CRISPR-Cas9 एडेनो-एसोसिएटेड वायरस (AAV) और 2-सेल भ्रूण इलेक्ट्रोपोरेशन का उपयोग करके चूहा भ्रूण का जीनोम संपादन
Summary
इस प्रोटोकॉल आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहा मॉडल के उत्पादन के लिए एक अनुकूलित दृष्टिकोण प्रस्तुत करता है. एडेनो-जुड़े वायरस (एएवी) का उपयोग डीएनए मरम्मत टेम्पलेट देने के लिए किया जाता है, और 2-सेल भ्रूण में जीनोम संपादन प्रक्रिया को पूरा करने के लिए सीआरआईएसपीआर-कैस 9 अभिकर्मकों को वितरित करने के लिए इलेक्ट्रोपोरेशन का उपयोग किया जाता है।
Abstract
जीनोम संपादन तकनीक का व्यापक रूप से चूहों सहित आनुवंशिक रूप से संशोधित जानवरों के उत्पादन के लिए उपयोग किया जाता है। डीएनए मरम्मत टेम्पलेट्स और सीआरआईएसपीआर-सीएएस अभिकर्मकों के साइटोप्लाज्मिक या प्रोन्यूक्लियर इंजेक्शन भ्रूण में सबसे आम वितरण विधि है। हालांकि, इस प्रकार के माइक्रोमैनिपुलेशन के लिए विशेष उपकरणों तक पहुंच की आवश्यकता होती है, श्रमसाध्य है, और इसके लिए एक निश्चित स्तर के तकनीकी कौशल की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, माइक्रोइंजेक्शन तकनीक अक्सर भ्रूण पर यांत्रिक तनाव के कारण कम भ्रूण अस्तित्व में परिणाम देती है। इस प्रोटोकॉल में, हमने माइक्रोइंजेक्शन की आवश्यकता के बिना सीआरआईएसपीआर-कैस 9 जीनोम संपादन के साथ संयोजन के रूप में काम करने के लिए बड़े डीएनए मरम्मत टेम्पलेट्स देने के लिए एक अनुकूलित विधि विकसित की। यह प्रोटोकॉल 2-सेल भ्रूण को संशोधित करने के लिए इलेक्ट्रोपोरेशन द्वारा CRISPR-Cas9 राइबोन्यूक्लियोप्रोटीन (RNP) की डिलीवरी के साथ एकल-फंसे डीएनए दाता टेम्पलेट्स के AAV-मध्यस्थता डीएनए वितरण को जोड़ती है। इस उपन्यास रणनीति का उपयोग करते हुए, हमने सफलतापूर्वक लक्षित नॉक-इन चूहे मॉडल का उत्पादन किया है, जिसमें 42% और 90% के बीच क्षमता के साथ आकार में 1.2 से 3.0 केबी तक डीएनए अनुक्रमों का सम्मिलन होता है।
Introduction
सीआरआईएसपीआर-आधारित जीनोम संपादन उपकरणों के विकास ने नए और अधिक परिष्कृत आनुवंशिक रूप से इंजीनियर चूहे मॉडल को कुशलतापूर्वक उत्पन्न करने की हमारी क्षमता को तेज कर दिया है। सिंगल-गाइड आरएनए, कैस 9 न्यूक्लियस के साथ, राइबोन्यूक्लियोप्रोटीन (आरएनपी) कॉम्प्लेक्स बनाने के लिए संयुक्त होता है जो जीनोम के भीतर ब्याज के डीएनए अनुक्रमों को लक्षित करता है और परिणामस्वरूप डबल-स्ट्रैंडेड डीएनए टूट जाता है। क्योंकि सेलुलर डीएनए मरम्मत तंत्र त्रुटि-प्रवण हैं, मरम्मत प्रक्रिया के दौरान सम्मिलन और विलोपन (INDELs) पेश किए जाते हैं जो लक्ष्य जीन के कार्य को बाधित कर सकते हैं। जब जीनोम संपादन अभिकर्मकों के साथ एक वांछित इंजीनियर डीएनए अनुक्रम (मरम्मत टेम्पलेट) का सह-वितरण होता है, तो डबल-फंसे डीएनए ब्रेक वाले क्षेत्र में मरम्मत टेम्पलेट का सम्मिलन होमोलॉजी-निर्देशित मरम्मत (एचडीआर) नामक प्रक्रिया के माध्यम से होता