Dreidimensionales akustisches Montagegerät für die Massenfertigung von Zellsphäroiden

Summary

Zellsphäroide gelten als ein potenzielles Modell im Bereich biologischer Anwendungen. Dieser Artikel beschreibt Protokolle zur skalierbaren Erzeugung von Zellsphäroiden unter Verwendung eines 3D-Akustik-Assemblierungsgeräts, das eine effiziente Methode für die robuste und schnelle Herstellung einheitlicher Zellsphäroide bietet.

Abstract

Zellsphäroide sind vielversprechende dreidimensionale (3D) Modelle, die in vielen biologischen Bereichen breite Anwendung gefunden haben. Dieses Protokoll stellt eine Methode zur Herstellung von qualitativ hochwertigen Zellsphäroiden mit hohem Durchsatz unter Verwendung einer akustischen 3D-Montagevorrichtung durch manövrierfähige Verfahren dar. Die akustische Montagevorrichtung besteht aus drei Blei-Zirkonat-Titanat-Wandlern (PZT), die jeweils in der X/Y/Z-Ebene einer quadratischen Polymethylmethacrylat-Kammer (PMMA) angeordnet sind. Diese Konfiguration ermöglicht die Erzeugung eines 3D-Punkt-Array-Musters von schwebenden akustischen Knoten (LANs), wenn drei Signale angelegt werden. Dadurch können Zellen in der Gelatinemethacryloyl-Lösung (GelMA) zu den LANs getrieben werden und gleichmäßige Zellaggregate in drei Dimensionen bilden. Die GelMA-Lösung wird dann UV-photogehärtet und vernetzt, um als Gerüst zu dienen, das das Wachstum von Zellaggregaten unterstützt. Abschließend werden Massen an gereiften Sphäroiden gewonnen und durch anschließendes Auflösen der GelMA-Gerüste unter milden Bedingungen gewonnen. Das vorgeschlagene neue akustische 3D-Zellassemblierungsgerät wird die Scale-up-Herstellung von Zellsphäroiden und sogar Organoiden ermöglichen und ein großes Technologiepotenzial im biologischen Bereich bieten.

Introduction

3D-In-vitro-Kulturmodelle, die im Vergleich zu herkömmlichen 2D-Kulturmodellen mehr In-vivo-ähnliche strukturelle und morphologische Eigenschaften aufweisen, wurden als vielversprechende Systeme in verschiedenen biomedizinischen Anwendungen wie Tissue Engineering, Krankheitsmodellierung und Wirkstoffscreening anerkannt ^1,2,3. Als eine Art von 3D-Kulturmodell beziehen sich Zellsphäroide typischerweise auf die Zellaggregation und erzeugen 3D-sphäroidale Strukturen, die durch verbesserte Zell-Zell- und Zell-Matrix-Interaktionen gekennzeichnet sind ^4,5,6. Daher ist die Herstellung von Zellsphäroiden zu einem leistungsfähigen Werkzeug geworden, um verschiedene biologische Studien zu ermöglichen.

Verschiedene Techniken, einschließlich des Aufhängens^{von Tropfen 7}, nicht klebender Platten⁸ oder Mikrotitervorrichtungen⁹, wurden entwickelt, um Sphäroide zu erhalten. Prinzipiell erleichtern diese Methoden die Zellassemblierung, indem sie physikalische Kräfte wie die Gravitationskraft nutzen und gleichzeitig die Wechselwirkungen zwischen Zellen und Substrat minimieren. Sie sind jedoch oft arbeitsintensiv, haben eine geringe Produktivität und stellen eine Herausforderung für die Steuerung der Sphäroidgröße^{dar 10,11}. Wichtig ist, dass die Herstellung von Sphäroiden mit der gewünschten Größe und Gleichmäßigkeit in ausreichender Menge von größter Bedeutung ist, um spezifische biologische Anwendungen zu erfüllen. Im Gegensatz zu den oben genannten Methoden haben akustische Wellen als eine Art von externer Krafttechnik 12,13,14 das Potenzial für die Massenherstellung von Zellsphäroiden mit hoher Qualität und hohem Durchsatz gezeigt, basierend auf dem Prinzip der Verbesserung der Zellaggregation durch äußere Kräfte 15,16,17,18. Im Gegensatz zu elektromagnetischen oder magnetischen Kräften sind akustische Zellmanipulationstechniken nicht-invasiv und markierungsfrei, was eine Sphäroidbildung mit ausgezeichneter Biokompatibilität ermöglicht^19,20.

