CRISPR-Cas9 genomredigering af rotteembryoner ved hjælp af adenoassocieret virus (AAV) og 2-celle embryoelektroporation
Summary
Denne protokol præsenterer en optimeret tilgang til fremstilling af genetisk modificerede rottemodeller. Adeno-associeret virus (AAV) bruges til at levere en DNA-reparationsskabelon, og elektroporation bruges til at levere CRISPR-Cas9-reagenser for at fuldføre genomredigeringsprocessen i 2-celleembryo.
Abstract
Genomredigeringsteknologi bruges i vid udstrækning til at producere genetisk modificerede dyr, herunder rotter. Cytoplasmatisk eller pronukleær injektion af DNA-reparationsskabeloner og CRISPR-Cas-reagenser er den mest almindelige leveringsmetode i embryoner. Denne type mikromanipulation kræver imidlertid adgang til specialudstyr, er besværlig og kræver et vist niveau af teknisk dygtighed. Desuden resulterer mikroinjektionsteknikker ofte i lavere embryooverlevelse på grund af den mekaniske belastning på embryoet. I denne protokol udviklede vi en optimeret metode til at levere store DNA-reparationsskabeloner til at arbejde sammen med CRISPR-Cas9-genomredigering uden behov for mikroinjektion. Denne protokol kombinerer AAV-medieret DNA-levering af enkeltstrengede DNA-donorskabeloner sammen med levering af CRISPR-Cas9 ribonukleoprotein (RNP) ved elektroporation for at modificere 2-cellede embryoner. Ved hjælp af denne nye strategi har vi med succes produceret målrettede knock-in rottemodeller, der bærer indsættelse af DNA-sekvenser fra 1,2 til 3,0 kb i størrelse med effektivitetsgevinster mellem 42% og 90%.
Introduction
Udviklingen af CRISPR-baserede genomredigeringsværktøjer har accelereret vores evne til effektivt at generere nye og mere sofistikerede gensplejsede rottemodeller. Single-guide RNA, sammen med Cas9-nuklease, kombineres til dannelse af ribonukleoprotein (RNP) komplekser, der målretter DNA-sekvenser af interesse inden for genomet og resulterer i dobbeltstrengede DNA-brud. Fordi cellulære DNA-reparationsmekanismer er udsat for fejl, introduceres indsættelser og deletioner (INDEL’er) under reparationsprocessen, der kan forstyrre et målgens funktion. Når der er samtidig levering af en ønsket konstrueret DNA-sekvens (reparationsskabelon) sammen med genomredigeringsreagenser, sker indsættelse af reparationsskabelonen i regionen, der indeholder det dobbeltstrengede DNA-brud, gennem en proces kaldet homologi-rettet reparation (HDR). Dette er en effektiv strategi til generering af dyremodeller med målrettede DNA-indsættelser/substitutioner (knock-ins). En begrænsning er, at knock-in-sekvenser ofte er store i størrelse, hvilket har vist sig at reducere genredigeringseffektiviteten, hvilket gør det vanskeligere at generere den ønskede model1. Strategier til at øge knock-in-effektiviteten har inkluderet linearisering af både dobbeltstrenget DNA (dsDNA) og enkeltstrenget DNA (ssDNA) reparationsskabeloner og kemisk modifikation af DNA-reparationsskabeloner 2,3,4. Derudover er pronukleær mikroinjektion sammen med HDR-stimulerende forbindelser, anvendelse af elektriske impulser i forbindelse med mikroinjektion og tidsbestemt mikroinjektion i 2-celleembryoner alle forsøgt 5,6,7. På trods af succesen med nogle af disse tilgange er inkorporeringen af DNA-sekvenser større end 1,0 kb stadig teknisk udfordrende.
Elektroporation, som er en almindelig metode til at indføre reagenser i dyrkede cellelinjer, tilbyder et alternativ til mikroinjektion til levering af CRISPR-Cas9-komponenter i embryoner. Embryoelektroporation, der først blev påvist i rotteembryoner8, er siden blevet anvendt med succes som leveringsmetode i mus 9,10,11,12,13, svin14,15 og andre dyremodelorganismer 16,17,18. Embryoner, suspenderet i mediet indeholdende CRISPR-Cas9-reagenser, anbringes i en kuvette eller på et glasglas mellem to elektroder og udsættes for direkte impulser af elektriske strømme. Dette skaber forbigående åbninger i zona pellucida og embryoplasmamembranen, hvorigennem CRISPR-Cas9-komponenterne kommer ind i embryonerne. Typisk bruges elektriske “poring” impulser på mellemniveau til at skabe de midlertidige åbninger efterfulgt af elektriske “overførselsimpulser” på lavere niveau, der letter bevægelsen af de negativt ladede genomredigeringskomponenter. Embryoelektroporation er effektiv, har en høj gennemstrømning og er let at udføre. Mens embryoelektroporation har vist sig at være meget vellykket til introduktion af små (<200 bp) ssDNA-reparationsskabeloner, er der få rapporter om vellykket elektroporation af større (>1,0 kb) reparationsskabeloner13,19. Denne størrelsesbegrænsning udgør en væsentlig begrænsning af embryoelektroporation til generering af knock-in dyremodeller, der kræver store indsættelser.