है। यह लक्षित डीएनए सम्मिलन/प्रतिस्थापन (नॉक-इन) के साथ पशु मॉडल बनाने के लिए एक प्रभावी रणनीति है। एक सीमा यह है कि नॉक-इन अनुक्रम अक्सर आकार में बड़े होते हैं, जो जीन संपादन दक्षता को कम करने के लिए दिखाए गए हैं, इस प्रकार वांछित मॉडल को और अधिक कठिन बनाते हैं1. नॉक-इन क्षमता बढ़ाने के लिए रणनीतियों में डबल-फंसे डीएनए (डीएसडीएनए) और एकल-फंसे डीएनए (एसएसडीएनए) मरम्मत टेम्पलेट्स और डीएनए मरम्मत टेम्पलेट्स 2,3,4 के रासायनिक संशोधन दोनों के रैखिककरण शामिल हैं। इसके अलावा, एचडीआर उत्तेजक यौगिकों के साथ प्रोन्यूक्लियर माइक्रोइंजेक्शन, माइक्रोइंजेक्शन के साथ संयोजन के रूप में विद्युत दालों के आवेदन, और 2-सेल भ्रूण में समयबद्ध माइक्रोइंजेक्शन सभी का प्रयास 5,6,7 किया गया है। इनमें से कुछ दृष्टिकोणों की सफलता के बावजूद, 1.0 केबी से बड़े डीएनए अनुक्रमों का समावेश तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण बना हुआ है।
इलेक्ट्रोपोरेशन, जो सुसंस्कृत सेल लाइनों में अभिकर्मकों को पेश करने के लिए एक सामान्य तरीका है, भ्रूण में सीआरआईएसपीआर-कैस 9 घटकों को वितरित करने के लिए माइक्रोइंजेक्शन का विकल्प प्रदान करता है। भ्रूण electroporation, पहले चूहे भ्रूण8 में प्रदर्शित, के बाद से सफलतापूर्वक चूहों 9,10,11,12,13, सूअरों14,15, और अन्य पशु मॉडल जीवों 16,17,18 में एक वितरण विधि के रूप में इस्तेमाल किया गया है . भ्रूण, CRISPR-Cas9 अभिकर्मकों युक्त माध्यम में निलंबित, एक क्युवेट में या दो इलेक्ट्रोड के बीच एक ग्लास स्लाइड पर रखा जाता है और विद्युत धाराओं के प्रत्यक्ष दालों के अधीन होता है। यह ज़ोना पेलुसीडा और भ्रूण प्लाज्मा झिल्ली में क्षणिक उद्घाटन बनाता है जिसके माध्यम से CRISPR-Cas9 घटक भ्रूण में प्रवेश करते हैं। आमतौर पर, मध्य-स्तरीय विद्युत “पोरिंग” दालों का उपयोग अस्थायी उद्घाटन बनाने के लिए किया जाता है, जिसके बाद निचले स्तर के विद्युत “ट्रांसफर पल्स” होते हैं जो नकारात्मक चार्ज किए गए जीनोम संपादन घटकों के आंदोलन की सुविधा प्रदान करते हैं। भ्रूण electroporation कुशल है, एक उच्च throughput है, और प्रदर्शन करने के लिए आसान है. हालांकि, जबकि भ्रूण electroporation छोटे (<200 बीपी) ssDNA मरम्मत टेम्पलेट्स की शुरूआत के लिए अत्यधिक सफल होने के लिए दिखाया गया है, वहाँ बड़ा (>1.0 केबी) मरम्मत टेम्पलेट्स13,19 के सफल electroporation की कुछ रिपोर्ट कर रहे हैं. यह आकार प्रतिबंध बड़े सम्मिलन की आवश्यकता वाले नॉक-इन पशु मॉडल उत्पन्न करने के लिए भ्रूण इलेक्ट्रोपोरेशन की एक प्रमुख सीमा का प्रतिनिधित्व करता है।