Üblicherweise wurden auf akustischen Wellen der stehenden Oberfläche (SAWs) und auf akustischen Massenwellen (BAWs) basierende Geräte entwickelt, um Sphäroide zu erzeugen, wobei die akustischen Knoten (ANs) verwendet werden, die durch entsprechende stehende akustische Felder^{21, 22, 23} erzeugt werden. Insbesondere akustische Montagevorrichtungen, die auf BAWs basieren, mit den Vorteilen einer bequemen Herstellung, einer einfachen Bedienung und einer ausgezeichneten Skalierbarkeit, haben für die Herstellung von Zellsphäroiden^24,25 Aufmerksamkeit erregt. Wir haben kürzlich ein einfaches BAWs-basiertes akustisches Montagegerät entwickelt, das in der Lage ist, Sphäroide mit hohem Durchsatz^{zu erzeugen 26}. Die vorgeschlagene Vorrichtung besteht aus einer quadratischen Polymethylmethacrylat (PMMA)-Kammer mit drei Blei-Zirkonat-Titanat-Wandlern (PZT), die jeweils in der X/Y/Z-Ebene angeordnet sind. Diese Anordnung ermöglicht die Erstellung eines 3D-Punkt-Array-Musters von schwebenden akustischen Knoten (LANs) zur Ansteuerung der Zellmontage. Im Vergleich zu zuvor berichteten BAWs- oder SAWs-basierten Vorrichtungen, die nur ein 1D- oder 2D-Array von ANs^{27, 28, 29} erzeugen können, ermöglicht die vorliegende Vorrichtung ein 3D-Punkt-Array von LANs für eine schnelle Zellaggregatbildung innerhalb der Gelatinemethacryloyl (GelMA)-Lösung. Anschließend reiften die Zellaggregate nach drei Tagen Kultivierung zu Sphäroiden mit hoher Viabilität innerhalb der photogehärteten GelMA-Gerüste. Schließlich konnte eine große Anzahl von Sphäroiden mit einheitlicher Größe aus den GelMA-Gerüsten für nachgelagerte Anwendungen leicht gewonnen werden.

Protocol

1. Herstellung der 3D-Akustik-Montagevorrichtung Beginnen Sie mit der Vorbereitung von vier 1 mm dicken PMMA-Platten durch Laserschneiden30 und kleben Sie sie dann zu einer quadratischen Kammer mit einer Innenbreite von 21 mm und einer Höhe von 10 mm zusammen. Befestigen Sie als Nächstes eine weitere 1 mm dicke PMMA-Folie am Boden der Kammer, die als Halterung für die Biotinte dient. Drei Blei-Zirkonat-Titanat-Wandler (PZT) (jeweils 20 mm lang, 10 …

Representative Results

In dieser Studie wurde ein akustisches 3D-Montagegerät für die Massenfertigung von Zellsphäroiden entwickelt. Die akustische Vorrichtung bestand aus einer quadratischen Kammer mit zwei PZT-Wandlern, die an der X- und Y-Ebene an der Außenfläche der Kammer angebracht waren, und einem PZT-Wandler am Boden der Kammer (Abbildung 1A, B). Drei Ausgangskanäle von zwei Funktionsgeneratoren wurden mit drei Leistungsverstärkern verbunden, um drei unabhängig voneinander sinusfö…

Discussion

Die effiziente und stabile Herstellung von Zellsphäroiden mit hohem Durchsatz unter Verwendung von Technologien wie dem 3D-Akustik-Montagegerät ist vielversprechend für die Weiterentwicklung der Biomedizintechnik und des Wirkstoffscreenings ^1,2,3. Dieser Ansatz vereinfacht die Massenproduktion von Zellsphäroiden durch einfache Verfahren.

Es gibt jedoch kritische Faktoren, die bei der Verwendung di…

Materials

0.22-μm filter	Merck	SLGSM33SS	Used for GelMA solution sterilization
35 mm-cell culture dish	Corning	430165	Used for culturing cells
Confocal microscope	Nikon	A1RHD25	Fluorescent cell observation
DiO dye	Beyotime	C1038	Dye used to stain cells
DMEM	Gibco	12430054	Cell culture media
FBS	Gibco	10099141C	Cell culture media supplement
Function generator	Rigol	DG5352	For RF signal generation
GelMA	Regenovo	none	Used to prepare bioink
GelMA lysis buffer	EFL	EFL-GM-LS-001	Used to dissolve GelMA scaffolds
Inverted microscope	Nikon	Ti-U	Cell observation
LAP	Sigma-Aldrich	900889	Used as photoinitiator
Live-Dead kit	Beyotime	C2015M	Cell vability analysis
PBS	Gibco	10010002	Used as buffer
Penicillin-streptomycin	Gibco	15070063	Prevent cell culture contamination
Power amplifer	Minicircuit	LCY-22+	Increase the voltage amplitude of the RF signal
PZT transducers	Yantai Xingzhiwen Trading Co.,Ltd.	PZT-41	Functional units for acoustic assembly device
T25 cell culture flask	Corning	430639	Used for culturing cells
Trypan blue	Gibco	15250061	Cell counting
Trypsin-EDTA	Gibco	25200056	Cell dissociation enzyme