I forbindelse med genterapi har adenoassocierede vira (AAV’er) længe været brugt som køretøjer til at levere genetisk materiale på grund af deres effektive in vivo-infektivitet af både delende og ikke-delende celler, mangel på patogenicitet og sjælden genomisk integration20,21. For nylig har flere undersøgelser kombineret AAV’er med CRISPR-Cas9-teknologi for at introducere DNA-reparationsskabeloner og CRISPR-reagenser 22,23,24. Denne tilgang tillader levering af større DNA-reparationsskabeloner uden behov for mikroinjektionsteknikker.
HDR-vejen er mere aktiv i de sene S- og G2-faser af cellecyklussen25,26. I studier udført in vitro blev signifikante stigninger i knock-in-effektivitet opnået ved levering af CRISPR-Cas9 RNP’er og DNA-reparationsskabeloner til G2-synkroniserede celler eller ved begrænsning af tilstedeværelsen af Cas9-protein til sene S- og G2-faser under anvendelse af et Cas9-Geminin-fusionsprotein2. Desuden er der en større zygotisk genomaktivering (ZGA) begivenhed, der forekommer under den udvidede G2-fase af 2-cellestadiet embryo, og dette er forbundet med en åben kromatintilstand. Det spekuleres i, at dette giver CRISPR-Cas9 RNP’erne og reparationsskabelonerne større tilgængelighed til det genomiske DNA.
Vores mål var at bygge videre på alle disse observationer ved at kombinere AAV-tilgangen med embryoelektroporation for at introducere CRISPR-Cas9 RNP’er på 2-cellestadiet af embryoudvikling. Denne strategi udnytter AAV’s større DNA-reparationsskabelonleveringskapacitet, den tekniske lethed ved elektroporation og det mere optimale 2-celles tidspunkt for genomisk tilgængelighed under embryoudvikling for at skabe en effektiv metode til målrettet gensplejsning af DNA-indsættelser. Som fremhævet i denne protokol giver vores optimerede metode mulighed for produktion af målrettede knock-in rottemodeller, der bærer indsættelser af DNA-sekvenser fra 1,2 til 3,0 kb i størrelse uden behov for mikroinjektionsteknikker.
Protocol
Representative Results
Discussion
CRISPR-Cas genomredigeringssystemet har revolutioneret området for genteknologi ved at muliggøre effektiv produktion af både enkle og komplekse, tilpassede genetiske modifikationer i en række dyrearter. Hyppige forbedringer og forbedringer i teknikker forbundet med genomredigering fremmer dens alsidighed. Her har vi beskrevet en ny tilgang ved hjælp af ssAAV-medieret DNA-levering sammen med 2-celle embryoelektroporation af CRISPR-Cas9-reagenser i 2-cellede gnaverembryoner. Vi har vist, at dette er en effektiv måde …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne takke Nolan Davis for hjælp med videografi og videoredigering.
Materials
| Leads with alligator clips for electrodes | NepaGene | C117 | |
| Mineral oil | MilliporeSigma | M5310 | |
| NepaGene21 Super Electroporator | NepaGene | NEPA21 | |
| Platinum plate electrodes on slide glass | NepaGene | CUY501P1-1.5 | |
| PURedit Cas9 Protein | MilliporeSigma | PECAS9 | |
| sgRNA (chemically-modified) | Synthego | N/A | |
| ssAAV1 or ssAAV6 packaged DNA repair template | Vectorbuilder | N/A |
References
- Lau, C. H., Tin, C., Suh, Y. CRISPR-based strategies for targeted transgene knock-in and gene correction. Fac Rev. 9, 20 (2020).
- Gutschner, T., Haemmerle, M., Genovese, G., Draetta, G. F., Chin, L. Post-translational Regulation of Cas9 during G1 Enhances Homology-Directed Repair. Cell Rep. 14 (6), 1555-1566 (2016).
- Zhang, J. P., et al. Efficient precise knockin with a double cut HDR donor after CRISPR/Cas9-mediated double-stranded DNA cleavage. Genome Biol. 18 (1), 35 (2017).
- Miura, H., Quadros, R. M., Gurumurthy, C. B., Ohtsuka, M. Easi-CRISPR for creating knock-in and conditional knockout mouse models using long ssDNA donors. Nat Protoc. 13 (1), 195-215 (2018).
- Gu, B., Posfai, E., Gertsenstein, M., Rossant, J. Efficient generation of large-fragment knock-in mouse models using 2-cell (2C)-homologous recombination (HR)-CRISPR. Curr Protoc Mouse Biol. 10 (1), e67 (2020).
- Gu, B., Posfai, E., Rossant, J. Efficient generation of targeted large insertions by microinjection into two-cell-stage mouse embryos. Nat Biotechnol. 36 (7), 632-637 (2018).