जीन थेरेपी के संदर्भ में, एडेनो-जुड़े वायरस (एएवी) लंबे समय से वाहनों के रूप में उपयोग किए जाते हैं ताकि वे विभाजित और गैर-विभाजित कोशिकाओं दोनों की विवो संक्रामकता में अपने कुशल होने के कारण आनुवंशिक सामग्री वितरित कर सकें, रोगजनकता की कमी और दुर्लभ जीनोमिक एकीकरण20,21। हाल ही में, अधिक अध्ययनों ने डीएनए मरम्मत टेम्पलेट्स और सीआरआईएसपीआर अभिकर्मकों 22,23,24को पेश करने के लिए सीआरआईएसपीआर-कैस 9 तकनीक के साथ एएवी को जोड़ा है। यह दृष्टिकोण माइक्रोइंजेक्शन तकनीकों की आवश्यकता के बिना बड़े डीएनए मरम्मत टेम्पलेट्स के वितरण की अनुमति देता है।
एचडीआर मार्ग सेल चक्र25,26 के देर से एस और जी 2 चरणों में अधिक सक्रिय है। इन विट्रो में किए गए अध्ययनों में, नॉक-इन दक्षता में महत्वपूर्ण वृद्धि CRISPR-Cas9 RNPs और डीएनए मरम्मत टेम्पलेट्स को G2-सिंक्रनाइज़ कोशिकाओं में या Cas9-Geminin संलयन प्रोटीन2 का उपयोग करके देर से S और G2 चरणों में Cas9 प्रोटीन की उपस्थिति के प्रतिबंध द्वारा प्राप्त की गई थी। इसके अलावा, एक प्रमुख युग्मनज जीनोम सक्रियण (ZGA) घटना है जो 2-कोशिका चरण भ्रूण के विस्तारित G2 चरण के दौरान होती है, और यह एक खुले क्रोमैटिन अवस्था से जुड़ी होती है। यह अनुमान लगाया जाता है कि यह CRISPR-Cas9 RNPs प्रदान करता है और जीनोमिक डीएनए तक अधिक पहुंच के साथ टेम्पलेट्स की मरम्मत करता है।
हमारा लक्ष्य भ्रूण के विकास के 2-सेल चरण में CRISPR-Cas9 RNPs को पेश करने के लिए भ्रूण इलेक्ट्रोपोरेशन के साथ AAV दृष्टिकोण को जोड़कर इन सभी टिप्पणियों पर निर्माण करना था। यह रणनीति एएवी की बड़ी डीएनए मरम्मत टेम्पलेट वितरण क्षमता, इलेक्ट्रोपोरेशन की तकनीकी आसानी और भ्रूण के विकास के दौरान जीनोमिक पहुंच के लिए अधिक इष्टतम 2-सेल समय बिंदु का लाभ उठाती है ताकि डीएनए सम्मिलन के लक्षित आनुवंशिक इंजीनियरिंग के लिए एक कुशल विधि बनाई जा सके। जैसा कि इस प्रोटोकॉल में हाइलाइट किया गया है, हमारी अनुकूलित विधि लक्षित नॉक-इन चूहे मॉडल के उत्पादन के लिए अनुमति देती है जो माइक्रोइंजेक्शन तकनीकों की आवश्यकता के बिना आकार में 1.2 से 3.0 केबी तक डीएनए अनुक्रमों के सम्मिलन को ले जाती है।
Protocol
Representative Results
Discussion
सीआरआईएसपीआर-सीएएस जीनोम संपादन प्रणाली ने विभिन्न प्रकार की पशु प्रजातियों में सीधे और जटिल, अनुकूलित आनुवंशिक संशोधनों के कुशल उत्पादन की अनुमति देकर आनुवंशिक इंजीनियरिंग के क्षेत्र में क्रांति …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक वीडियोग्राफी और वीडियो संपादन में सहायता के लिए नोलन डेविस को धन्यवाद देना चाहते हैं।
Materials
| Leads with alligator clips for electrodes | NepaGene | C117 | |
| Mineral oil | MilliporeSigma | M5310 | |
| NepaGene21 Super Electroporator | NepaGene | NEPA21 | |
| Platinum plate electrodes on slide glass | NepaGene | CUY501P1-1.5 | |
| PURedit Cas9 Protein | MilliporeSigma | PECAS9 | |
| sgRNA (chemically-modified) | Synthego | N/A | |
| ssAAV1 or ssAAV6 packaged DNA repair template | Vectorbuilder | N/A |
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