonen, wo die Peaksbei 1,4,5 liegen. Dies erklärt, warum ChIP-Experimente mit enorm mehr Zellen beginnen müssen als CUT&Tag. Dies ist bei der Untersuchung von Zelllinien kein Problem, da sie wiederholt passaget werden können, um eine sehr hohe Zellzahl zu erreichen. Der ChIP-Assay ist jedoch definitiv kein starkes epigenetisches Werkzeug zur Untersuchung seltener oder wertvoller primärer Zellpopulationen, obwohl Primärzellen offensichtlich praktischere und medizinische Implikationen haben.
Während das lange und komplizierte ChIP-Verfahren einige Forscher davon abhält, diese Technik zu erlernen oder anzuwenden, fühlen sich die Menschen mit einfacheren Assays wie Immunzytochemie (ICC) oder Immunfluoreszenz (IF) wohler. Ein CUT&Tag-Assay ähnelt im Wesentlichen dem Ablauf von ICC- und IF-Experimenten, findet aber nur im Reagenzglas statt. CUT&Tag benötigt zunächst kein fragmentiertes Chromatin, stattdessen muss das Genom für die Antikörperbindungintakt sein 1. Am ersten Tag eines ChIP-Experiments verbringen die Forscher normalerweise bis zu 4 Stunden damit, die fragmentierten Chromatine aus Zellkernen durch Ultraschall oder MNase-Verdau vorzubereiten, bevor die kurzen Chromatinstücke mit Antikörper-Kügelchen gemischt werdenkönnen 4,5. Im bemerkenswerten Gegensatz dazu besteht die Arbeitsbelastung am ersten Tag eines CUT&Tag-Verfahrens darin, die Zellen einfach an Concanavalin-A-Kügelchen zu immobilisieren und dann den primären Antikörper auf die Zellkügelchen zu geben. Dies dauert nur ~40 min1.
Es ist erwähnenswert, dass Cloavage Under Targets and Release Using Nuclease (CUT&RUN) eine wichtige Alternative zu CUT&Tag ist. CUT&RUN wurde auf der Grundlage eines ähnlichen Arbeitsmechanismus wie CUT&TAG entwickelt. In CUT&TAG leiten die Antikörper die pA/G-Tn5-Transposase zu allen Stellen, an denen das Enzym jeweils ein Stück Chromatin herausschneidet und es in der Zwischenzeit mit bibliotheksbildenden Adaptern markiert, während bei CUT&RUN die Rolle von pA/G-Tn5 von der pA/G-MNase gespielt wird, die nur den schneidenden Teil der Arbeit übernimmt6. Daher erfordert CUT&RUN im Vergleich zu CUT&TAG einen zusätzlichen Schritt, nämlich das Aufkleben der Library-Making-Adapter auf die pA/G-MNase-fragmentierten DNA-Stücke 7,8. Aufgrund der hohen Ähnlichkeiten zwischen CUT&Tag und CUT&RUN werden sich Forscher, die mit CUT&TAG vertraut sind, leicht an die kompetente Durchführung von CUT&RUN gewöhnen. Es ist jedoch zu beachten, dass es zwischen CUT&Tag und CUT&RUN einige geringfügige Unterschiede gibt. CUT&RUN-Protokolle verwenden normalerweise die physikalische Salzkonzentration (~150 mM) in den Waschschritten, während in CUT&Tag der 300-Dig-Waschpuffer einen hohen Salzgehalt aufweist. Daher ist CUT&Tag gut in der Lage, den Hintergrund bei der Profilierung von Histonmarkierungen/-varianten oder Transkriptionsfaktoren zu kontrollieren, da diese Proteine direkt und stark an DNA1 binden. CUT&Tag kann bei der Profilierung von Chromatin-assoziierten Faktoren, die nicht direkt an die DNA binden und eine schwache Affinität zum Chromatin aufweisen, auf Probleme stoßen. Waschschritte mit hohem Salzgehalt in CUT&Tag können Chromatin-assoziierte Faktoren entfernen und keine Signale in der Endausgabe verursachen. Obwohl es erfolgreiche Fälle gibt, in denen CUT&Tag verwendet werden kann, um einige Proteine ohne Histon/Nicht-Transkriptionsfaktor zu profilieren9, empfehlen wir immer noch CUT&RUN anstelle von CUT&Tag, um schwach gebundene Chromatin-assoziierte Proteine zu profilieren.
Nachdem Säugetiere das Erwachsenenalter erreicht haben, enthält ihr Skelettmuskelgewebe immer noch Muskelstammzellen. Während einer Muskelverletzung können diese Stammzellen aktiviert werden und eine Zellzahlerweiterung und -differenzierung erfahren, um geschädigte Muskelfasern zu regenerieren10. Diese Stammzellen werden als Muskelstamm-/Satellitenzellen (MuSCs) bezeichnet. Nachdem MuSCs aus Tieren isoliert oder durch Muskelverletzungen aktiviert wurden, beginnen sie sich zu vermehren und werden zu Myoblasten.