- Kurihara, T., et al. DNA repair protein RAD51 enhances the CRISPR/Cas9-mediated knock-in efficiency in brain neurons. Biochem Biophys Res Commun. 524 (3), 621-628 (2020).
- Kaneko, T., Sakuma, T., Yamamoto, T., Mashimo, T. Simple knockout by electroporation of engineered endonucleases into intact rat embryos. Sci Rep. 4, 6382 (2014).
- Chen, S., Lee, B., Lee, A. Y., Modzelewski, A. J., He, L. Highly efficient mouse genome editing by CRISPR ribonucleoprotein electroporation of zygotes. J Biol Chem. 291 (28), 14457-14467 (2016).
- Hashimoto, M., Yamashita, Y., Takemoto, T. Electroporation of Cas9 protein/sgRNA into early pronuclear zygotes generates non-mosaic mutants in the mouse. Dev Biol. 418 (1), 1-9 (2016).
- Wang, W., et al. Delivery of Cas9 protein into mouse zygotes through a series of electroporation dramatically increases the efficiency of model creation. J Genet Genomics. 43 (5), 319-327 (2016).
- Troder, S. E., et al. An optimized electroporation approach for efficient CRISPR/Cas9 genome editing in murine zygotes. PLoS One. 13 (5), e0196891 (2018).
- Teixeira, M., et al. Electroporation of mice zygotes with dual guide RNA/Cas9 complexes for simple and efficient cloning-free genome editing. Sci Rep. 8 (1), 474 (2018).
- Tanihara, F., et al. Efficient generation of GGTA1-deficient pigs by electroporation of the CRISPR/Cas9 system into in vitro-fertilized zygotes. BMC Biotechnol. 20 (1), 40 (2020).
- Tanihara, F., et al. Generation of CD163-edited pig via electroporation of the CRISPR/Cas9 system into porcine in vitro-fertilized zygotes. Anim Biotechnol. 32 (2), 147-154 (2021).
- Camargo, L. S. A., Owen, J. R., Van Eenennaam, A. L., Ross, P. J. Efficient one-step knockout by electroporation of ribonucleoproteins into zona-intact bovine embryos. Front Genet. 11, 570069 (2020).
- Lin, J. C., Van Eenennaam, A. L. Electroporation-mediated genome editing of livestock zygotes. Front Genet. 12, 648482 (2021).
- Betters, E., Charney, R. M., Garcia-Castro, M. I. Electroporation and in vitro culture of early rabbit embryos. Data Brief. 21, 316-320 (2018).
- Miyasaka, Y., et al. CLICK: one-step generation of conditional knockout mice. BMC Genomics. 19 (1), 318 (2018).
- Epstein, B. E., Schaffer, D. V. Combining engineered nucleases with adeno-associated viral vectors for therapeutic gene editing. Adv Exp Med Biol. 1016, 29-42 (2017).
- Gaj, T., Epstein, B. E., Schaffer, D. V. Genome engineering using adeno-associated virus: basic and clinical research applications. Mol Ther. 24 (3), 458-464 (2016).
- Chen, S., et al. CRISPR-READI: Efficient generation of knockin mice by CRISPR RNP electroporation and AAV donor infection. Cell Rep. 27 (13), 3780-3789 (2019).
- Mizuno, N., et al. Intra-embryo gene cassette knockin by CRISPR/CAS9-mediated genome editing with adeno-associated viral vector. iScience. 9, 286-297 (2018).
- Davis, D. J., et al. Efficient DNA knock-in using AAV-mediated delivery with 2-cell embryo CRISPR-Cas9 electroporation. Front Genome Ed. 5, 1256451 (2023).
- Smirnikhina, S. A., Zaynitdinova, M. I., Sergeeva, V. A., Lavrov, A. V. Improving homology-directed repair in genome editing experiments by influencing the cell cycle. Int J Mol Sci. 23 (11), (2022).
- Takata, M., et al. Homologous recombination and non-homologous end-joining pathways of DNA double-strand break repair have overlapping roles in the maintenance of chromosomal integrity in vertebrate cells. EMBO J. 17 (18), 5497-5508 (1998).
- Men, H., Stone, B. J., Bryda, E. C. Media optimization to promote rat embryonic development to the blastocyst stage in vitro. Theriogenology. 151, 81-85 (2020).
- Men, H., Amos-Landgraf, J. M., Bryda, E. C., Franklin, C. L. KSOM-R supports both mouse and rat preimplantation embryo development in vitro. Theriogenology. 198, 69-74 (2023).
- Romeo, C., et al. AAV diffuses across zona pellucida for effortless gene delivery to fertilized eggs. Biochem Biophys Res Commun. 526 (1), 85-90 (2020).
- Fulka, J., Moor, R. M., Fulka, J. Electrofusion of mammalian oocytes and embryonic cells. Methods Mol Biol. 48, 309-316 (1995).
- Rems, L., et al. Cell electrofusion using nanosecond electric pulses. Sci Rep. 3, 3382 (2013).