Um MuSCs aus dem Skelettmuskelverdau von Mäusen zu erhalten, werden MuSC-Oberflächenmarker wie Vcam1 (Cd106), Cd34 und α7-Integrin (Itga7) häufig einzeln oder in Kombinationen verwendet, um MuSCs während der fluoreszenzaktivierten Zellsortierung (FACS) anzureichern11. Es hat sich gezeigt, dass Cd31–/CD45–/Sca1-/Vcam1+ wahrscheinlich die beste Markerkombination ist, um >95% reine MuSCs12 zu erhalten. FACS kann reine MuSCs direkt nach der Verdauung frischer Muskeln isolieren. Wenn das Versuchsdesign jedoch keine reinen MuSCs direkt bei ihrer Isolierung erfordert, ist die Präplattierung kostengünstiger als FACS, um >90% reine Myoblasten (MuSC-Nachkommen) zu erhalten.
MuSCs, die frisch aus Mäusen isoliert wurden, vermehren sich nicht effizient in Hams F10-Medien, die mit fötalem Rinderserum (FBS) ergänzt werden. Um die Zellzahl der MuSCs besser zu erhöhen und ausreichend Myoblasten zu erhalten, sollte anstelle von FBS Rinderwachstumsserum (BGS) verwendet werden. Wenn jedoch kein BGS verfügbar ist, können Hams F10-Vollmedien (die etwa 20 % FBS enthalten) mit einem gleichen Volumen an T-Zell-bedingten Medien gemischt werden, um die Myoblastenexpansion dramatisch zu fördern13. Daher wird in diesem Protokoll auch die Herstellung von T-Zell-Medien, konditionierten MuSC-Medien, beschrieben.
Am wichtigsten ist, dass dieses Protokoll ein vollständiges Beispiel für die Durchführung von H3K4me1 CUT&Tag-Assays an Maus-Myoblasten liefert, die aus den Muskeln der Hintergliedmaßen der Maus isoliert wurden. Bitte beachten Sie, dass dieses Protokoll auch für andere Zelltypen und Histonmarkierungen und Histonvarianten gilt und die Leser nur die Zellzahlen oder Antikörpermengen für ihre Fälle optimieren müssen, basierend auf der Anreicherung der spezifischen Histonmarkierungen oder Varianten, die sie untersuchen.
Um in CUT&Tag oder CUT&RUN verwendet werden zu können, muss das Tn5 oder die MNase mit Protein A oder Protein G fusioniert werden, um pA-Tn5, pG-Tn5, pA-MNase oder pG-MNase herzustellen. Anscheinend können sowohl Protein A als auch Protein G gleichzeitig mit diesen Enzymen fusioniert werden, um pA/G-Tn5 oder pA/G-MNase zu erzeugen. Protein A und Protein G zeigen unterschiedliche Affinitäten zu IgGs verschiedener Spezies. Daher kann die Fusion von Protein A und Protein G zusammen mit dem Enzym dieses Problem lösen und das Enzym mit Antikörpern aus mehreren Spezies kompatibel machen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die spezifische Zellzahl, die für eine bestimmte CUT&Tag-Reaktion erforderlich ist, hängt vollständig von der Anreicherung der Histonmarkierungen/-varianten oder Chromatin-bindenden Proteine ab, die getestet werden sollen. Normalerweise sind für sehr angereicherte Histonmarkierungen wie H3K4me1, H3K4me3 und H3K27ac usw. 25.000-50.000 Myoblasten für eine CUT&Tag-Reaktion völlig ausreichend. Einige seltene Chromatin-bindende Proteine könnten jedoch bis zu 250.000 Zellen benötigen. Die in CUT&Tag-Assays verwendete Z…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde unterstützt durch das Strategic Priority Research Program der Chinesischen Akademie der Wissenschaften (XDA16020400 bis PH); die National Natural Science Foundation of China (32170804 bis PH).
Materials
| bFGF | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Collagen | Corning | 354236 | |
| Collagenase II | Worthington | LS004177 | |
| Concanavalin-A | Sigma-Aldrich | C5275 | |
| Concanavalin-A beads | Bangs Laboratories | BP531 | |
| Digitonin | Sigma-Aldrich | 300410 | |
| Dispase II | Thermo Fisher Scientific | 17105041 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30396.03 | |
| H3K4me1 antibody | abcam | ab8895 | |
| Ham's F10 media | Thermo Fisher Scientific | 11550043 | |
| Hyperactive Universal CUT&Tag Assay Kit for Illumina | Vazyme | TD903 | This kit has been tested by us to function well |
| Magnetic rack for 1.5 mL EP tubes | Qualityard | QYM06 | |
| Magnetic rack for 8-PCR tube stripes | Anosun Magnetic | CLJ16/21-021 | |
| NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix | NEB | M0541L | For library-making PCR reaction |
| pA-Tn5 | Vazyme | S603-01 | Needs to be mounted with adaptors before use |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | 5056489001 | |
| Proteinase K | Beyotime | ST535-100mg | |
| RPMI-1640 media | Thermo Fisher Scientific | C11875500BT | |
| Secondary antibody (Guinea Pig anti-rabbit IgG) | Antibodies-online | ABIN101961 | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | S2626 | |
| TruePrep Index Kit V2 for Illumina | Vazyme | TD202 | This kit provide Illumina N7XX and N5XX primers |
| VAHTS DNA Clean Beads | Vazyme | N411 | Can substitute Ampure XP beads. Can purify CUT&Tag libraries and select DNA fragments by size |
References
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